Zuivering van virale integrase met behulp van affiniteitschromatografie

Begin met een suspensie van bacteriële cellen die viraal integrase met een polyhistidine-tag tot expressie brengen.

Sonicate de suspensie om de bacteriële membranen te verbreken en de integrase vrij te maken.

Breng het lysaat over naar een ultracentrifugebuis.

Centrifugeer op hoge snelheid om het celdebris te pelletiseren en verzamel het supernatant.

Neem vervolgens een chromatografiekolom gevuld met nikkel-geladen hars en equilibreer deze met buffer.

Laad het geklaarde lysaat op de kolom.

Eiwitten met histidines binden zwak aan nikkel, terwijl polyhistidine-getagde integrase sterk bindt.

Was met buffer om ongebonden eiwitten te verwijderen, en voeg vervolgens elutiebuffer toe met een lineair toenemende imidazoolconcentratie.

Imidazole concurreert met histidine voor nikkelbinding en laat het integrase vrij.

Verzamel de fracties en breng aliquots over naar buisjes met ladingsbuffer.

Verhit om de eiwitten te denatureren en breng ze vervolgens aan op een polyacrylamidegel.

Voer elektroforese uit en analyseer de eiwitbanden.

Identificeer fracties die zuivere integrase bevatten, zonder contaminerende eiwitten, en voeg deze samen om gezuiverde virale integrase te verkrijgen.

Begin met het ontdooien van één pellet E.coli die prototype foamy virus integrase tot expressie brengt op ijs. Gebruik een sonicator uitgerust met een biohorn van 0,5 inch diameter met een taps toelopende microtip van 0,125 inch diameter om 30 seconden te sonceren bij 30% amplitude terwijl de buis op ijs staat. Breng na sonicatie het celmonster over naar een koude ultracentrifugebuis en centrifugeer bij 120.000 ×g gedurende 60 minuten bij 4 °C.

Na centrifugatie moet er een duidelijk pellet zichtbaar zijn en het supernatant kan een gele kleur hebben. Breng het supernatant over in een koude conische buis van 50 milliliter. Stel vervolgens de 110 millimeter lange FPLC-kolom met een diameter van vijf millimeter in met 1,5 milliliter nikkelgeladen hars.

Sluit eerst de kolom aan op het FPLC-instrument en breng buffer aan. Het instrument moet real-time gegevens van de geleidbaarheid en de UV-absorptie bij 280 nanometer verzamelen. De geleidbaarheids- en UV-metingen moeten stabiliseren.

Indien nodig, blijf buffers door de kolom leiden totdat de metingen stabiel zijn. Laad met behulp van een superloop het eiwitmonster op de kolom bij een stroomsnelheid van 0,15 milliliter per minuut met een maximale druklimiet van 0,5 megapascal. Bevestig de superloop aan de AKTA FPLC.

Na het wassen van de kolom en het elueren van de eiwitten, worden aliquots van 15 µL genomen van de initiële flowthrough, de wassing en de fracties met de piekabsorbentie bij 280 nm, waarna aan elk monster 15 µL 2x SDS-PAGE monsterbuffer wordt toegevoegd. Kook de monsters gedurende drie minuten. Breng 10 µL van elk monster aan op 10% SDS-PAGE gels, samen met 4 µL gepre-stainde eiwitstandaarden.

Inspecteer de gel visueel om fracties te identificeren die bijna zuiver prototype foamy virus integrase lijken te bevatten. Combineer deze fracties en noteer het volume tijdens het pipetteren. Dit is doorgaans 8 tot 10 mL.