Name: Dissectie van de Mens glasvocht Elementen voor proteoomanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-23T17:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Leer dissectietechnieken voor het menselijk glasvlichaam om substructuren te isoleren voor proteoomanalyse. Deze methode helpt onderzoekers de anatomie en functie van oculaire weefsels te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De financiering werd verstrekt door Fight for Sight. Weefsels werden verkregen van de Iowa Lions Eye Bank.

1. Anterieure Segment Dissection. <ol><li> Het hoornvlies wordt verwijderd door eerst een incisie aan de limbus in de voorste kamer met behulp van een 15 ° mes (figuur 1). En een blad van de gebogen hoornvlies-sclerale schaar wordt geplaatst in de voorste kamer. Omtrek sneden worden gemaakt in het hoornvlies, maar juist voor de limbus. </li><li> 0.12 Colibri tang en schaar Westcott worden gebruikt om de iris omtrek anterior aan de ciliaire lichaam te snijden. </li><li> De lens kern wordt verwijderd met 0,12 Colibri pincet of een 15 ° mes (supersharp) en de cortex en de capsule met een pincet. </li></ol> 2. Glasvocht Core aspiratie. <ol><li> Een 23-gauge naald op een 5-cc spuit is ingevoegd in het midden van glasvocht (figuur 1). </li><li> Ongeveer 1 ml of meer van glasvocht kern is voorzichtig opgezogen. </li><li> Het monster wordt dan geplaatst in een microfugebuis en vervolgens in vloeibare stikstof. </li></ol> 3. Anterieure Hyaloid Dissection. <ol><li> De voorste hyaloid wordt gezien als een semi-transparante ring door het aanpassen van het invallende licht van een zwanenhals microscoop licht. Vorige aspiratie van het glasvocht kern scheidt de voorste hyaloid van andere structuren snellere identificatie. </li><li> Het blad van de elastische weefsel wordt zorgvuldig getrokken uit de buurt van de ciliaire lichaam met Colibri of dressing pincet en snijden met Vannas schaar. Deze manoeuvre wordt herhaald. </li><li> Het monster wordt dan geplaatst in een microfugebuis en vervolgens in vloeibare stikstof. </li></ol> 4. Glasvocht Base Dissection. <ol><li> Met behulp van 0,12 tang voor het oog cup te stabiliseren, worden Westcott schaar gebruikt om "bloem" in het oog door het maken van vier gelijke afstand van elkaar om stress te verlichten snijdt van de ciliaire lichaam naar de oogzenuw hoofd. </li><li> De pars plicata van het corpus ciliare (figuur 2) wordt verwijderd uit elk van de kwadranten met behulp van Westcott schaar. </li><li> Het glasvocht basis wordt dan begrepen aan beide kanten van de ora serrata met een tang over de pars plana en het netvlies (zie figuur 2). </li><li> Continue tractie op het glasvocht basis is aangebracht met de tang. Sequentiële snijden met een schaar Westcott extracten een semi-transparant weefsel met een 'parelketting' verschijning als het is weggesneden. </li><li> Het monster wordt dan geplaatst in een microfugebuis en vervolgens in vloeibare stikstof. </li></ol> 5. Glasvocht Cortex verwijderen. <ol><li> De pars plana is uitgesneden uit elk van de kwadranten met Westcott schaar door het snijden van de folder van ongeveer 3 mm achter de ora serrata (figuur 2). </li><li> Tussen het weefsel folders, het glasvocht cortex wordt gevisualiseerd als een semi-transparante film. </li><li> De elastische film is ofwel begrepen met 0,12 tang of gehouden door het volgen van een Weck-Cel chirurgische spons. Het glasvocht cortex wordt dan uit de buurt van het netvlies getrokken en weggesneden met Westcott schaar (Figuur 1). </li><li> Het monster wordt geplaatst in een microfugebuis en vervolgens in vloeibare stikstof. Alle monsters worden bewaard bij -80 ° C tot gebruikt voor experimenten. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Weefsel monsters kan worden verwerkt door een verscheidenheid van methoden voor specifieke experimenten. In ons geval werden monsters voor eiwit analyse door SDS-PAGE (figuur 3). <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Dwarsdoorsnede van het menselijk oog beeltenis van verschillende substructuren van het glasachtig lichaam. De meest voorste glasvocht is een dun laagje collagene genaamd de voorste hyaloid. Het glasvocht kern bestaat uit de gehele centrale regio van het glasachtig lichaam. Dit gedeelte van het glasvocht wordt meer water in tegenstelling tot het glasvocht basis, die is viskeus genoeg om te worden gegrepen door de forceps en is stevig aan de onderliggende corpus ciliare en netvlies. Omvat het glasvocht kern is een zeer dunne collagene shell genoemd het glasvocht cortex. <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Glasvocht basis anatomie. Het glasvocht basis is een semi-transparante onderbouw van het glasachtig lichaam ligt langs de ora serrata (witte pijlen), dat is de scheidslijn het scheiden van de corpus ciliare en het netvlies. De voorste rand van het glasvocht voet strekt zich uit over de pars plana (witte lijn) van het corpus ciliare. De achterste rand van het glasvocht base verlengt 2-3-mm achter de ora serrata (wit streepje). Aan accijnzen het glasvocht basis, worden tang gebruikt om het weefsel te pakken en weg te trekken van de onderliggende corpus ciliare en netvlies. Eenmaal verheven, Westcott schaar worden gebruikt voor het snijden langs de basis. <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Eendimensionale SDS-PAGE van glasvocht Elements. Total eiwit concentraties voor de voorste hyaloid, glasvocht basis, vitreous kern, en het glasvocht cortex waren 11.24, 20.1, 16.61, 14.24 mg / ml, respectievelijk. Gelelektroforese werd uitgevoerd bij 200 kV gedurende 45 minuten, gekleurd met Flamingo (Bio-Rad), en gevisualiseerd met behulp van een VersaDoc Imaging systeem (Bio-Rad). De profielen voor de verschillende weefsels vertonen verschillende gelijkaardige bands, waarin zij hetzij geconserveerd of cross-verontreinigende eiwitten, alsmede de unieke bands (asterisk), wat aangeeft differentieel gelokaliseerde eiwitten.

<ol><li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog Retin Eye Res. 19, 323-344 (2000).</li>
<li>Sebag, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pharmacologic+vitreolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Am+Ophthalmol+Soc%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pharmacologic vitreolysis.</a> Trans Am Ophthalmol Soc. 103, 473-494 (2005).</li>
<li>Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+inflammatory+immune+mediators+in+vitreoretinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases.</a> PLoS One. 4, e8158-e8158 (2009).</li>
<li>Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P., Feener, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+vitreous+proteome+in+diabetes+without+diabetic+retinopathy+and+diabetes+with+proliferative+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy.</a> J Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).</li>
<li>Izuta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+SOD+and+VEGF+are+increased+in+vitreous+bodies+from+proliferative+diabetic+retinopathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients.</a> Mol Vis. 15, 2663-2672 (2009).</li>
<li>Azimzadeh, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+proteome+analysis+using+gel-free+and+gel-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics.</a> J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).</li>
</ol>

Het glasachtig lichaam is een semi-transparante gel die de moleculaire samenstelling is slecht begrepen, vooral op het niveau van de onderbouw: het glasvocht basis, kern, cortex, en de voorste hyaloid. Het glasvocht kern bevat collageen II, V, IX, en XI, samen met chondroïtine sulfaat proteoglycanen, heparansulfaat proteoglycanen, en hyaluronan. 1,2 Eiwit biomarkers in het glasvocht kern zijn in verband gebracht met ziekten zoals diabetische retinopathie. 3-5 Hoe Deze eiwitten zijn differentieel tot expressie in elk van de substructuren, en in veel gevallen de specifieke eiwit identiteiten, zijn niet bekend. Deze gegevens kunnen inzicht geven in de herkomst van de eiwitten die in verband met specifieke vitreoretinale ziekten en helpen doelwit toekomstige therapieën. Hoewel de optimale post mortem interval voor weefsel dissectie is nog niet vastgesteld, kunnen afbraak van eiwitten beïnvloeden stroomafwaarts experimenten. Zo is bijvoorbeeld immunohistochemie beïnvloed in 12-uur postmortem ogen en een aantal specifiek enzym activiteiten kunnen worden teruggebracht binnen een paar uur (niet gepubliceerd observatie). Alle weefsels in deze studie werden verzameld tussen 2 en 8 uur van de dood, zonder significante veranderingen in eiwitexpressie of geschiktheid voor proteomics analsyis. De vloeibare stikstof bevriezen methode van conservering is verkozen boven fixatie om kleine veranderingen in de eiwitstructuur veroorzaakt door fixatief verknoping, die is in andere weefsels aangetoond door LC-MS/MS te voorkomen. 6 Proteoom studies zullen afhangen van het vermogen om nauwkeurig ontleden de verschillende compartimenten van het glasvocht, zoals aangetoond in deze video experiment. We hebben gekeken naar de dissectie techniek met behulp van een-dimensionale SDS-PAGE. Als onze resultaten suggereren, zijn er differentieel tot expressie gebrachte eiwitten in de verschillende substructuren glasachtig lichaam. Het identificeren van deze eiwitten zal een meer gedetailleerde kennis van glasvocht verkokering.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> 0,12 pincet </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1502 </td></tr><tr><td> 5-cc spuit </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> Rechte Dressing Forceps Met vertanding </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1400 </td></tr><tr><td> 23 gauge naald </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 305145 </td></tr><tr><td> Colibri pincet </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> 2 / 132 </td></tr><tr><td> Castroviejo gebogen hoornvlies schaar </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3223 </td></tr><tr><td> Vannas Gebogen capsulotomie Schaar </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3387 </td></tr><tr><td> Weck-Cel chirurgische speren </td><td> Medtronic </td><td> 0008680 </td></tr><tr><td> Westcott Gebogen Tenotomy Schaar </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3320 </td></tr></tbody></table>

dissectie van de mens glasvocht elementen voor proteoomanalyse

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

Het glasvocht is een optisch helder, collagene extracellulaire matrix dat de binnenkant van het oog en ligt over het netvlies vult. 1,2 Abnormale interacties tussen glasvocht en het netvlies onderbouw ten grondslag liggen aan verschillende vitreoretinale ziekten, waaronder retinale scheur en onthechting, macula pucker, maculair gaatje, leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, vitreomaculaire tractie, proliferatieve vitreoretinopathie, proliferatieve diabetische retinopathie, en erfelijke vitreoretinopathies. 1,2 De moleculaire samenstelling van het glasvocht substructuren is niet bekend. Sinds het glasachtig lichaam is transparant met beperkte chirurgische toegang, is het moeilijk om haar substructuren studeren op moleculair niveau. We hebben een methode ontwikkeld om te scheiden en deze weefsels te bewaren voor proteomische en biochemische analyse. De dissectie techniek in deze experimentele video laat zien hoe te isoleren glasvocht basis, anterior hyaloid, glasachtige kern, en het glasvocht cortex van postmortale menselijke ogen. Eendimensionale SDS-PAGE analyses van elk onderdeel glasvocht toonde aan dat onze dissectie techniek resulteerde in vier unieke eiwitprofielen overeenkomt met elk onderbouw van het menselijk glasachtig lichaam. Identificatie van differentieel gecompartimenteerde eiwitten zal onthullen kandidaat-moleculen ten grondslag liggen aan de verschillende vitreoretinale ziekten.

Deze video toont een effectieve techniek voor het differentiëren en het ontleden van de verschillende semi-transparante structuren van het menselijk glasachtig lichaam in post mortem ogen.

Dissectie van de Mens glasvocht Elementen voor proteoomanalyse

Het glasvocht is een optisch heldere, collageenrijke extracellulaire matrix die de binnenkant van het oog vult en over de retina ligt. 1,2 Abnormale interacties ...

Het glasachtig lichaam is een optisch heldere extracellulaire matrix die de binnenkant van het oog vult. Het kan worden onderverdeeld in verschillende substructuren, waaronder de anterior hyaloïde achter de lens, de vitreousbasis bij het anterieure retina, de vitreouscortex die een elastische schil vormt en de vitreouskern in het centrum. Om het glasachtig lichaam te dissekeren, moeten we eerst het anterieure segment verwijderen.Een uiterst scherp mesje wordt gebruikt om het hoornvlies bij de limbus in te snijden. Vervolgens worden cornea-sclera-scharen gebruikt om het hoornvlies net anterior van de limbus door te snijden. De iris wordt met gebogen scharen gedisseceerd door deze van het oppervlak af te trekken.Door zachte druk uit te oefenen op de oogbol kan de kern worden uitgestoten. Om de glasachtig lichaam-kern te verwijderen, gebruikt u een naald van 23 gauge op een spuit van vijf cc en aspireert u het grotendeels vloeibare glasachtig lichaam. De anterieure hyaloïde wordt zichtbaar als een dunne, transparante membraanstructuur die met een pincet kan worden gegrepen.Het is een elastische structuur vlak achter de lens. De binnenste cirkel is het ligamentum hyaloideum. Een schaar wordt gebruikt om het glaspictuur door te snijden terwijl een pincet tractie uitoefent.Het weefsel kan worden overgebracht naar een afu-buis en de handeling wordt herhaald totdat al het weefsel is gedissekeerd. Om de resterende vitreuze substructuren te bereiken, is het noodzakelijk het oog te openen met gebogen Westcott-scharen. Elk van de flappen wordt met een pincet in een Petrischaal weggelegd.Deze afbeelding toont de anatomie van de vitreuze basis, een dun, transparant weefsel dat over de ora serrata ligt. De ora serrata is de scheidslijn tussen het ciliaire lichaam aan de voorzijde en het netvlies aan de achterzijde. In tegenstelling tot andere delen van het glasachtig lichaam is de vitreuze basis stevig gehecht aan het onderliggende ciliaire lichaam en het netvlies; trekken met een pincet zal het weefsel daardoor daadwerkelijk optillen.Om de vitreusbasis te isoleren, verwijderen we eerst de pars plana met een pincet en Wescott-scharen. De pars plana is dit kleine gebied met ribbels. Om vervolgens de vitreusbasis te isoleren, snijdt u met Wescott-scharen twee tot drie millimeter posterieur aan de ora, terwijl u het oog met een pincet stabiliseert; houd de vitreusbasis vast en oefen tractie uit met het pincet, terwijl u sequentieel doorsnijdt met de Wescott-scharen.Er is een uiterlijk dat lijkt op een snoer parels wanneer de basis van het glasachtig lichaam wordt weggesneden, waarbij kan worden waargenomen hoe deze extracellulaire matrix eiwitten kan compartmentaliseren. Verschillende technieken kunnen worden gebruikt om de schil van het glasachtig lichaam te dissecteren. Contact met een WEX-cel-spons zal de cortex optillen.Een rand van de cortex kan worden aangetroffen tussen de vliezen, zoals hier wordt getoond. Gebruik opnieuw de pincet om tractie uit te oefenen en hanteer een VanNess-schaar om de vitreuze cortex sequentieel door te knippen. De cortex kan ook van de papil worden opgetild; hier worden grotere Westcott-scharen gebruikt om de cortex te dissekeren terwijl deze voorzichtig van het oppervlak van het netvlies wordt gepeld.De monsters kunnen vervolgens in een microcentrifugebuisje worden geplaatst en bewaard voor latere proteomische analyse.

dissection-of-human-vitreous-body-elements-for-proteomic-analysis

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

De niet-menselijke primaat is een belangrijk translationeel soort voor ons begrip van de ontwikkeling en veroudering. De anatomische organisatie van het primaat netvlies kan leveren belangrijke inzichten in normale en pathologische omstandigheden bij de mens.

De poort naar de hersenen: Ontrafeling van de Primate Eye

De dissectie techniek illustreert ingewanden te ontdoen van het glasvocht, netvlies, en de lens van de muis oog, scheiding door centrifugeren, en karakterisering met eiwit assays.

Verwijderen van de ingewanden van de muis glasvocht en het netvlies voor Proteoom Analyses

Neurale retina van een muis 8 dagen oud is op een 4% gelatine blok. Na isolatie van de fotoreceptor laag (200 pm) door vibratome, zijn de fotoreceptoren gezaaid na mechanische en enzymatische dissociatie voor cultuur. De fotoreceptor laag kan worden gebruikt voor moleculaire, biochemische analyses of transplantatie.

Vibratome Sectioning Mouse Retina te Fotoreceptor culturen Bereid

Het doel van dit protocol is om een effectieve techniek te laten zien om een volledige, intacte vitreuze kern en cortex van post mortem geënucleeerde varkensogen te isoleren.

Hele glasvocht Dissection voor Vitreodynamic Analyse

Het menselijke netvlies is samengesteld uit functioneel en moleculair verschillende regio's, met inbegrip van de fovea, macula en perifere retina. Hier beschrijven we een methode met behulp van punch biopsieën en handmatig verwijderen van de lagen weefsel van een menselijk oog te ontleden en deze verschillende retinale regio's voor downstream Proteoom analyse te verzamelen.

Dissectie van menselijke netvlies en RPE-vaatvlies voor proteoom-analyse

Proteoom karakterisering van oogbeschadigingen en/of microvasculaire bedden is cruciaal voor diepgaand inzicht in de vele oogbeschadigingen en/of pathologieën bij de mens. Deze studie toont aan dat een doeltreffende, snelle en robuuste methode voor eiwit extractie en bereiding van de monsters van kleine bloedvaten met de varkens korte posterieure Ciliaire slagaders als model vaartuigen voor proteomics massa spectrometrie-gebaseerde analyses.

Bereiding van de monsters voor Proteomics-analyse op basis van massa-spectrometrie van oogbeschadigingen en/of Microvessels

We beschrijven een methode om retinaal pigmentepitheel (RPE) efficiënt te scheiden van het netvlies in menselijke ogen en hele RPE / choroïde flatmounts te genereren voor histologische en morfometrische analyses van de RPE.

Efficiënte en consistente generatie van retinale pigmentepitheel / choroïde flatmounts uit menselijke ogen voor histologische analyse

Dit protocol presenteert een geïntegreerd biorepository-platform voor de gestandaardiseerde verzameling, annotatie en biobanking van hoogwaardige menselijke waterige humor en glasvochtbiopten voor moleculaire downstream-analyses, waaronder proteomics, metabolomics en glycomics.

Biobanking van menselijke waterige en glasachtige vloeibare biopsieën voor moleculaire analyses

Het netvlies vertoont een complexe ruimtelijke organisatie over zijn laminaire structuur. Moderne ruimtelijke transcriptomics en sequencingtechnieken vereisen weefselcoupes &lt; 20 μm dik, waardoor hun toepasbaarheid voor retinaal onderzoek wordt beperkt. Deze vers ingevroren cryosectiemethode produceert dunne delen van het netvlies van de muis met behoud van vlakke ruimtelijke relaties, waardoor uitgebreide moleculaire kartering over laminae mogelijk is.

En gezicht Cryosectie van het netvlies van de muis voor hoogdimensionale ruimtelijke moleculaire analyse

Deze methode visualiseert de natuurlijke structuur van collageenvezels in het glasvocht met behulp van confocale reflectiemicroscopie.

Varkensogen voorbereiden op confocale reflectiemicroscopie om het glasvochtvezelnetwerk van collageen te visualiseren

Leer dissectietechnieken voor het menselijk glasvlichaam om substructuren te isoleren voor proteoomanalyse. Deze methode helpt onderzoekers de anatomie en functie van oculaire weefsels te begrijpen.

Dissectie van de Mens glasvocht Elementen voor proteoomanalyse

Meer video's verkennen