Name: Slice Voorbereiding, organotypische Tissue kweken en Luciferase Opname van Klok gen-activiteit in de suprachiasmatische kern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-15T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Leer de dissectie en organotypische kweek van de suprachiasmatische kern uit transgene muizen. Deze methode maakt continue registratie van klokgenexpressie mogelijk met hoge temporele resolutie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de Zweedse Medical Research Council (K2009-75SX-21.028-01-3, K2008-61X-20700-01-3); FONCICYT 000000000091984, de fundamenten van Jeansson, Söderström Königska sjukhemmet, Märtha Lundqvist en Sigurd och Elsa Goljes Minne, en de Zweedse Society of Medicine SLS-95151. Professor Gene D. Block, UCLA, wordt bedankt voor waardevolle commentaar op het manuscript. Wij danken dr. Michael Andäng en dr. Helena Johard voor de HCN-blokker, en Prof Abdel El-Manira voor het aanbieden van video-microscoop. Ethische overwegingen: Alle experimenten op dieren zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door Karolinska Institutet en &quot;Stockholm Norra Djurförsöksetiska Nämnd&quot; set. Alle dierproeven worden uitgevoerd met de bedoeling om eventuele stress of ongemak voor het dier te minimaliseren.

<ol><li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suprachiasmatic+nucleus%3A+cell+autonomy+and+network+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).</li>
<li>Green, D. J., Gillette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythm+of+firing+rate+recorded+from+single+cells+in+the+rat+suprachiasmatic+brain+slice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythm of firing rate recorded from single cells in the rat suprachiasmatic brain slice.</a> Brain Res. 245, 198-200 (1982).</li>
<li>Shibata, S., Oomura, Y., Kita, H., Hattori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythmic+changes+of+neuronal+activity+in+the+suprachiasmatic+nucleus+of+the+rat+hypothalamic+slice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythmic changes of neuronal activity in the suprachiasmatic nucleus of the rat hypothalamic slice.</a> Brain Res. 247, 154-158 (1982).</li>
<li>Groos, G., Hendriks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+in+electrical+discharge+of+rat+suprachiasmatic+neurones+recorded+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms in electrical discharge of rat suprachiasmatic neurones recorded in vitro.</a> Neurosci Lett. 34, 283-288 (1982).</li>
<li>Klein, D., Moore, R., Reppert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+suprachiasmatic+nucleus+and+the+circadian+timing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Suprachiasmatic+nucleus--The+mind%27s+clock%22%5BJournal%5D)">The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system.</a> Suprachiasmatic nucleus--The mind's clock. , Oxford University Press. New York. 13-15 (1991).</li>
<li>Pol, A. N. V. anden <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypothalamic+suprachiasmatic+nucleus+of+rat%3A+intrinsic+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy.</a> J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Yamazaki, S., Numano, R., Abe, M., Hida, A., Takahashi, R., Ueda, M., Block, G. D., Sakaki, Y., Menaker, M., Tei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+central+and+peripheral+circadian+oscillators+in+transgenic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats.</a> Science. 288, 682-685 (2000).</li>
<li>Geusz, M. E., Fletcher, C., Block, G. D., Straume, M., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kay, S. A., RN, D. ay <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+monitoring+of+circadian+rhythms+in+c-fos+gene+expression+from+suprachiasmatic+nucleus+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Long-term monitoring of circadian rhythms in c-fos gene expression from suprachiasmatic nucleus cultures.</a> Curr Biol. 7, 758-766 (1997).</li>
<li>Ko, C. H., Buhr, E. D., Siepka, S. M., Hong, H. K., Oh, W. J., Yoo, O. J., Menaker, M., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERIOD2%3A%3ALUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5339-5346 (2004).</li>
<li>Yamazaki, S., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+luminescence+reporting+of+circadian+gene+expression+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals.</a> Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).</li>
<li>Yoshikawa, T., Yamazaki, S., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+preparation+time+on+phase+of+cultured+tissues+reveal+complexity+of+circadian+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Effects of preparation time on phase of cultured tissues reveal complexity of circadian organization.</a> J Biol Rhythms. 20, 500-512 (2005).</li>
<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , Academic Press. (1997).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , 4 Edition, Academic Press. San Diego. (1998).</li>
<li>O'Neill, J. S., Maywood, E. S., Chesham, J. E., Takahashi, J. S., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP-dependent+signaling+as+a+core+component+of+the+mammalian+circadian+pacemaker%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker.</a> Science. 320, 949-953 (2008).</li>
<li>Hughes, A. T., Guilding, C., Lennox, L., Samuels, R. E., McMahon, D. G., Piggins, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+altered+period1+expression+in+the+suprachiasmatic+nuclei+of+Vipr2-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Live imaging of altered period1 expression in the suprachiasmatic nuclei of Vipr2-/- mice.</a> J Neurochem. 106, 1646-1657 (2008).</li>
<li>Zhang, D. Q., Zhou, T., Ruan, G. X., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythm+of+Period1+clock+gene+expression+in+NOS+amacrine+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythm of Period1 clock gene expression in NOS amacrine cells of the mouse retina.</a> Brain Res. 1050, 101-109 (2005).</li>
<li>Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+clock+nucleus%3A+a+multiphasic+oscillator+network+regulated+by+light%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The biological clock nucleus: a multiphasic oscillator network regulated by light.</a> J Neurosci. 23, 8070-8076 (2003).</li>
<li>LeSauter, J., Yan, L., Vishnubhotla, B., Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G., Silver, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+half-life+GFP+mouse+model+for+analysis+of+suprachiasmatic+nucleus+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A short half-life GFP mouse model for analysis of suprachiasmatic nucleus organization.</a> Brain Res. 964, 279-287 (2003).</li>
<li>Nakamura, W., Yamazaki, S., Takasu, N. N., Mishima, K., Block, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+response+of+Period+1+expression+within+the+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential response of Period 1 expression within the suprachiasmatic nucleus.</a> J Neurosci. 25, 5481-5487 (2005).</li>
<li>Davidson, A. J., Yamazaki, S., Arble, D. M., Menaker, M., Block, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+of+central+and+peripheral+circadian+oscillators+in+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Resetting of central and peripheral circadian oscillators in aged rats.</a> Neurobiol Aging. 29, 471-477 (2008).</li>
<li>Croning, M. D., Haddad, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+brain+slice+chamber+designs+for+investigations+of+oxygen+deprivation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro.</a> J Neurosci Methods. 81, 103-111 (1998).</li>
<li>Burgoon, P. W., Boulant, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-sensitive+properties+of+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Temperature-sensitive properties of rat suprachiasmatic nucleus neurons.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 281, 706-715 (2001).</li>
<li>Nishide, S. Y., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+pacemaker+in+the+cultured+suprachiasmatic+nucleus+from+pup+mice+is+highly+sensitive+to+external+perturbation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation.</a> Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).</li>
<li>Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+the+ovarian+circadian+clock+is+regulated+by+gonadotropins%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins.</a> Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).</li>
<li>Kohn, R. A., Dunlap, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+the+buffering+capacity+of+bicarbonate+in+the+rumen+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Calculation of the buffering capacity of bicarbonate in the rumen and in vitro.</a> J Anim Sci. 76, 1702-1709 (1998).</li>
<li>Wilsbacher, L. D., Yamazaki, S., Herzog, E. D., Song, E. J., Radcliffe, L. A., Abe, M., Block, G., Spitznagel, E., Menaker, M., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photic+and+circadian+expression+of+luciferase+in+mPeriod1-luc+transgenic+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 489-494 (2002).</li>
<li>Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence%2Fluminescence+circadian+imaging+of+complex+tissues+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution.</a> J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).</li>
</ol>

Voor-en nadelen met een luciferase reporter-technologie In tegenstelling tot ex vivo methoden, zoals RT-PCR, in situ hybridisatie en Western blot dat weefselmonster nodig zijn op veel verschillende tijdstippen (het geven van een lage tijdsresolutie van normaal 2-4 uur afhankelijk van de sampling frequentie) om dagelijkse studie variaties in genen en proteïnen uitdrukkingen, de luciferase reporter technologie maakt het mogelijk een hoge resolutie (1-10 min) studies van de circadiane oscillaties gedurende vele dagen in dezelfde voorbereiding. Zo is het aantal gebruikte dieren tot een minimum beperkt en de gedetailleerde studies van de effecten op de fase en periode van het ritme haalbaar zijn, die normaal niet mogelijk is met behulp van conventionele steekproeven met een lage tijdsresolutie. Hoewel de relatieve amplitude metingen van het ritme zijn mogelijk, moet worden benadrukt dat de verslaggever technologie niet kwantitatief is en kan daarom niet worden gebruikt om de hoeveelheden van getranscribeerd genen of vertaald eiwitten te meten. Het weefsel opnamen kunnen worden gestart en geanalyseerd onmiddellijk na het kweken, een groot voordeel voor het direct het bestuderen van moleculaire effecten van in vivo stress, in vivo licht-geïnduceerde fase-verschuivingen etc. De organotypische SCN cultuur staat lange-termijn (weken) farmacologische manipulatie van volwassen hersenen weefsel met een intacte volwassen synaptische netwerk en de luciferase reporter technologie maakt het mogelijk een stabiele opnames voor vele weken. Zo werkt het weefsel niet te neonatale of vroege postnatale worden om gezond te culturen te krijgen, en in tegenstelling tot de acute slice chronische farmacologische behandelingen kunnen worden uitgevoerd. In tegenstelling tot plasmide-reporter transfecties in celkweken, die geen leiden tot opname van DNA in het genoom, de transgene luciferase-diermodellen (evenals Lenti-virus transfecties) zijn gunstig als epigenetische veranderingen dienen te worden bestudeerd. Het moet in deze context ook worden vermeld dat luminescentie beeldvorming tegenwoordig mogelijk is met zeer gevoelige CCD-camera&#39;s 11, zodat opnames ook in single SCN neuronen (~ 60-10 micrometer) en andere celtypen, gebruikt door grote laboratoria het bestuderen van circadiane ritmes. Tot slot, een aantal circadiane onderzoekers vaak gebruik van de controle van moleculaire expressie met behulp van andere verslaggevers, zoals de Green Fluorescent Protein, om de klok gen / eiwit schommelingen 16-19 bestuderen. Aspecten van de slice dikte De hier aanbevolen dikte van de SCN slice (200-300 micrometer) kan worden verlaagd of verhoogd indien gewenst. Hoewel het weefsel vlakker op het membraan na een paar dagen in cultuur, is het niet aan te raden om 500 um dikte van de oorspronkelijk gesneden plakje overschrijden, om de levensvatbaarheid van het weefsel 7 te behouden. Een stuk dunner dan 100 micrometer is van mechanische en praktische redenen moeilijk te hanteren. Omdat de SCN weefsel is heterogeen de dikte van het schijfje kan de fase van het luciferase uitgangssignaal van invloed zijn, aangezien verschillende regio&#39;s binnen de SCN (bijvoorbeeld de &quot;kern&quot; versus de &quot;shell&quot;, en dorsale versus ventrale regio&#39;s) oscilleren met de verschillende fasen 20 en differentieel opnieuw te synchroniseren na faseverschuivingen 21. De dikte van de slice beïnvloedt ook de baseline van foton tellen sinds meer weefsel geeft een groter aantal fotonen. De amplitude van moleculaire trillingen kan op deze wijze indirect worden beïnvloed door de grootte van de explantatie. Om deze redenen, moeten controle en behandelde culturen steeds van dezelfde grootte, dikte en waarin de regio van SCN in om te oscilleren in dezelfde fase en met dezelfde amplitude. De twee eenzijdige kernen, aan de andere kant, oscilleren in fase met elkaar en met gelijke amplitudes zolang de vibratome cut is horizontaal en niet schuin (die op zijn beurt afhankelijk is van dat de scheiding tussen cut cerebellum en de twee hersenhelften is loodrecht naar de tafel oppervlak). Een onderzoeker die uitvoert SCN kweken zou kunnen ervaren dat SCN culturen niet in fase oscilleren met elkaar. Oefenen en standaardisatie van het snijden techniek, dat wil zeggen de plakjes gesneden worden altijd op dezelfde rostro-caudale niveau van de SCN, zal de uitkomst. Kritische stappen <ol><li> Zuurstoftoevoer is van cruciaal belang. Omdat de hersenen vergt veel van de zuurstof 22, het snijden procedure dient te worden snel (Hoe dichter 3.1-3.10 is ~ 5-6 minuten hoe beter het is in stand te houden het weefsel gezond). </li><li> De SCN is gevoelig voor temperatuurschommelingen en medium uit te wisselen. De SCN is temperatuur gevoelig en grote temperatuurverschillen kunnen fase verschuiving van de pacemaker en de oorzaak experimentele artefacten 23. Als het medium of oplossingen worden uitgewisseld of toegevoegd tijdens een lopend experiment, bijvoorbeeld bij de toepassing van een geneesmiddel na een paar dagen in de cultuur, het medium of solution moet worden voorverwarmd tot 36-37 ° C (dezelfde temperatuur als in de kamer) voordat toevoeging. In farmacologische experimenten die medium uitwisselingen te betrekken, is het belangrijk om altijd te werken met pre-conditioning celcultuurmedium. Toevoeging / wash-out met verse, kan onvoorwaardelijk medium mogelijk fase verschuiving van de moleculaire SCN ritme 24 evenals andere celtype culturen 25. </li><li> Medium samenstelling. Het is belangrijk om de cultuur van het weefsel in de juiste pH en osmolaliteit. De lucht-buffering medium bevat een grote hoeveelheid HEPES, waardoor een optimale buffercapaciteit in het bereik van pH 6.8-8.2 heeft en is ook geschikt voor het bufferen van de pH veranderingen die kunnen optreden als gevolg van de cel ademhaling. HEPES, aan de andere kant, is meer gevoelig voor temperatuur veranderingen in vergelijking met natriumbicarbonaat, die is opgenomen in kleine hoeveelheden in het kweekmedium. Natriumbicarbonaat heeft een grotere buffercapaciteit in de lagere pH (5,1-7,1) tussen 26 en, zo nodig in een CO 2 atmosfeer. Echter, hoeveelheden natriumbicarbonaat steeg in de lucht-buffering medium (DMEM 2902) verhoogt de osmolaliteit aanzienlijk en kan niet worden toegevoegd zonder tegelijkertijd het verdunnen van het medium, die op zijn beurt resulteert in de verkeerde samenstelling van aminozuren, vitaminen en ionen. Advies voor de voorbereiding van het medium: <ol><li> Nauwkeurig en zorgvuldig bij het mengen van het medium. </li><li> Gebruik alleen verse of vers ontdooide stockoplossingen. </li><li> In het geval van zeer hoge osmolaliteit is het niet de moeite waard te verdunnen. Meer dan 5-6% verdunde medium zal zeer waarschijnlijk niet werken. Gebruik D-glucose om te osmolariteit te verhogen als deze te laag is. </li></ol></li><li> Fase verschuivingen als gevolg van de voorbereidingstijd De tijd van slice voorbereiding is van cruciaal belang. Geen of minimale effecten op fase wordt verkregen als de slice procedure wordt uitgevoerd tussen ZT 06 tot 12 december. Alle slice dissecties moet worden uitgevoerd in dezelfde fase van de dagelijkse of circadiaanse cyclus, ter fout te wijten aan variatie fase tussen de voorbereidingen te minimaliseren. </li></ol> Eventuele wijzigingen <ol><li> Voor acute SCN elektrofysiologie, het snijden moet worden uitgevoerd met een Ringer (Artificial Cerebro Spinal Fluid; ACSF) buffer, verzadigd met zuurstof (95% O 2, 5% CO 2) voor het snijden begint. Verder, zuurstof moet continu worden toegevoegd aan de buffer gedurende de gehele procedure snijden, zoals de elektrische en synaptische activiteit is direct afhankelijk van de zuurstoftoevoer 22. </li><li> Horizontale en sagittale sneden kan ook goed worden voorbereid en gekweekt van de SCN. De auteurs hebben ervaring met luciferase-opnamen in horizontale plakken, die circadiane oscillaties grond van onze ervaring te geven met een lagere amplitude in vergelijking met de coronale snede. </li><li> De SCN is ongeveer 1 mm lang rostro-caudaal en het snijden van techniek hier beschreven is gericht op het verwerven van een SCN gedeelte in de centrale regio. Er kan echter meer dan een SCN sectie worden verkregen bij muizen en ratten de hersenen, waardoor het onderzoek van de circadiane gen / eiwit-expressie bij meer rostraal versus caudale niveaus van de SCN kern. </li><li> Slice culturen van jongere dieren, postnatale pups of zelfs embryo&#39;s, kunnen ook worden bereid. Houdt u er rekening mee dat de hersenen en de schedel bij zeer jonge pups zijn erg zacht en gevoelig. Daarnaast is de oogzenuw is dun en niet volledig ontwikkeld. Wees voorzichtig bij het ontleden van de hersenen van de pups, zodat de SCN regio is niet beschadigd. Zo kan micro rongeur tools niet worden gebruikt om de schedel van de muis pups te openen, omdat ze te groot zijn. Fijne schaar zijn voldoende om de zachte weefsels gesneden bij jonge pups. </li><li> De dekking van glas gebaseerde cultuur techniek die hier beschreven kan ook worden gebruikt om de afbeelding luminescentie met behulp van een CCD / EM-CCD-camera, ook in single SCN neuronen. </li><li> Andere centrale zenuwstelsel regio&#39;s en perifere weefsels organen van transgene PER2:: LUC dieren kunnen gemakkelijk worden verkregen, gekweekt en geanalyseerd in termen van moleculaire trillingen, zoals de PER2:: LUC expressie blijft ook oscilleren vele dagen in een aantal andere weefsels en celtypes 10. De meeste van deze perifere weefsels, bijvoorbeeld de lever, niet nodig een membraan om te overleven, maar in plaats daarvan gekweekt direct badend in het medium 11. Houdt u er rekening mee dat faseverschuiving als gevolg van snijden, het kweken en medium-uitwisseling niet kunnen dezelfde principes volgen als bij SCN. </li></ol> Betekenis In de transgene muizen en ratten stammen (mPER2:: LUC; mPer1-luc 8, 10, 27) luciferase enzymactiviteit weerspiegelt eiwit of genexpressie ritmes en kan worden beoordeeld door bioluminescentie opname. De luciferase gegenereerde bioluminescentie geeft een zwak signaal, maar de achtergrond luminescentie dicht bij nul, het maken van deze methode voordelig. Bovendien, omdat het luciferase molecuul is onstabiel en snel afgebroken er is geen phototoxiciteit, die kunnen verschijnen tijdens de lange termijn prikkelende verlichting 28. Tezamen bieden deze eigenschappen kan langdurige experimenten maken van de luciferase reporter-technologie zeer voordelig in het circadiane onderzoek.

<table><tbody><tr><td>B27 supplement 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes</td><td>Menzel-Glaser</td><td>40#1</td><td>&amp;#8776; 40 mm</td></tr><tr><td>Kweekmembranen</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG50</td><td>0.4 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>DMEM lage glucose z/o fenolrood</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2902</td><td>Poeder voor 1L</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1003 055</td><td>&amp;#8776; 55 mm</td></tr><tr><td>Filtratieset</td><td>Corning</td><td>431097</td><td>Poriegrootte 0.22 &amp;#x03BC;m Polyethersulfon</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Allgaier Instrumente</td><td>0203-7-PS</td><td>Dumant #7</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Invitrogen</td><td>14065-049</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>NaOCH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 7.5%</td><td>Invitrogen</td><td>25080-060</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Luciferine</td><td>Promega Corp.</td><td>E1602</td><td>Keverluciferine, kaliumzout</td></tr><tr><td>Micro-rongeur</td><td>Allgaier Instrumente</td><td>332-097-140</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep 10.000 U/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>&amp;#8776; 35 mm</td></tr><tr><td>PMT</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>H9319-11MOD</td><td></td></tr><tr><td>Wegwerpscalpels</td><td>Paragon</td><td>P503</td><td>Maat 11</td></tr><tr><td>Vacuümfilter</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-5</td><td></td></tr><tr><td>Vacuümvet</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>50 g</td></tr><tr><td>Vibratoom</td><td>Campden Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

slice voorbereiding, organotypische tissue kweken en luciferase opname van klok gen-activiteit in de suprachiasmatische kern

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

Een centrale circadiane (~ 24 uur) klok coördineren van de dagelijkse ritmes in de fysiologie en gedrag bevindt zich in de suprachiasmatische kern (SCN) in de voorste hypothalamus. De klok wordt direct gesynchroniseerd door het licht via het netvlies en de oogzenuw. Circadiane trillingen worden gegenereerd door interactie negatieve feedback loops van een aantal zogenaamde &quot;clock genen&quot; en hun eiwitproducten, inclusief de periode (Per) genen. De kloksnelheid is ook afhankelijk van membraan depolarisatie, calcium en cAMP 1. De SCN geeft dagelijkse schommelingen in de klok genexpressie, metabolische activiteit en spontane elektrische activiteit. Opvallend is dat deze endogene cyclische activiteit blijft in volwassen weefsel plakjes van de SCN 2-4. Op deze manier kan de biologische klok goed worden bestudeerd in vitro, waardoor moleculaire, elektrofysiologische en metabolische onderzoeken van de pacemaker functie. De SCN is een kleine, goed gedefinieerde bilaterale structuur ligt direct boven het optische chiasma 5. In de rat bevat ~ 8.000 neuronen in elke kern en heeft afmetingen van ongeveer 947 micrometer (lengte, rostrocaudal as) x 424 micrometer (breedte) x 390 micrometer (hoogte) 6. Te ontleden van de SCN is het noodzakelijk om de hersenen slice gesneden op de specifieke niveau van de hersenen waar de SCN kan worden geïdentificeerd. Hier beschrijven we de te ontleden en te snijden werkwijze van de SCN, die vergelijkbaar is voor de muis en rat hersenen. Verder laten we zien hoe de cultuur van de opengesneden weefsel organotypically op een membraan 7, een techniek ontwikkeld voor de SCN weefselkweek door Yamazaki et al.. 8. Tot slot laten we zien hoe transgene weefsel gebruikt kan worden voor het meten van de expressie van genen klok / eiwitten met behulp van dynamische luciferase reporter-technologie, een methode die oorspronkelijk voor de circadiane metingen worden gebruikt door Geusz et al.. Negen. Wij hier gebruik van SCN weefsels van de transgene knock-in periode2:: luciferase muizen geproduceerd door Yoo et al. 10.. De muizen bevatten een fusie-eiwit van de periode (PER) 2 en de vuurvlieg enzym luciferase. Wanneer PER2 wordt vertaald in de aanwezigheid van het substraat voor luciferase, dat wil zeggen luciferine, kan de PER2 uitdrukking te worden gecontroleerd zoals bioluminescentie als luciferase katalyseert de oxidatie van luciferine. Het aantal geëmitteerde fotonen correleert positief bij aan de hoeveelheid geproduceerde PER2 eiwit, en de bioluminescentie ritmes overeen met de PER2 eiwit ritme in vivo 10. Op deze manier de cyclische variatie in PER2 expressie kan doorlopend worden gecontroleerd real time gedurende vele dagen. Het protocol volgen we voor het kweken van weefsel en real-time bioluminescentie opname werd grondig beschreven door Yamazaki en Takahashi 11.

De procedure van de voorbereiding plakjes met de volwassen muis hypothalamus suprachiasmatische nucleus (SCN), en een snelle manier om de cultuur van de SCN weefsel in organotypische cultuur staat, worden gerapporteerd. Verder is de meting van oscillerende klok gen-eiwitexpressie het gebruik van dynamische luciferase reporter-technologie beschreven.

Slice Voorbereiding, organotypische Tissue kweken en Luciferase Opname van Klok gen-activiteit in de suprachiasmatische kern

Een centrale circadiane (~24 uur) klok die de dagelijkse ritmes in fysiologie en gedrag coördineert, bevindt zich in de nucleus suprachiasmaticus (SCN) gelegen in de ...

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe de suprachiasmatische nucleus van transgene muizen gesneden en gedisseceerd kan worden, en hoe het schematische weefsel gekweekt kan worden om de expressie van klokgenen of -eiwitten te registreren als luciferase-geïnduceerde luminescentie. Dit wordt bereikt door eerst de hersenen te disseceren uit een transgene muis die een luciferase-reporter voor een klokgen of -eiwit bevat, en vervolgens een hersencoupe te maken die de suprachiasmatische nucleus bevat. De tweede stap van de procedure is het disseceren van de kleine bilaterale schematische nuclei uit de coupe.De derde stap van de procedure is het kweken van de schematische nucleus explan op een membraan in een Petrischaal die kweekmedium en luciferine bevat. De laatste stap van de procedure is het vastleggen van de luciferase-activiteit door bioluminescentie te meten met fotomultiplicatortubes in een lichtdichte, verwarmde kamer. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de circadiane oscillatie van het klokgen of -eiwit laten zien.Mijn naam is Sergey IV en ik werk in de Gabrielle Re Club. Mijn naam is SoFi Johansson en ik werk in het team van Gabriella. Mijn naam is Gabriel Quist.Ik ben een hoofdonderzoeker bij de afdeling Neurowetenschappen, en mijn naam is Ka LaShon, ik ben een PhD-student aan het Swedish Medical Neuroscience Center en ik werk samen met Gabriella. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals Western Blot, RT-PCR en in situ hybridisatie is dat de expressie van een klokgen of eiwit gedurende vele dagen continu gevolgd kan worden in hetzelfde weefsel met een zeer hoge resolutie van ongeveer één minuut, wat een gedetailleerde analyse van de periode, amplitude en fase van het circadiane ritme mogelijk maakt. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor het snijden en dissekeren van de SCN moeilijk aan te leren zijn.De SEN is zeer klein en kan moeilijk te identificeren zijn. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Sge Velia, een postdoctoral fellow in mijn onderzoeksteam. Nadat de benodigde oplossingen zijn gemaakt, bereidt u de Petri-schalen die in het experiment worden gebruikt met behulp van een spuit van 5 mL die is gevuld met vacuümvet voor autoclaven.Breng het vet aan op het bovenste ringoppervlak van een Petri-schaal van 35 millimeter. Bereid een aparte Petri-schaal voor voor elke plak cultuur. Vul een Falcon-buis met 10 milliliters luchtgebufferd kweekmedium.Hiermee wordt voldoende medium gemaakt voor acht culturen. Voeg 10 µL vers ontdooide luciferian toe. De luciferian is lichtgevoelig, dus bescherm het luciferian-medium tegen licht door de Falcon-buis te bewaren in een donkere bewarmingskamer van 37 °C.Sterilise vervolgens alle instrumenten, dekglasjes en overig materiaal dat bij de procedure wordt gebruikt. Bespuit alle niet-steriele apparatuur met 70% ethanol. Stel de instrumenten en de gevette petrischalen ten minste 30 minuten lang bloot aan UV-licht in een steriele laminaire flowkast.Een andere voorbereidende stap is het instellen van de vibratoom en het bevestigen van een steriel scheermesje. De apparatuur is nu gereed voor de chirurgische procedure. Verwijder na het anesthetiseren en onthoofden van een muis de ogen uit de kop met een schaar.Dit voorkomt training of stimulatie van de oogzenuwen, wat helpt om schade aan de nucleus suprachiasmaticus of SCN te vermijden. Gebruik een fijn schaartje om de laatste halswervel te verwijderen en om de huid te verwijderen. Maak twee sneden in het schedelbeen langs beide zijden van de schedel, zodat er een verwijderbaar klepje ontstaat.Open de schedel met een micro Rongeur. Gebruik de Rongeur met een opwaartse beweging en druk nooit met het instrument op de hersenen. Om beschadiging aan de SCN in de schedelbasis te voorkomen, dient al het bot te worden verwijderd totdat de bulbi olfactorii zichtbaar zijn.Gebruik een fijne microsdissectieschaar om zorgvuldig door de oogzenuw tussen de hemisferen en de bulbi olfactorii te knippen. Plaats een Petrischaal gevuld met 50 tot 100 milliliters koud HBSS onder de kop van de muis. Draai de kop om zodat het intacte brein eruit kan vallen.Snijd andere hersenzenuwen door waar nodig, aan de tegenovergestelde zijde van de oogzenuw. Zodra deze zijn losgemaakt, valt de hersenen in de Petrischaal, waardoor de hersenen snel afkoelen. Gebruik een lepel om de ijskoude hersenen over te brengen naar een steriel snijvlak, zoals een omgedraaide glazen Petrischaaldeksel.Verwijder het cerebellum door met steriele schemessen een loodrechte snede te maken tussen de hemisferen en het cerebellum. Breng secondelijm aan op het droge platform van de viome. Plaats een scherpe, gebogen pincet in het rostrale deel van de hersenen en til de hersenen op terwijl u deze met de pincet vasthoudt.Droog de HBSS zorgvuldig af met steriel filterpapier. Fixeer de hemisferen met de rostrale punt naar boven en het ventrale oppervlak het dichtst bij het snijmes op de lijm van het platform. Plaats het platform in de vibratohouder en vul deze onmiddellijk met koude HBSS.Als de loodrechte snede correct is uitgevoerd, moeten de hemisferen rechtop staan. Het doel is om coronale coupes te maken die het middengebied van de bilaterale SCN bevatten, met behulp van de maximale snelheid van de vibratoom. Begin met het afsnijden van secties van 500 tot 800 micrometer dik uit de hemisferen totdat de commissuur is bereikt. Kijken.Naarmate het chiasma opticum breder wordt, in combinatie met het reduceren van de secties tot een dikte van 100 micrometer, wordt het snijden in caudale richting voortgezet, waarbij de horizontale handmatige beweging van het mes wordt vertraagd totdat de twee SCN-kernen zichtbaar worden. Gebruik indien nodig een vergrootglas om de kernen te visualiseren wanneer het niveau van de SCN is bereikt. Snijd een SCN-sectie van 250 micrometer.Vul een deksel van een middelgrote Petrischaal met koud HBSS met behulp van een zacht penseel. Til de SCN-hersensectie op en breng deze over naar de Petrischaal. Plaats de Petrischaal onder een dissectiemicroscoop.De volgende stap is het uitsnijden van de SCN uit de slice. Gebruik de microscoop om te verifiëren dat de bilaterale SCN aan minstens één zijde van de sectie duidelijk zichtbaar is. Gebruik een paar steriele scalpels om een vierkant stuk weefsel uit te snijden van ongeveer 1,5 millimeter per zijde dat beide SCNs bevat.Snijd zo dicht mogelijk bij de SCN. Zonder SCN-weefsel te verwijderen, moet een klein stukje van de oogzenuw aan het preparaat worden gehecht, maar er mogen geen andere kernen worden meegenomen. Snijd het weefsel dat de bilaterale SCN bevat doormidden om twee unilaterale SCN's te verkrijgen.Eén unilaterale SCN kan als controle in een steriele zuurkast worden gebruikt. Voeg bij uitgeschakeld licht 1200 µL Lucifer-medium toe aan een Petrischaal met een diameter van 35 mm en plaats vervolgens een cultuurmembraan op het vloeistofoppervlak. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder het membraan zitten.De implantaten zijn klein en moeilijk op te pakken. Gebruik daarom een pipet van 1000 microliter met tip om het SEN-explantaat in de tip op te zuigen en druk het vervolgens uit op het cultuurmembraan. Verwijder het overtollige HBSS voor de luciferase-meting en plaats slechts één SEN per petrischaal.Sluit de vet-petrischaal af met een dekglas van 40 millimeter diameter. Voeg meer vet toe als de afsluiting niet luchtdicht is. Plaats de petrischalen in een aluma cycle-apparaat in een lichtdichte warmtekamer van 36 tot 37 graden Celsius.Om te beginnen met het kweken, noteert u de kweekschalen en de detectoren met fotomultiplicatierbuis die in de lum-cycluskamer zijn gemonteerd. Plaats de kweekschalen ongeveer één tot twee centimeter onder de fotomultiplicatorbuizen. De fotomultiplicatorbuizen detecteren en versterken de luciferase die door luminescentie wordt geïnduceerd.De Luma Cycle-softwaretool wordt gebruikt voor data-acquisitie. Fotonentellingen worden geïntegreerd over intervallen van één tot 10 minuten om een hoge resolutie van de genproteïne-expressie te verkrijgen. De circadiane expressie van het genproteïne wordt geanalyseerd om de fase, periode en amplitude van het ritme te bepalen.Deze figuur toont bioluminescentie-opnames van gezonde en niet-gezonde SCN-weefselculturen. Deze muizen werden gehouden in een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker voorafgaand aan de verwijdering van hun SCN-weefsel. De zwarte lijn toont het circadiane ritme van de bioluminescentie-opnames van de expressie van period two luciferase.In een gezonde SEN-slice oscilleert het eiwit met de circadiane variatie, waarbij de maximale expressie van het eiwit plaatsvindt op zeitgeber-tijd 12 tot 13, of bij het begin van de duisternis. De fase van het genritme is dus afhankelijk van het licht-donkerschema waarin het dier vóór de opoffering werd gehouden. De blauwe lijn toont bioluminescentie-registraties van een SE en cultuur die uitdroogden nadat de cultuurschaal op dag vier werd geopend, aangegeven door de pijl, en niet correct was verzegeld.De rode lijn toont bioluminescentie-opnamen van een niet-gezonde SCN-cultuur. Deze figuur maakt gebruik van de SCN-cultuur in een farmacologisch experiment. De figuur toont een trace van een cultuur die werd behandeld met een HCN-ionkanaalblokker op het tijdstip dat wordt aangegeven door de eerste pijl.Gedurende twee tot drie dagen reduceerde de ionkanaalblokker de circadiane oscillatie en stopte deze vervolgens bij de tweede pijl. Het geneesmiddel werd weggewassen en vervangen door geconditioneerd controlemedium. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om snel maar voorzichtig te werken om het SEN-weefsel levensvatbaar te houden.Het is ook belangrijk om uw vibraat-sectie te standaardiseren, zodat telkens hetzelfde niveau van de SEN wordt bereikt. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u de SEN-kweek en het SCN-orgaan, doorgaans op een membraan, moet snijden en dissekeren en hoe u de expressie van klokgenen of -eiwitten monitort als door luminescentie geïnduceerde luciferase in de kweken.

slice-preparation-organotypic-tissue-culturing-luciferase-recording

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit is een protocol voor te bereiden en een neocorticale slice voorbereiding handhaven organotypische cultuur voor het maken van elektrische opnames van piramidale neuronen.

Hele Cell Opnemen van een organotypische Slice Voorbereiding van de neocortex

Circadiane klokken functioneren binnen de individuele cellen, dat wil zeggen, ze zijn cel-autonoom. We beschrijven werkwijzen voor het genereren van cel-autonome klok modellen niet-invasieve, luciferase-gebaseerde real-time bioluminescentie technologie. Reporter cellen handelbaar, functionele modelsystemen voor het bestuderen van circadiane biologie.

Monitoring Cell-autonome circadiane klok Rhythms of genexpressie met behulp van Luciferase Bioluminescentie Reporters

Source: Sabado, V., et al., Nagoshi, E. Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture. J. Vis. Exp. (2018). This video demonstrates the procedure to embed the Drosophila brain in a fibrin matrix, followed by time-lapse fluorescence imaging of circadian clock neurons to analyze rhythmic activity synchronized with light/dark cycles.

Embedding Drosophila Brain in a Matrix for Time-Lapse Imaging of the Circadian Clock Neurons

Procedures worden beschreven om gelijktijdige opnamen van membraanpotentiaal of stroom en veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie uit te voeren. Suprachiasmatische nucleus-neuronen worden gevuld met de calciumindicator bis-fura-2 met behulp van een patch clamp-elektrode in de whole cell patch clamp-configuratie.

Gelijktijdige elektrofysiologisch registratie en calciumbeeldvorming van neuronen in de suprachiasmatische kern

De circadiane klok regelt ongeveer een derde van de Arabidopsis transcriptoom, maar het percentage van genen die te gebruiken bij tijdwaarneming blijft onbekend. Hier visualiseren we een methode om circadiane fenotypes snel te beoordelen in welke mutant lijn van Arabidopsis met behulp van lichtgevende beeldvorming van een circadiaan reporter tijdelijk tot expressie gebracht in protoplasten.

Snelle analyse van het circadiaans fenotypes in Arabidopsis protoplasten getransfecteerd met een Lichtgevende klok Reporter

Hier beschrijven we instellingen om parallel de circadiane bioluminescentie en de secretoire activiteit van humane eilandcellen en primaire myotubes te monitoren. Hiervoor gebruikten we lentivirale genoverdracht van een luciferase kernklok reporter, gevolgd door in vitro synchronisatie en het verzamelen van uitstroommedium door continue celperfusie.

Parallel Meting van de circadiane klok genexpressie en hormoon in Human primaire celculturen

Deze nieuw ontwikkelde fluorescentie gebaseerde technologie kan op lange termijn van de transcriptie van de circadiane klok genen in de suprachiasmatic kern (SCN) vrij bewegen muizen in real time en met een hoge temporele resolutie.

In Vivo Controle van de circadiane klok genexpressie in de muis Suprachiasmatic kern met behulp van fluorescentie verslaggevers

Het doel van dit protocol is om de ex vivo Drosophila larvale hersenen cultuur, geoptimaliseerd voor het controleren van de circadiane moleculaire ritmes met langdurige fluorescentie time-lapse beeldvorming. De toepassing van deze methode op farmacologische testen wordt ook besproken.

Eencellige resolutie fluorescentie leven beeldvorming van Drosophila circadiane klokken in larvale hersenen cultuur

Neurale stam/voorlopercellen vertonen verschillende expressie dynamiek van Inkeping signalering componenten die leiden tot verschillende uitkomsten van cellulaire gebeurtenissen. Een dergelijke dynamische uitdrukking kan worden onthuld door real-time monitoring, niet door statische analyse, met behulp van een zeer gevoelig bioluminescentie beeldvormings systeem dat visualisatie van snelle veranderingen in genexpressies mogelijk maakt.

Real-time bioluminescentie beeldvorming van Inkeping signalering dynamiek tijdens Murine neurogenese

Circadiane ritmes, die in de meeste organismen voorkomen, reguleren de tijdelijke organisatie van biologische processen. 3D-organoïden zijn onlangs naar voren gekomen als een fysiologisch relevant in vitromodel . Dit protocol beschrijft het gebruik van bioluminescente reporters om circadiane ritmes in organoïden te observeren, waardoor in vitro onderzoek naar circadiane ritmes in meercellige systemen mogelijk wordt.

Circadiane oscillaties monitoren met een bioluminescentiereporter in organoïden

Dit rapport beschrijft een methode met een R-script in de open-source software RStudio om grootschalige datasets te analyseren die zijn verkregen uit tijdreeksexperimenten.

Een gebruiksvriendelijke en krachtige R-analyse van grootschalige datasets

Leer de dissectie en organotypische kweek van de suprachiasmatische kern uit transgene muizen. Deze methode maakt continue registratie van klokgenexpressie mogelijk met hoge temporele resolutie.

Slice Voorbereiding, organotypische Tissue kweken en Luciferase Opname van Klok gen-activiteit in de suprachiasmatische kern

Meer video's verkennen