C. elegans Positieve Butanon Learning, op korte termijn en lange termijn geheugen Associatieve Assays

Het algemene doel van het volgende experiment is om het korte- en langetermijngeheugen van een aangeleerde positieve associatie tussen voedsel en de chemoattractant butaan te testen, met C. elegans als model. Dit wordt bereikt door eerst gesynchroniseerde, goed gevoede jonge volwassen wormen gedurende één uur uit te hongeren.

Vervolgens worden de wormen getraind in aanwezigheid van voedsel en butanon; dit gebeurt via massconditioning voor kortstondig associatief geheugen en via gespatieerde conditionering voor langdurig associatief geheugen. Na de conditionering wordt de chemotaxis naar butanon gemeten en vergeleken met de naïeve chemotaxis. Om de retentie van het geheugen te bestuderen, worden resultaten verkregen die de duur van het kort- en langetermijn associatief geheugen van de aangeleerde associatie tussen voedsel en butanon aantonen, op basis van veranderingen in de leerindex.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van cognitieve veroudering en ziekten, zoals welke genetische paden vereist zijn voor de neuronale functie bij normale veroudering en neurodegeneratieve ziektebeelden, en hoe leren en geheugen kunnen worden verbeterd. Onder omstandigheden van cognitieve beperking worden wormen voorbereid met standaardmethoden op groeimedia-platen van 100 millimeter hoog, ingezaaid met één milliliter OP 50 e coli. Gebruik jonge volwassenen met een dichtheid van ongeveer 5.000 wormen of minder per plaat.

Verzamel de wormen door voorzichtig M9-buffer op de plaat te gieten en de wormen los te schudden. Probeer agitatie te minimaliseren, omdat dit ongewenste bacteriën kan losmaken. Kantel vervolgens de plaat en zuig het mengsel van buffer en wormen vanuit de hoek op.

Gebruik een P 1000 pipet. Draag de wormen over naar een conisch buisje van 15 milliliter. Let erop dat u de wormen niet tegen de wand van het buisje pipetteert als er nog wormen op de plaat achterblijven.

Herhaal deze stap één tot twee keer. Laat de wormen door zwaartekracht naar de bodem van de buis zakken. Centrifugatie wordt niet aanbevolen voor optimale resultaten.

Zodra de cellen zijn neergeslagen, wordt het supernatant via vacuüm verwijderd en wordt er gewassen met ten minste drie tot vier milliliters M nine buffer. Werk snel om uithongering te voorkomen. Herhaal deze procedure twee keer, voor een totaal van drie wasbeurten.

Op dit punt kan een cohort wormen apart worden gezet om te dienen als de naïeve groep in de chemotaxis-assays die later zullen worden gedemonstreerd om de wormen voor te bereiden op de training; voeg drie tot vier milliliter M9-buffer toe aan de buis en laat de wormen één uur uithongeren bij kamertemperatuur. Bereid de conditioneringsplaten voor door twee microliter 2-butanon in 95% ethanol uit te strijken op de binnenzijde van de deksels van 60 millimeter NGM-platen die zijn geënt met 500 microliter OP50 E. coli. Haal de suspensie uit de buis met uitgehongerde wormen en gebruik een P1000-pipet om 100 tot 200 microliter wormen naar elke conditioneringsplaat over te brengen. Incubeer de conditioneringsplaten één uur bij kamertemperatuur na de conditionering.

Was de wormen van de platen met ongeveer één milliliter M9-buffer en breng ze over naar een conische buis van 15 milliliter. Herhaal de eerder gedemonstreerde milde wasmethode totdat de buffer helder oogt. Na het wassen kan een deel van de wormen worden verwijderd en getest in de chemotaxis-assay om als nulmeting-groep voor één keer mast-associatief leren te dienen, ter voorbereiding op platen die aanvullende tijdspunten vertegenwoordigen.

Breng 100 tot 200 microliters wormen over naar gezaaide 60 millimeter NGM-platen. Incubeer deze platen na conditionering gedurende 0,51 of twee uur bij kamertemperatuur. Was na elk tijdstip de wormen voorzichtig van de platen in een 15 milliliter conische buis en herhaal dit nog één tot twee keer.

Met M nine-buffer, waarbij dezelfde milde wasprocedures worden gevolgd, wordt het kortetermijnassociatieve geheugen getest met behulp van de chemotaxis-assay, die later wordt gedemonstreerd. Bereid de conditioneringsplaten en wormen voor zoals gedemonstreerd voor kortetermijntraining, maar laat de wormen slechts 30 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Verzamel na de incubatie de wormen zoals eerder gedemonstreerd.

Breng ze over naar NIET-GEZAAIDE NGM-platen van 60 millimeter. Laat de wormen 30 minuten lang uithongeren op de ongezaaide platen bij kamertemperatuur. Nadat de wormen zijn uitgehongerd, wast u de wormen met M9-buffer en plaatst u ze terug in de conische buis van 15 milliliter. Herhaal deze stappen totdat in totaal zeven conditioneringsblokken en zes uithongeringsblokken zijn voltooid.

Wanneer de conditionering is voltooid, worden de wormen van de conditioneringsplaten teruggewassen in een conische buis. Zoals eerder beschreven, kan een cohort wormen worden gebruikt om direct na de conditionering te testen op associatief leren met zeven tijdsintervallen. Breng de resterende populatie wormen over naar 100 millimeter HGM-platen met één milliliter OP 50.

Breng opnieuw 100 tot 200 µL wormen per plaat aan om er zeker van te zijn dat er voldoende bacteriën aanwezig zijn om de populatie te ondersteunen. Incubeer de platen na conditionering bij 20 °C gedurende 16, 24 of 40 uur, wat de tijdspunten voor het langetermijnassociatieve geheugen vertegenwoordigt, om het langetermijnassociatieve geheugen voor de associatie tussen voedsel en butanon te testen. Was de wormen voorzichtig van de platen in een conische buis van 15 mL, en vervolgens nog één tot twee keer met M9-buffer na elk tijdspunt, en test de wormen in de chemotaxis-assay.

Om de platen voor de chemotaxis-assay voor te bereiden, markeert u de onderkant van niet-geplaatste 100 millimeter NGM-platen met stippen nabij de zijkant op drie locaties, zoals hier weergegeven. Breng één microliter van één molar natriumazide aan op de geurstof- en controleplaatsen. Doe dit niet meer dan 15 minuten voordat de assay start om diffusie van de verlammende middelen te minimaliseren.

Breng vervolgens één microliter 95% ethanol en 10% butanon aan op de overeenkomstige posities op de gemarkeerde assayplaat. Dit moet bovenop het eerder aangebrachte natriumazide gebeuren. Verwijder zoveel mogelijk van de M9-buffer uit de buis met de bezonken wormen.

Gebruik een P 20 pipet met een voorgesneden tip om 15 µL wormen in drie intervallen van vijf µL op de oorsprong van de assayplaat aan te brengen. Draai vervolgens de hoek van een Kimwipe tot een klein puntje en gebruik deze om het overtollige M9-buffer weg te blotten, waarbij u voorzichtig bent om de agar niet te doorprikken.

Door het overschot aan buffer te verwijderen, komen de wormen vrij op de assayplaat. Indien beeldvorming wordt gebruikt om de wormen te tellen, geeft een afbeelding van de startpositie direct na deze vrijgave het totaal aantal dieren voor een assayplaat. Incubeer de chemotaxis-assayplaat na incubatie één uur bij kamertemperatuur, tel het aantal wormen bij de startpositie, de ethanolvlekken en de butonvlekken, evenals het totaal aantal wormen op de assayplaat.

Over het algemeen zullen wormen die verlamd zijn door natriumazide zich binnen een straal van één centimeter rond de plekken bevinden en er kaarsrecht uitzien. Omdat veel dieren op elkaar gestapeld liggen, kunnen de wormen handmatig worden geteld of worden gekwantificeerd met behulp van beeldbewerkings- en analyse-software. Wij geven de voorkeur aan dat laatste voor het gemak en de betrouwbaarheid van de resultaten.

Zodra de wormen bij de startvlekken met ethanol en butanon zijn gekwantificeerd, berekent u de KeyAx-index zoals hier wordt weergegeven. De typische naïeve chemotaxisindex voor wild-type wormen die reageren op 10%Butone is ongeveer 0,2. Massale of gespreide training verhoogt de chemotaxisindex over het algemeen naar 0,7 tot 0,8 op tijdstip nul, wat resulteert in een leerindex van ongeveer 0,6.

Naïve chemotaxis is zeer gevoelig voor de juiste verzorging van de wormen. Deze figuur toont het duidelijke verschil in de CI tussen goed gevoede en uitgehongerde naïve wormen en benadrukt het belang van een correcte techniek. Geheugenretentie wordt weerspiegeld in de tijd die de chemotaxis-index nodig heeft om terug te keren naar naïve niveaus wanneer de leerindex bij wildtype dieren gelijk is aan nul.

Kortetermijnassociatief geheugen begint af te nemen één uur na een massatraining die ongeveer twee uur duurt en is in vergelijking hiermee onafhankelijk van de transcriptiefactor Creb. Langetermijnassociatief geheugen begint doorgaans pas significant af te nemen 16 uur na een ruimtetraining die tot 40 uur kan duren en is Creb-afhankelijk. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat chemotaxis-assays kunnen worden beïnvloed door uithongering of overmatige geuren in de omgeving, en ook dat het geheugen en de wormen kunnen worden verstoord door te veel fysieke agitatie.