JoVE Encyclopedie van Experimenten
Microbiologie
0 weergaven • 3:45 min. • August 31st, 2026
Begin met een suspensie van bacteriële cellen die viraal integrase met een polyhistidine-tag tot expressie brengen.
Sonicate de suspensie om de bacteriële membranen te verbreken en de integrase vrij te maken.
Breng het lysaat over naar een ultracentrifugebuis.
Centrifugeer op hoge snelheid om het celdebris te pelletiseren en verzamel het supernatant.
Neem vervolgens een chromatografiekolom gevuld met nikkel-geladen hars en equilibreer deze met buffer.
Laad het geklaarde lysaat op de kolom.
Eiwitten met histidines binden zwak aan nikkel, terwijl polyhistidine-getagde integrase sterk bindt.
Was met buffer om ongebonden eiwitten te verwijderen, en voeg vervolgens elutiebuffer toe met een lineair toenemende imidazoolconcentratie.
Imidazole concurreert met histidine voor nikkelbinding en laat het integrase vrij.
Verzamel de fracties en breng aliquots over naar buisjes met ladingsbuffer.
Verhit om de eiwitten te denatureren en breng ze vervolgens aan op een polyacrylamidegel.
Voer elektroforese uit en analyseer de eiwitbanden.
Identificeer fracties die zuivere integrase bevatten, zonder contaminerende eiwitten, en voeg deze samen om gezuiverde virale integrase te verkrijgen.
Begin met het ontdooien v
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's