Postsynaptische Recordings op Afferente Dendrieten Contact opnemen met Cochlear binnenste haarcellen: Monitoring multivesiculaire release op een lint Synapse
10 februari 2011
Whole-cell patch-clamp opnamen van auditieve zenuw vezel dendrieten in de binnenste haarcel lint synaps in het zoogdier slakkenhuis.
Het algemene doel van deze procedure is om de postsynaptische activiteit op afferent synapsen van binnenste haarcellen te registreren. Dit wordt bereikt door eerst het sensorische epitheel van een cochlea te ontbloten die onlangs is verwijderd van een onthoofde rat. De tweede stap van de procedure is om de uitgesneden apicale, een aangepaste dekglas te activeren en deze over te brengen naar de opnamekamer.
De derde stap van de procedure is om een afferent baton te lokaliseren en toegang te krijgen met een opname-elektrode. De laatste stap van de procedure is om een strakke afdichting op en vervolgens de afferent vezelmembraan te doorbreken om de gehele cel configuratie van de patch clamp-techniek te vestigen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die postsynaptische voorkomen of potentiëlen van een enkele lintsynapse tonen door middel van gehele cel patch clamp elektrofysiologie.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat het disseceren en voorbereiden van cochleair weefsel moeilijk te leren is en de kleine afferent vezels moeilijk te herkennen en te benaderen zijn. Voordat u begint met de dissectie, bereidt u een aangepast dekglas voor dat de voorbereiding tijdens opnamen op zijn plaats zal houden. Gebruik een glasdeksel van acht tot 12 millimeter cirkelvormig en breng een druppel half uitgeharde syl guard aan naar de rand van het dekglas.
Plaats het dikke uiteinde van een fijn insectenpin op het dekglas. Houd de insectenpin stevig tegen het glas. Verwarm met behulp van een pincet de sill guard tegen een verwarmde spoel om te zetten.
Bereid 10 tot 20 micro-elektroden voor zoals beschreven in de bijbehorende tekst. Na het polijsten met een microsmeed, moet de micro-elektrode een buitendiameter van ongeveer één micron hebben. De uiteindelijke dikte van de pijpwand is ongeveer een derde van een micrometer na anesthesie en onthoofding van een drie weken oude rat.
Begin de dissectie door de huid te verwijderen door het hoofd te dissecteren en de hersenen te verwijderen om het slaapbeen te onthullen. Verwijder beide slaapbeenderen. Plaats elk slaapbeen in een schone dissectieschaal met standaard extracellulaire oplossing. De volgende stap is om het bot te verwijderen dat het slaapbeen omhult om het cochleair kanaal bloot te leggen.
Houd het slaapbeen stevig aan de basis vast met een pincet. Identificeer het ronde en ovale venster en het cochleair kanaal. Orienteer het cochleair kanaal zodat het ovale venster en de spiraalvormige zijde van het cochleair kanaal naar boven gericht zijn.
Verwijder overtollig bot rond het cochleair kanaal. Gebruik een tweede paar fijne pincetten om het bot direct van het cochleair kanaal te schaven, beginnend met het gebied dat doorschijnender is dan de rest van het bot. Hier is het bot dunner en gemakkelijker te verwijderen.
Ga door met het verwijderen van het bot rond de apicale coil. Gebruik microscoop-dissectiescharen om door de modis onder de apicale winding te snijden. Koppel vervolgens de apicale winding los van de lagere windingen van het cochleair kanaal.
Zorg ervoor dat u de apicale winding beschermt. Deze mag niet getrokken of uitgerekt worden. Verwijder ten slotte de apicale winding uit het cochleair kanaal zonder het weefsel te veel te scheuren.
Gebruik fijne pincetten om de rest van het bot te verwijderen. De volgende stap is om de STR van oculis en het tial-membraan te verwijderen. Verwijder voorzichtig de STR van oculis, de glanzende strook weefsel die zich buiten het haarcelgebied bevindt.
Zorg ervoor dat u de sensorische haarcellen niet verwijdert, die gemakkelijk los kunnen raken samen met de STR van oculis. Gebruik vervolgens fijne pincetten om het tial-membraan los te maken. De glanzende, halfdoorschijnende membraan die zich boven de sensorische haarcellen bevindt, verwijdert nu overtollig weefsel en bot en vlakt de voorbereiding af met de pincetten.
Dit is noodzakelijk zodat het weefsel gelijkmatig onder een pin kan worden geplaatst. De dissectie is nu voltooid. Plaats de voorbereiding onder de pin op het voorbereide dekglas en zorg ervoor dat de pin uit de buurt van de haarcellen wordt geplaatst zodra de dissectie is voltooid.
Gebruik pincetten om de voorbereiding over te brengen naar de opnamekamer terwijl er een druppel extracellulaire vloeistof op het dekglas blijft zitten dat het cochleair weefsel vasthoudt. Begin onmiddellijk met doorstroming met extracellulaire oplossing. Gebruik om de overleving van de voorbereiding te verbeteren de 10 x objectief van de microscoop of het 40 x waterimmersie-DIC-objectief. Om de voorbereiding te lokaliseren, oriënteer de voorbereiding zodat de opname-elektroden de binnenste haarcellen onder een rechte hoek tot hun laterale wanden kunnen naderen.
Als de zichtbaarheid van het basale gebied van de binnenste haarcellen beperkt is omdat de voorbereiding over de rand is gedraaid, gebruik dan een opname-elektrode om de buitenrand van de voorbereiding naar beneden te duwen tegen het glasdeksel. Zorg ervoor dat u de binnenste haarcellen zelf niet indrukt. In deze voorbereiding houdt de bovenste elektrode de buitenrand van de voorbereiding naar beneden, de onderste elektrode markeert waar de afferent batons zich bevinden.
Voor referentie toont de NC 70 Nuv Con camera het vergrote Forex-beeld op de monitor om te beoordelen of het weefsel in het binnenste haarcelgebied gezond is. Zoek de haarbundels als referentiepunt en focus verder om de kernen te vinden. Focus verder naar de basis van de binnenste haarcellen met zijn afferente uiteinden en ga terug totdat u het niveau van de kernen op de monitor bereikt.
Loceer nu de afferente batons rond de basis van de binnenste haarcellen. Batons zijn sferische of ellipsvormige, ongeveer één micron in diameter en zijn licht van kleur met een glanzend uiterlijk. Je zult ze vinden door omhoog en omlaag te focussen.
De volgende stap is om een pad vrij te maken naar de afferente vezels met behulp van een opname-elektrode met een tip van één micron gevul
Overzicht
Dit artikel beschrijft een procedure voor whole-cell patch-clamp registraties van dendrieten van auditieve zenuwvezels bij de ribbonsynaps van de binnenste haarcel in het zoogdiercoclea. De methode is erop gericht om postsynaptische activiteit bij afferente synapsen vast te leggen, wat inzicht biedt in de auditieve verwerking.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Auditieve biologie
Achtergrond
- De whole-cell patch-clamptechniek is cruciaal voor het bestuderen van synaptische transmissie.
- De ribbon-synaps van de binnenste haarcel speelt een sleutelrol bij de verwerking van auditieve signalen.
- Het bereiken van kleine afferente vezels is technisch uitdagend.
- Een visuele demonstratie helpt bij het begrijpen van de dissectie en preparatie van cochleair weefsel.
Doel van de studie
- Om postsynaptische activiteit bij afferente synapsen van binnenste haarcellen te registreren.
- Om de whole-cell patch-clamptechniek in een mammaliaans model te demonstreren.
- Om het aanleren van de dissectie en preparatie van cochleair weefsel te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Dissectie van cochleair weefsel van een gedecapiteerde rat.
- Voorbereiding van een gemodificeerd dekglas voor weefselstabilisatie.
- Gebruik van micro-elektroden voor toegang tot afferente vezels.
- Whole-cell patch-clamp registraties om synaptische activiteit te meten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle tot standbrenging van de whole-cell configuratie bij de synaps van de binnenste haarcel.
- Registratie van postsynaptische potentialen van individuele lintsynapsen.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode bij het vastleggen van synaptische activiteit.
- Visuele hulpmiddelen verbeterden het begrip van het dissectieproces.
Conclusies
- De methode biedt een betrouwbare aanpak voor het bestuderen van auditieve synapsen.
- De verkregen inzichten kunnen bijdragen aan het begrijpen van mechanismen van auditieve verwerking.
- Visuele demonstraties zijn essentieel voor het beheersen van de techniek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Deze methode maakt directe elektrofysiologische bevraging van individuele lintsynapsen mogelijk, wat een platform met een hoge resolutie biedt voor het bestuderen van de dynamiek van neurotransmitterafgifte in sensorische systemen. Door postsynaptische stromingen vast te leggen van individuele afferente vezels die contact maken met binnenste haarcellen, ondersteunt deze aanpak de mechanistische risicoreductie van synaptische transmissiemodellen die relevant zijn voor de validatie van targets in de neurowetenschappen. De techniek biedt voorspellende waarde voor het beoordelen van de effecten van verbindingen op de presynaptische afgiftekans en de postsynaptische receptorfunctie in een natuurlijk, ziekterellevant systeem.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om multivesiculaire afgifte-mechanismen bij een gedefinieerde synaps te onderzoeken om de presynaptische bijdragen aan neurotransmissie te verduidelijken.
- Operationele waarde: Biedt kwantitatieve readouts van de amplitude en frequentie van de excitatoire postsynaptische stroom voor het beoordelen van de presynaptische functie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, kwantificeerbare metingen van postsynaptische stromen die geschikt zijn voor assayontwikkeling gericht op de cyclus van synaptische blaasjes.
- Operationele waarde: Ondersteunt de reproduceerbare detectie van opgewekte en spontane excitatoire postsynaptische stromen in verschillende preparaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt de presynaptische calciuminstroom aan de activering van de postsynaptische stroom, waardoor de risico's van calciumkanaalmodulatoren op de synaptische transmissie kunnen worden bepaald.
- Operationele waarde: Faciliteert longitudinale monitoring van synaptische stabiliteit en depressie tijdens herhaalde stimulatie, wat bijdraagt aan de validatie van preklinische modellen.
Integratie van Pipeline en Workflow
De methode past binnen vroege discovery-workflows door directe meting van de synaptische transmissie bij een gedefinieerde lintsynaps mogelijk te maken, wat inzicht geeft in target engagement en studies naar het werkingsmechanisme voorafgaand aan de lead-optimalisatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van presynaptische releasemechanismen en postsynaptische receptorresponsen met behulp van whole-cell patch-clamp registraties.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantificeerbare read-outs van excitatoire postsynaptische stromen om de effecten van verbindingen op de afgifte van synaptische blaasjes te beoordelen.
- Analytics: Biedt amplitude- en frequentieverdelingen van excitatoire postsynaptische stromen als kwantitatieve metrieken voor het vergelijken van experimentele condities.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt depolarisatie van binnenste haarcellen met activatie van afferente vezels, waarbij een natuurlijk sensorisch transductiepad wordt gemodelleerd dat relevant is voor targets bij gehoorverlies.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerd elektrofysiologisch platform voor iteratieve testen van synaptische modulatoren over meerdere experimentele rondes.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Maakt mechanistische risicoreductie van synaptische transmissiemodellen mogelijk door directe observatie van multivesiculaire release-gebeurtenissen.
- Operationele waarde: Levert opnames met een hoge temporele resolutie met minimale variabiliteit in de preparatie dankzij gestandaardiseerde methoden voor micro-elektrode- en weefselstabilisatie.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door onzekerheid bij de validatie van presynaptische targets te verminderen via directe functionele read-outs.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen die gericht zijn op synaptische blaasjeseiwitten of calciumkanalen, op basis van gevalideerde postsynaptische responsen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in cochleaire dissectie, de preparatie van microelektroden en whole-cell patch-clamp elektrofysiologie.
- Afhankelijk van hoogwaardige microelektroden met tipdiameters inHet sub-micron bereik en gestabiliseerde weefselpreparaties met behulp van gemodificeerde dekglasplaatjes.
- Vereist gestandaardiseerde extracellulaire en intracellulaire oplossingen om consistente registraties van postsynaptische stromen te waarborgen.
- Aanpassingen voor verschillende soorten of leeftijdsmodellen kunnen de toegankelijkheid van afferente vezels en de synaptische eigenschappen beïnvloeden.
- Beperkt door de technische uitdaging om de langetermijnstabiliteit van de whole-cell configuratie van de afferente vezel te behouden tijdens langdurige registraties.
