Isolatie van vertalen Ribosomen bevattende peptidyl-tRNA's voor functionele en structurele analyses

Het algemene doel van het volgende experiment is om de structuur en functie te analyseren van zuivere ribosomen die een uniek peptidyl-tRNA bevatten. Dit wordt bereikt door in vitro translatie-assays uit te voeren met celvrije extracten die ontdaan zijn van release-factoren en met biotine-gelabelde mRNA's, om gestagneerde pep-tRNA-ribosoomcomplexen te genereren die gebonden zijn aan de biotine-gelabelde mRNA's. Als tweede stap worden streptavidine-gebonden paramagnetische beads gemengd met de in vitro translatie-assays om interactie mogelijk te maken met de biotine-moleculen in het mRNA.

Later worden de beads geëxtraheerd met behulp van magnetische velden, waardoor de gestopte peptid-tRNA-ribosoomcomplexen die aan de mRNAs zijn gebonden, uit de totale reactie worden getrokken. Vervolgens kunnen de gezuiverde peptid-tRNA-ribosoomcomplexen worden gemengd met translationele factoren, zoals release-factoren voor translatie, remmende antibiotica of chemische modificerende agentia om de functie te analyseren. Er worden resultaten verkregen over de inhibitie en structuur van het ribosoom die de remming van hydrolyse van de peptide-tRNA's laten zien en de correlatie hiervan met structurele veranderingen in de ribosomen op basis van peptidetransferase-activiteit of translationele terminatie-assays met behulp van SDS- of Tris-Racin-PAGE-gels en modificatiebeschermingsassays met behulp van ureum-PAGE-gels.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals differentiële centrifugatie, is dat de geïsoleerde monsters grotendeels ribosomen bevatten met slechts één populatie pep tRNA. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van genexpressie, zoals de aard van nascente polypeptiden en de wijze waarop antibiotica de ribosoomfunctie beïnvloeden door het translatieproces te moduleren. Om deze procedure te starten, neem twee gram van een droog e coli bacterieel pellet uit kweekculturen in de log-fase.

Was het pellet door het opnieuw te suspenderen in één liter buffer A, gevolgd door centrifugatie bij 5.000 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Na het uitvoeren van twee wasbeurten wordt het resulterende bacteriële pellet opnieuw gesuspendeerd in 40 milliliter buffer A en worden de bacteriële cellen gelyseerd met behulp van een French press onder een druk van 6.000 PSI. Deze druk komt overeen met 600 eenheden bij gebruik van een zuiger van één inch.

Verzamel de gedestructureerde suspensie in een schone glazen buis van 50 milliliter. Behandel de gedestructureerde suspensie met één millimolar DIO triol of DTT en centrifugeer het monster bij 30.000 Gs gedurende 30 minuten. Verwijder het resulterende supernatant en herhaal de centrifugeringsprocedure.

Bewaar het supernatant dat is verkregen na de tweede centrifugatie en verdeel het uiteindelijke supernatant over microbuisjes. Bevries de aliquots vervolgens snel (flash-freeze) met behulp van een mengsel van droogijs en ethanol of vloeibare stikstof en bewaar de monsters bij -60 of -80 °C.

Begin de bereiding van celvrije extracten die zijn uitgeput van RF two door 4,5 milliliters protein A spheros four B slurry-beads te mengen met vijf milliliters van een anti-RF two antiserum. Roteer het mengsel op een rotatiewiel bij kamertemperatuur gedurende één uur. Centrifugeer het mengsel bij 2 500 Gs om de beads van het antiserum te scheiden.

Verwijder het supernatant. De beads bevatten nu de anti RF twee-antilichamen en zullen voortaan worden aangeduid als anti RF twee-beads. Was de beads door ze opnieuw te suspenderen in 1 mL buffer bee.

Centrifugeer vervolgens de beads zoals voorheen om de anti-RF2-beads van buffer B te scheiden. Herhaal deze wasprocedure tweemaal. Meng na het wassen van de beads één milliliter van het celvrije extract met 150 µL anti-RF2-beads en incubeer dit na de incubatie gedurende twee uur op een draaiwiel bij 4 °C. Centrifugeer het mengsel bij 10.000 ×g om het celvrije extract van de beads te scheiden.

Verwijder het supernatant en behandel het opnieuw met nog eens 150 µL anti RF two-beads voordat de incubatie wordt herhaald en er opnieuw een pull-down wordt uitgevoerd. Verdeel de uiteindelijke RF two-depleteerde celvrije extractoplossing in microcentrifugebuisjes van 100 µL per buisje. Vries de aliquots in met behulp van een mengsel van droogijs en ethanol of vloeibare stikstof en bewaar deze bij -60 of -80 °C.

Bereid de PCR-reactie voor door het plasmide-template dat de sequenties bevat, oligo-deoxynucleotiden, dNTP's, intact DNA-polymerase en strategy PCR-buffer te combineren. Zodra het PCR-monster is voorbereid, wordt de amplificatiereactie uitgevoerd. Precipiteer het DNA om de PCR-producten te zuiveren door een tiende volume drie molair natriumacetaat pH 5,2 en twee volumes ijskoude ethanol toe te voegen. Na het nogmaals herhalen van de precipitatieprocedure suspenderen we het resulterende DNA in 100 µL dathylpercarbonaat of DEPC-behandeld water.

Verifieer de integriteit van de PCR-producten via elektroforese op agarosegels. Doorgaans levert deze procedure 100 microgram van een DNA-product van 600 basenparen op. Bereid een 100 microliter in vitro transcriptie-reactie voor in DEP-behandeld water door vijf microgram van het via PCR gegenereerde DNA-fragment te mengen met ribonucleotiden, biotine-gelabeld UTP en T7-enzymmix.

Incubeer het reactiemengsel gedurende drie uur bij 37 °C. Om de hoeveelheid verkregen mRNA te kwantificeren, wordt het DNA-sjabloon geëlimineerd door RNA-vrije DNase toe te voegen. Incubeer de reactie gedurende 10 minuten bij 37 °C.

Om de mRNA-producten te zuiveren, wordt het RNA tweemaal neergeslagen door één tiende volume drie molar natriumacetaat pH 5,2 en twee volumes koude ethanol toe te voegen; resuspendeer het neergeslagen mRNA in 100 µL DEPC-behandeld water. Verifieer de integriteit van de biotinyl-gelabelde mRNA-producten door middel van elektroforese op agarosegels. Gewoonlijk levert deze procedure tussen één en twee milligram van een biotinyl-gelabeld mRNA-product van 600 nucleotiden op. Om te beginnen met de isolatie van translerende ribosomen die een peptidyl-tRNA bevatten, wordt een in vitro translatie-reactiemengsel van 500 µL bereid in DEPC-behandeld water.

Bereid eerst het gebufferde reactiemengsel voor zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol, en voeg vervolgens 75 µM van elk van de aminozuren toe, behalve het aminozuur dat zal worden vervangen door een radioactief aminozuur. Voeg daarna 20 tot 50 µL van het RF twee-gedepleteerde celvrije extract toe aan de bufferoplossing die de aminozuren bevat. Incubeer het mengsel vijf minuten bij kamertemperatuur om de activering van de ribosomen mogelijk te maken.

Zodra de ribosomen zijn geactiveerd, voegt u 10 tot 15 µg biotinyl-gelabelde mRNA's toe aan het monster. Incubeer het reactiemengsel 10 minuten bij 37 °C.

Bereid ondertussen drie milliliters streptavidine paramagnetische kralen of SMB voor in buffer C. Voeg na incubatie de SMP-suspensie toe aan het translatiereductiemengsel. Incubeer de nieuwe suspensie 10 minuten bij kamertemperatuur. Scheid de SMB van het mengsel door een magnetisch veld aan te leggen met behulp van magnetische scheidingsstatieven. Resus.

Suspendeer de SMB in buffer C en scheid de beads opnieuw met behulp van het magnetische rekje. Nadat deze wasprocedure twee keer is herhaald, worden de beads opnieuw gesuspendeerd in 500 µL buffer C. Bewaar de suspensie op ijs en voer de volgende procedure onmiddellijk uit. Om de peptid TRNA te visualiseren, worden 10 µL van de gesuspendeerde SMB in buffer C gemengd met 10 µL ladingsbuffer; de componenten die aan de beads gebonden zijn, worden gescheiden door de monsters te analyseren op 10% Tris-tric polyacrylamidegels.

Droog de gels met een vacuümgeldroger. Verifieer vervolgens de integriteit en zuivering van het peptide TRNA door de gedroogde gel bloot te stellen aan een röntgenfilm. Combineer voor de analyse van het ribosomaal RNA 190 µL van een 2 mM EDTA-oplossing bereid met dpci-behandeld water, 200 µL fenol gelijkgesteld aan water en 10 µL van een kralessuspensie.

Meng de resulterende suspensie door krachtig te vortexen. Scheid de anorganische fase van de organische fase door centrifugatie bij 10, 000 Gs gedurende drie minuten. Verzamel bij kamertemperatuur de bovenste waterlaag in een nieuwe microbuis, precipiteer het RNA uit de waterlaag door toevoeging van één tiende volume drie molar natriumacetaat pH 5.2, 1 µL van een 20 mg/mL glycogeenoplossing en twee volumes ijskoude ethanol. Resuspendeer het geprecipiteerde RNA in 10 µL dpci-behandeld water.

Verifieer de integriteit van de ribosomale RNA's via elektroforese op niros-gels. Meestal levert 50 µL beat-suspensie één µg ribosomaal RNA op. Hier worden de resultaten gepresenteerd van een reeks analyses waarin de kwaliteit en functionaliteit van geïsoleerde translerende ribosomen worden geëvalueerd.

De waarneming van een unieke band die is gescheiden in polyacrylamidegels duidt op de aanwezigheid van polypeptiden die gebonden zijn aan de met biotine gelabelde mRNA's die zijn bevestigd aan de SMB. De zuivering van ribosomale RNA's. Het gebruik van deze procedure bevestigt eveneens de aanwezigheid van ribosomen die gebonden zijn aan deze met biotine gelabelde mRNA's.

Toevoeging van puromycine, een antibioticum dat de peptidyltransferase-activiteit van het ribosoom induceert, resulteert in splitsing van de nascente peptidyl-tRNA's. Dit is waarneembaar als een verschuiving in het migratiepatroon van het geïsoleerde polypeptide in polyacrylamidegels. Samen wijzen deze gegevens erop dat biotinyl-gelabelde mRNA's die aan de SMB zijn gebonden, functionele ribosomen met peptidyl-tRNA's bevatten.

De isolatie van translerende ribosomen die specifieke peptid-tRNA's bevatten, maakt het mogelijk om de effecten van peptid-tRNA-antibiotica en andere moleculen op de ribosoomfunctie en de ribosoomstructuur te bestuderen. In de hier gepresenteerde voorbeelden remmen het antibioticum parsamyn en het aminozuur tryptofaan de hydrolytische splitsing van de nascente TNAC tRNA peptid-tRNA door RF twee in de geïsoleerde ribosomen.

De interactie van tryptofaan of sparsomycine met het ribosoom induceert ook structurele veranderingen in sommige nucleotiden die het 23 S-R-R-N-A van het translatie-ribosoom vormen. Eenmaal beheerst, kan het hoofdgedeelte van deze techniek in vijf uur worden voltooid, mits deze procedures correct worden gevolgd. Andere methoden, zoals cryo-EM, kunnen worden ingezet voor extra structurele analyse om aanvullende vragen te beantwoorden over de structuur van het ribosoom dat unieke Pepin-RNA bevat.