Multiple-muis neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

Het algemene doel van deze procedure is om high-throughput fenotypering te bereiken bij levende of gefixeerde muizen met behulp van meerdere MRI-scans van het muizenbrein. Dit wordt bereikt door eerst elke muis te anesthetiseren. Plaats vervolgens voor in vivo scanning elke muis op een passende sled voordat deze in een laadarray wordt gemonteerd en in de boring van de magneet wordt geplaatst.

Of voer voor ex vivo beeldvorming een transcardiale perfusie uit, isoleer de schedelstructuur en plaats deze in beeldvormingsbuisjes, die vervolgens in een solenoid coil array met 16 kanalen worden geplaatst in de boring van de magneet. Uiteindelijk kunnen driedimensionale MRI-volumes worden verkregen die hoogwaardige beelden van de hersenen opleveren die geschikt zijn voor fenotypering, en die zowel grote als kleine structuren in de hersenen van de muis tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals histologie is dat de grove anatomie van de specimens in hun schedels behouden blijft en dat het een volledige dekking van de hersenen en een driedimensionale analyse mogelijk maakt.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de biomedische velden, zoals de relatie tussen genen en anatomische onderscheiden die fenotypes vertegenwoordigen in het muismodel van een ziekte. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze techniek merken dat de ontwikkeling van op maat gemaakte arrays voor het laden van muizen en radiofrequentiespoelen noodzakelijk is voor high-throughput hersenbeeldvorming. De meest uitdagende stappen zijn identificatie en weging. Voordat u met dit protocol begint, dient u goedkeuring voor alle procedures voor het hanteren van dieren te verkrijgen van de lokale commissie voor dierenzorg van uw instelling, de institutionele commissie voor dierenzorg en -gebruik, of een gelijkwaardig orgaan.

Opnames van de dieren moeten worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskabinet. Breng de dieren vervolgens over naar een autocleefbare plastic bak voor transport naar de MRI-inductiekamer. Anestheseer de te scannen dieren in de voorverwarmde inductiekamer met 4% ISO-fluorine en vier liter per minuut zuurstof.

Dieren zijn volledig geanestheseerd zodra zij niet meer reageren op een knijpreflex in de poot. Indien nodig kan de vacht op de borst worden verwijderd met een ontharingstool zoals nare, om een beter contact te garanderen met de ECG- en temperatuuroverwakingsapparatuur die in de op maat gemaakte slede zijn ingebouwd. Breng daarnaast een ISV aan, zoals tears natural PMM, in de ogen om uitdroging te voorkomen en dien ongeveer 0,3 milliliters saline toe via een subcutane injectie.

Om de dieren te hydrateren. Plaats de muizen nu op individuele sleds met ingebouwde ECG-sensoren voor respiratie en temperatuur. Let erop dat de voor- en achterpoten in de daarvoor bestemde inkepingen op de sleds worden geplaatst.

In gevallen waarin ECG-monitoring vereist is, dient u ervoor te zorgen dat de haarloze gebieden aan de onderzijde van de muis zijn uitgelijnd met de ECG-probes, immobiliseert u elk dier met een hoofdband en neusband, en schuift u vervolgens elke sled in een open 50 milliliter conische buis. Tot zeven levende muizen kunnen in één imaging-sessie worden voorbereid voor scanning. Monteer vervolgens de conische buizen op de loading array.

Zorg ervoor dat alle fysiologische monitoringslijnen zijn aangesloten zodra alle dieren zijn geladen. Stel het isofluoraneniveau in de magneetboring in op 2% en het zuurstofniveau op 8 l/min. Transporteer nu de laadmatrix naar de magneet en plaats deze op het railsysteem.

Gebruik het railsysteem om de laadmatrix te koppelen aan de muizenbehuizing, die is ontworpen om muizen uniform te positioneren in elke radiofrequentiespoel in het centrum van de magneetopening. Wanneer deze volledig in de magneet is geplaatst, koppelen de centrifugebuizen aan het anesthesietoedieningssysteem binnen de RF-spoelen, zoals hier te zien is; ISOF fluor mixed met zuurstof wordt vanuit de muizenbehuizing en naar het specimen geleid via een slang langs de as van elke individuele spoel. Dit anesthesiegasmengsel stroomt in de buizen langs de muizen en wordt opgevangen door een actieve afzuigunit die aan de achterzijde van de laadmatrix is bevestigd.

Afhankelijk van de fysiologische waarden van de dieren, zoals ademhaling en temperatuur, moeten de isofluraanneaus tussen 0,9 en 2% worden ingesteld. Scan vervolgens de dieren met een fast bin echo-sequentie. De duur van elke driedimensionale scan is ongeveer drie uur met een resulterende beeldresolutie van 125 micrometers. Zorg ervoor dat de ECG-waarden, ademhaling en temperatuur van elk dier gedurende de gehele scan worden gemonitord.

Dieren moeten tijdens de scanningsessie ook warm worden gehouden met een stroom warme lucht. Wanneer de scan is voltooid, verwijdert u de loading array uit de magneet en plaatst u deze in een warme inductiekamer gevuld met 100% oxygen. Haal de dieren uit de buizen en breng ze over in afgesloten plastic containers voor transport naar een biologische veiligheidskast.

Plaats de dieren tot slot in een warme kooi zonder tocht en laat ze herstellen van de anesthesie voor exvivo beeldvorming. Anestheseer de dieren eerst volledig middels een intraperitoneale injectie van een combinatie van ketamine en xylazine. Beoordeel vóór aanvang van de perfusie het chirurgische anesthesievlak door middel van een knijptest aan de teen of poot.

Open de borstholte en breng een naald of een veilig vleugelinfusiesetje in het linkerventrikel van het hart in. Snijd vervolgens het rechter atrium open om te beginnen met transcardiale perfusie. Spoel eerst met 30 milliliter kamertemperatuur, one x phosphate buffered saline gemengd met één microliter per milliliter heparine en twee millimolar proteaseremmers met een stroomsnelheid van ongeveer 100 milliliter per uur.

Dit zou ongeveer 20 minuten moeten duren. Volgende fixatieronde met 30 milliliters kamertemperatuur, 4%paraform aldehyde gemengd met twee millimolar pro hands bij 100 milliliters per uur. Decapiteer nu het dier en verwijder de huid, de onderkaak, de oren en de kraakbeennaspunt.

Plaats vervolgens de resterende schedelstructuur in 4% paraformaldehyde gemengd met twee millimolair pro hands en laat dit een nacht rusten bij vier graden Celsius. Verplaats het specimen de volgende dag naar een oplossing van één x fosfaatgebufferde zoutoplossing, gemengd met 0,02% natriumazide met twee millimolair pro hands voor conservering. Hoge-resolutie driedimensionale MRI-scanning bij zeven Tesla dient plaats te vinden na ten minste vier dagen, maar niet later dan twee en een halve maand.

Na de perfusie. Plaats de te beelden hersenen in een 16-kanaals solenoid coil array en plaats deze in de scanner. Scan de specimens vervolgens met een fast spin echo-sequentie.

Deze scantijd bedraagt ongeveer 12 uur en de uiteindelijke beelden zullen een isotrope resolutie van 32 micrometers hebben. Nadat de scan is voltooid, worden de specimens uit de imaging-spoel verwijderd en wordt elke schedel in een 10% formaline-oplossing met twee millimolair pro hands geplaatst voor preservering representatief in vivo. Meerdere beelden van muizenhersenen uit één scan van drie uur worden hier getoond.

Deze figuur toont drie axiale aanzichten voor elk van de zeven gescande muizen. Hier is een representatief ex vivo hersenbeeld met een isotrope resolutie van 32 micron. En hier kunnen we een 3D-rendering zien van een ex vivo beeldvolume na verwerking.

Deze in vivo techniek kan in drie tot vier uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd. Deze techniek kan door onderzoekers in vele biomedische vakgebieden worden gebruikt om ziekten zoals lupus, de ziekte van Huntington en de ziekte van Alzheimer in het muismodel te bestuderen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het in beeld brengen van zowel levende als gefixeerde proefpersonen om hoogwaardige hersenbeelden met MRI te verkrijgen.

Bedankt voor het kijken.