Name: Isolatie van vertalen Ribosomen bevattende peptidyl-tRNAs voor functionele en structurele analyses (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-25T16:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Leer een methode voor de isolatie van vertalende ribosomen met specifieke peptidyl-tRNA's via biotine-gelabelde mRNA's en magnetische extractie. Deze techniek maakt nauwkeurige structurele en functionele analyses van ribosoomdynamica mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

LRC-V. wil dit artikel te wijden aan de nagedachtenis van Dr Adriel D. Johnson, een prachtige Professor waarvan het nummer een prioriteit was altijd de opleiding van studenten. We missen je, Adriel. We zijn dankbaar Jacqueline Moreno voor haar hulp bij het uitvoeren van de experimenten beschreven in deze studie. Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie ​​verstrekt aan CY van de National Science Foundation, MCB-0615390, en door start-up fondsen verstrekt aan LRC-V. van de Universiteit van Alabama in Huntsville.

1. Cel Gratis Extract voorbereiding. <ol><li> Twee gram van een droge Escherichia coli bacteriën pellet verkregen uit mid-log-fase culturen worden gewassen, tweemaal, met een halve liter buffer A die 10 mM Tris-acetaat, pH 8,0, 14 mM magnesiumacetaat, 60 mM kaliumacetaat en 50 ug / mL phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) door centrifugeren bij 5000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Na het wassen, is de bacteriële pellet geresuspendeerd in 40 ml buffer A. </li><li> De bacteriële cellen verstoord met behulp van een Franse pers, het toepassen van 6000 psi druk. Deze druk komt overeen met 600 eenheden met behulp van een een-inch zuiger. De verstoorde suspensie wordt verzameld in een schone glazen buis (50 ml). </li><li> De verstoorde suspensie wordt behandeld met 1 mM dithiotreitol (DTT) en gecentrifugeerd bij 30.000 xg gedurende 30 minuten. Het centrifugeren procedure wordt herhaald, met behulp van de resulterende supernatant. De laatste supernatant is afgegeven (1 ml) in microbuisjes. Ten slotte worden de monsters bevroren met behulp van een droog ijs-ethanol mengsel of vloeibare stikstof, en worden opgeslagen bij -60 ° C of -80 ° C. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Cel Vrije Extracten van verarmd RF2. <ol><li> 4,5 ml proteïne A Sepharose 4B slurry kralen worden gemengd met 5 ml van een anti-RF2 anti-serum met behulp van een draaiend wiel op kamertemperatuur, gedurende een uur. Het mengsel wordt gecentrifugeerd bij 2500 xg om de kralen te scheiden van het antiserum. Bij het weggooien van de supernatant, zijn deze kralen die de anti-RF2 antilichamen (anti-RF2 kralen) later gewassen door resuspensie in 1 ml buffer B met 35 mM Tris-acetaat pH 7,8, 10 mM magnesiumacetaat, 30 mM ammoniumacetaat, 60 mM kalium glutamaat en 5 ug / ml leupeptin proteinase inhibitor. De anti-RF2 parels worden vervolgens gescheiden van buffer B door centrifugeren met dezelfde hierboven vermelde voorwaarden. Het wassen procedure wordt tweemaal herhaald. </li><li> Een ml van de cel-extract wordt gemengd met 150 pi van de anti-RF2 kralen met behulp van een draaiend wiel, bij 4 ° C, gedurende twee uur. Het mengsel wordt gecentrifugeerd bij 10.000 xg voor de celvrije extract te scheiden van de kralen. Het supernatant wordt verwijderd en behandeld opnieuw met een andere 150 ul van anti-RF2 kralen. Deze procedure wordt nog eens herhaald met de daaruit voortvloeiende celvrije extract oplossing. De uiteindelijke celvrije extract oplossing is afgegeven (100 pi) in microbuisjes. De monsters worden bevroren met behulp van een droog ijs-ethanol mengsel of vloeibare stikstof, en worden opgeslagen bij -60 ° C of -80 ° C. </li></ol> 3. De voorbereiding van een DNA-template. <ol><li> Bereid een 1 ml PCR-reactie door het mengen van 600 femtomoles van het plasmide sjabloon met de sequenties te vertalen (afb. 1), met 0,4 nanomoles van elk van de oligodeoxynucleotides aangegeven in figuur 1, 0,2 micromol per dNTP en 50 U van Taq- DNA-polymerase in de buffer geleverd door Stratagene Co Voer de amplificatiereactie onder de te volgen voorwaarden: 94 ° C gedurende 2 min, (94 ° C gedurende 30 s, 55 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 1 minuut, voor 30 cycli) en 72 ° C gedurende 12 minuten. </li><li> Zuiveren de PCR-producten door neerslaan van het DNA door het toevoegen van 1 / 10 volume van 3 M natriumacetaat, pH 5,2, en 2 volumes ijskoude ethanol. Herhaal de neerslag procedure nog een keer. Resuspendeer de DNA in 100 ul van diethyl-pyrocarbonate (DEPC) behandelde-water. Typisch, deze procedure levert 100 ug van een 600 bp DNA product. </li><li> Controleer de integriteit van de PCR-producten door middel van elektroforese op agarose gels. </li></ol> 4. De voorbereiding van biotine Labeled mRNA. <ol><li> Bereid een 100 ul in vitro transcriptie reactie in DEPC behandelde water door het mengen van 5 ug van het PCR-gegenereerde DNA-fragment met 0,5 micromol ATP, CTP, GTP, 0,3 micromol UTP, 50 nanomoles van biotine-16-UTP, en 10 uL van T7 enzym mix in de buffer geleverd door Promega Co Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C gedurende 3 uur. Het kwantificeren van de hoeveelheid van de verkregen mRNA, moet de DNA-template worden geëlimineerd door het toevoegen van RNase-vrij DNase. Incubeer de reactie bij 37 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Zuiveren het mRNA producten door neerslaan van de RNA door het toevoegen van 1 / 10 volume van 3 M natriumacetaat, pH 5,2, en 2 volumes koude ethanol. Herhaal de neerslag procedure nog een keer. Resuspendeer de mRNA in 100 ul DEPC behandelde water. Meestal is deze procedure levert tussen 1-2 mg van een 600 nt biotine gelabelde mRNA product. </li><li> Controleer de integriteit van de biotine gelabelde mRNA producten door elektroforese op agarose gels. </li></ol> 5. Isolatie van vertalen Ribosomen bevattende een peptidyl-tRNA. <ol><li> Bereid 500 pi van een in vitro vertaling reactiemengsel in DEPC behandelde water door het mengen van 10 tot 15 ug van biotine-gelabelde mRNA met 75 nanomoles van elk van de negentien aminozuren, alle met uitzondering van het aminozuur dat zal worden vervangen door een radioactief aminozuur , 50 uCi een radioactieve aminozuur (37MBq) en 20-5 0 ul van RF2-lege cel-extract, in een gebufferde reactiemengsel dat 40 mM Tris-acetaat, pH 8,0, 10 mM magnesiumacetaat, 175 mM kaliumacetaat, 10 mM ammoniumacetaat, 2 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 mM GTP, 30 mM fosfoenolpyruvaat (PEP), 0,3 U / ml pyruvaat kinase (PK), 3,5% polyethyleenglycol 8000, 1 mM spermidine, 20 ug / ml folinezuur, en 250 ug / ml tRNA van E. coli. Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C gedurende 10 minuten. De volgorde van toevoeging van de reactie componenten is erg belangrijk. De cel-extract moet eerst worden gemengd met de buffer oplossing die de aminozuren en de uiteindelijke mengsel geïncubeerd gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de activering van de ribosomen mogelijk te maken. Later worden de biotine-gelabelde mRNA's toegevoegd. Voor structurele analyses met behulp van chemische modificatie procedures, is de toevoeging van een radioactief aminozuur niet vereist. </li><li> Toe te voegen aan de vertaling reactiemengsel - 3 ml streptavidine paramagnetische kralen (SMB) gesuspendeerd in buffer C met 35 mM Tris-acetaat, pH 8,0, 10 mM magnesiumacetaat, 175 mM kaliumacetaat, 10 mM ammoniumacetaat en 1 mM DTT. Incubeer de nieuwe ophanging bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. </li><li> Scheid de SMB uit het mengsel door het aanbrengen van een magnetisch veld (MF) met behulp van magnetische scheiding staat. </li><li> Resuspendeer de SMB in buffer C en weer scheiden de kralen met behulp van de MF. Twee keer Herhaal deze procedure wassen. Resuspendeer de kralen in 500 ul buffer C, bewaar de suspensie op ijs, en meteen voer de volgende procedure. </li></ol> 6. Analyse van de geïsoleerde Ribosomen Bevat de peptidyl-tRNA. Voor peptidyl-tRNA <ol><li> Mix 10 pi van de SMB (gesuspendeerd in buffer C) met 10 pi van een laad-buffer die 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,5% (v / v) glycerol, 4% natriumdodecylsulfaat, 2 mM DTT en 0,2 mg / mL broomfenolblauw. Het oplossen van de componenten aan de kralen door het uitvoeren van de monsters in 10% Tris-tricine polyacrylamide gels. </li><li> Droog de gels met behulp van een vacuüm gel-droger. </li><li> Controleer de integriteit en de zuivering van het peptidyl-tRNA door het blootstellen van de gedroogde gel om een ​​X-ray film. </li></ol> Voor ribosomaal RNA <ol start="4"><li> Voeg 190 ul van 2 mM ethyleendiaminetetraacetaat (EDTA) oplossing bereid met DEPC behandeld water en 200 pi van fenol evenwicht gebracht met water, tot 10 ul van een kraal schorsing. Meng de opschorting door krachtige vortexen en scheiden de anorganische fase van de organische fase door centrifugatie bij 10.000 xg gedurende 3 min bij kamertemperatuur. Verzamel de bovenste waterlaag in een nieuwe microbuisjes. </li><li> Neerslag het RNA uit de waterlaag door het toevoegen van 1 / 10 volume van 3 M natriumacetaat, pH 5,2, 1 pi van 20 mg / ml van glycogeen oplossing en twee volumes van ijskoude ethanol. Resuspendeer de RNA in 10 ul van DEPC-behandeld water. </li><li> Controleer de integriteit van de ribosomale RNA's door elektroforese op agarose gels. Meestal, 50 ul van kralen opschorting opbrengst 1μg van ribosomaal RNA. </li></ol> 7. Representatieve resultaten: Figuur 2 presenteert de resultaten van een reeks analyses evaluatie van de kwaliteit en functionaliteit van het vertalen van ribosomen geïsoleerd met behulp van de procedure geschetst. De waarneming van een unieke band opgelost in polyacrylamide gels duidt op de aanwezigheid van polypeptiden gebonden aan de biotine-gelabelde mRNA's verbonden aan het SMB (Figuur 2A). De zuivering van ribosomaal RNA's gebruik van deze procedure stelt de aanwezigheid van ribosomen gebonden aan deze biotine-gelabelde mRNA's, maar ook (Figuur 2B). Toevoeging van puromycine, een antibioticum dat de peptidyl-transferase activiteit van het ribosoom induceert, resulteert in een splitsing van de opkomende peptidyl-tRNA's 1. Dit wordt waargenomen als een verschuiving in het migratiepatroon van het geïsoleerde polypeptide in polyacrylamide gels (figuur 2C). Samen vormen deze gegevens blijkt dat biotine-gelabelde mRNA's verbonden aan het SMB functionele ribosomen bevatten met peptidyl-tRNA's. De isolatie van het vertalen van ribosomen met specifieke peptidyl-tRNA's maakt de studie van de effecten van peptidyl-tRNA's, antibiotica, en andere moleculen, op ribosoom functie (figuur 3A) en op ribosoom structuur (Figuur 3B). In de voorbeelden die hier het antibioticum sparsomycin en het aminozuur tryptofaan (Trp) remmen de hydrolytische splitsing van de ontluikende tnaC-tRNA peptidyl-tRNA veroorzaakt door RF2 in de geïsoleerde ribosomen (Figuur 3A). De interactie van sparsomycin of Trp met het ribosoom induceert ook structurele veranderingen in een aantal nucleotiden dat de 23S rRNA van het vertalen van ribosoom (afb. 3B) vormen. Kortom, de biologisch materiaal verkregen met behulp van de hier beschreven procedure zijn nuttig bij het verkrijgen van extra inzicht in de structurele contacten die betrokken zijn bij de remming van ribosoom-functie op de interactie met verschillende moleculaire factoren. ove_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Procedure die wordt gebruikt voor het produceren en zuiveren het vertalen van ribosomen met peptidyl-tRNA's. DNA-fragmenten ca. 650 bp in lengte, met de tnaC gen en de aangrenzende regio, in de figuur, worden gebruikt als sjablonen bij het ​​opstellen van mRNA's met biotine, [(bio) UMP] mRNA. Deze DNA-fragmenten worden geproduceerd door PCR-procedures met de oligodeoxynucleotides aangegeven op de bovenkant van de figuur. Onderstreepte letters markeren de locatie van de T7 promoter gecodeerd in het nucleotide primer. Vetgedrukte letters geven de Shine-Dalgarno sequentie die wordt gebruikt in de vertaling van de tnaC mRNA sequenties. De T7 promoter in het DNA-fragment wordt herkend door T7 RNA-polymerase dat gebruikt wordt om transcriberen (pijl) de tnaC volgorde en het niet-coderende sequentie stroomafwaarts. Transcriptie wordt beëindigd bij het ​​RNA-polymerase bereikt het 3'-uiteinde van het DNA-fragment, na de rpoBC terminator-sequenties (rpoBC "t"). De stam-lus structuur van de rpoBC terminator beschermt de mRNA van de 3'-5 'exoribonuclease activiteit aanwezig in de cel-vrije extracten gebruikt in de in vitro translatie reacties. De geïsoleerde [(bio) UMP] mRNA's worden gebruikt om de vastgelopen, het vertalen van ribosomen genereren, met behulp van in vitro translatie assays. De tnaC volgorde in de [(bio) UMP] mRNA wordt vertaald door een ribosoom, die stopt wanneer de laatste aminozuur is opgenomen, te wijten aan de afwezigheid van de Release Factor (RF2) uit het reactiemengsel. Het ribosoom-[(bio) UMP] mRNA-complexen geïsoleerd zijn van de totale reactiemengsel met behulp van streptavidine-magnetische-korrels (SMB), die de biotine-gelabelde nucleotiden opgenomen in het mRNA te binden. De kleine en middelgrote bedrijven gebonden aan de ribosoom-[(bio) UMP] mRNA-complexen worden uit de totale reactiemengsel met behulp van een magnetisch veld (MF). <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Structurele en functionele analyse van de geïsoleerde complexen. A) In vitro vertaling reacties werden uitgevoerd met [(bio) UMP] mRNA's waarin het startcodon van het tnaC-gen werd vervangen door een stopcodon. De eindproducten werden geïsoleerd met behulp van streptavidine parels, zoals is aangegeven in figuur 1. Reactieproducten en geïsoleerde moleculen werden vervolgens geanalyseerd door elektroforese op polyacrylamide gels. De tnaC-tRNA en tnaC peptide banden zijn gemarkeerd. B) Totaal RNA werd geïsoleerd uit de vastgelopen complexen met behulp van fenolextractie procedures. Elke geïsoleerde RNA werd opgelost door elektroforese in agarose gels. Ribosomaal RNA (rRNA) worden aangegeven. C) Geïsoleerd complexen die tnaC-tRNA's werden geïncubeerd met (+) of zonder (-) 0,02 mM puromycine (Puro) bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. De tnaC peptide werden gemerkt tijdens de vertaling met behulp van [35S]-methionine (A) of [3H]-proline (B). <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Structurele en functionele analyse van ribosomen met tnaC-tRNA die zijn gebonden aan de antibiotica sparsomycin, of het aminozuur tryptofaan. A) Geïsoleerde complexen die tnaC-tRNA's werden geïncubeerd met (+) of zonder (-) sparsomycin (Spar) of tryptofaan (Trp) bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Later werden de mengsels gemengd met RF2 en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 20 minuten. B) analyse van methylatie veranderingen in de 23S rRNA veroorzaakt door moleculen binden binnen het ribosoom. Geïsoleerde complexen werden vooraf geïncubeerd met (+) of zonder (-) 2 mM Trp of Spar gedurende 5 min bij 37 ° C. Vervolgens werd een alkylerings agent, dimethyl sulfaat, toegevoegd en het mengsel geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende een extra 20 minuten. Totaal RNA werd geëxtraheerd en primer extensie testen werden uitgevoerd met een [32P]-gelabeld oligodeoxynucleotide complementair zijn aan de nucleotiden van 23S rRNA, die zijn verdeeld stroomafwaarts 100 nucleotiden van de gewijzigde nucleotide. De eindproducten van de uitbreiding assays werden opgelost door elektroforese in polyacrylamide gels. De 23S rRNA nucleotiden beïnvloed door de aanwezigheid van de Trp-of Spar worden aangegeven.

<ol><li>Cruz-Vera, L. R., Gong, M., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+produced+by+bound+tryptophan+in+the+ribosome+peptidyl+transferase+center+in+response+to+tnaC%2C+a+nascent+leader+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Changes produced by bound tryptophan in the ribosome peptidyl transferase center in response to tnaC, a nascent leader peptide.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 3598-3603 (2006).</li>
<li>Garza-Ramos, G., Xiong, L., Zhong, P., Mankin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+site+of+macrolide+antibiotics+on+the+ribosome%3A+new+resistance+mutation+identifies+a+specific+interaction+of+ketolides+with+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Binding site of macrolide antibiotics on the ribosome: new resistance mutation identifies a specific interaction of ketolides with rRNA.</a> J. Bacteriol. 183, 6898-6907 (2001).</li>
<li>Gaynor, M., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrolide+antibiotics%3A+binding+site%2C+mechanism+of+action%2C+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Macrolide antibiotics: binding site, mechanism of action, resistance.</a> Curr. Top. Med. Chem. 3, 949-961 (2003).</li>
<li>Polacek, N., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosomal+peptidyl+transferase+center%3A+structure%2C+function%2C+evolution%2C+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The ribosomal peptidyl transferase center: structure, function, evolution, inhibition.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 40, 285-311 (2005).</li>
<li>Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+functions+of+the+large+ribosomal+subunit%2C+a+major+antibiotic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Keio+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the functions of the large ribosomal subunit, a major antibiotic target.</a> Keio J. Med. 57, 1-14 (2008).</li>
<li>Tenson, T., Mankin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics+and+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibiotics and the ribosome.</a> Mol. Microbiol. 59, 1664-1677 (2006).</li>
<li>Xiong, L., Korkhin, Y., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+site+of+the+bridged+macrolides+in+the+Escherichia+coli+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Binding site of the bridged macrolides in the Escherichia coli ribosome.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49, 281-288 (2005).</li>
<li>Child, S. J., Miller, M. K., Geballe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+by+an+upstream+open+reading+frame+in+the+HER-2%2Fneu+transcript%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Translational control by an upstream open reading frame in the HER-2/neu transcript.</a> J. Biol. Chem. 274, 24335-24441 (1999).</li>
<li>Fang, P., Spevak, C. C., Wu, C., Sachs, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nascent+polypeptide+domain+that+can+regulate+translation+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A nascent polypeptide domain that can regulate translation elongation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 4059-4064 (2004).</li>
<li>Janzen, D. M., Frolova, L., Geballe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+translation+termination+mediated+by+an+interaction+of+eukaryotic+release+factor+1+with+a+nascent+peptidyl-tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of translation termination mediated by an interaction of eukaryotic release factor 1 with a nascent peptidyl-tRNA.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 8562-8570 (2002).</li>
<li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosomal+exit+tunnel+functions+as+a+discriminating+gate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate.</a> Cell. 108, 629-636 (2002).</li>
<li>Onouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+peptide-mediated+translation+elongation+arrest+coupled+with+mRNA+degradation+in+the+CGS1+gene+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Nascent peptide-mediated translation elongation arrest coupled with mRNA degradation in the CGS1 gene of Arabidopsis.</a> Genes Dev. 19, 1799-1810 (2005).</li>
<li>Raney, A., Law, G. L., Mize, G. J., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+translation+termination+at+the+upstream+open+reading+frame+in+s-adenosylmethionine+decarboxylase+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulated translation termination at the upstream open reading frame in s-adenosylmethionine decarboxylase mRNA.</a> J. Biol. Chem. 277, 5988-5994 (2002).</li>
<li>Cruz-Vera, L. R., Rajagopal, S., Squires, C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+ribosome-peptidyl-tRNA+interactions+essential+for+tryptophan+induction+of+tna+operon+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Features of ribosome-peptidyl-tRNA interactions essential for tryptophan induction of tna operon expression.</a> Mol. Cell. 19, 333-343 (2005).</li>
<li>Cruz-Vera, L. R., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+Residues+Asp16+and+Pro24+of+tnaC-tRNAPro+Participate+in+Tryptophan+Induction+of+tna+Operon+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Conserved Residues Asp16 and Pro24 of tnaC-tRNAPro Participate in Tryptophan Induction of tna Operon Expression.</a> J. Bacteriol. 190, 4791-4797 (2008).</li>
<li>Cruz-Vera, L. R., Yang, R., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryptophan+inhibits+Proteus+vulgaris+tnaC+leader+peptide+elongation%2C+activating+tna+operon+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tryptophan inhibits Proteus vulgaris tnaC leader peptide elongation, activating tna operon expression.</a> J Bacteriol. 191, 7001-7006 (2009).</li>
<li>Cruz-Vera, L. R., New, A., Squires, C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+features+essential+for+tna+operon+induction%3A+tryptophan+binding+at+the+peptidyl+transferase+center%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Ribosomal features essential for tna operon induction: tryptophan binding at the peptidyl transferase center.</a> J. Bacteriol. 189, 3140-3146 (2007).</li>
<li>Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li>
<li>Kinoshita, Y., Nishigaki, K., Husimi, Y. F. luorescence- <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((isotope-+or+biotin-labeling+of+the+5+%27-end+of+single-stranded+DNA%2FRNA+using+T4+RNA+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">isotope- or biotin-labeling of the 5 '-end of single-stranded DNA/RNA using T4 RNA ligase.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3747-3748 (1997).</li>
<li>Nishigaki, K., Taguchi, K., Kinoshita, Y., Aita, T., Husimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-ligation%3A+an+efficient+method+for+ligating+single-stranded+DNAs+and+RNAs+with+T4+RNA+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Divers%22%5BJournal%5D)">Y-ligation: an efficient method for ligating single-stranded DNAs and RNAs with T4 RNA ligase.</a> Mol Divers. 4, 187-190 (1998).</li>
</ol>

Deze isolatie procedure beschreven in dit rapport is zeer reproduceerbaar. Helaas kan de aanwezigheid van korte peptidyl-tRNA&#39;s uit dezelfde vertaalde sequenties niet gemakkelijk worden vermeden, zoals peptidyl-tRNA&#39;s kunnen komen overeen met 15-20% van het totaal geïsoleerde materiaal (figuur 2C). Deze verontreinigingen kunnen toename van de concentratie bij hogere concentraties van biotine-gelabelde mRNA zijn gebruikt of wanneer de gebruikte cel-vrije extracten oud zijn of zijn geweest hergebruikt meerdere malen. Daarom is het zeer belangrijk om de controle van de kwaliteit en de concentratie van de componenten van de in vitro translatie reacties. Als alternatief, commerciële hoog rendement gereconstitueerd celvrije extracten beschikbaar zijn die gebruikt kunnen worden voor dezelfde doeleinden (PURE-systeem) 18. Met behulp van deze methode is biotine-16-UMP willekeurig opgenomen over de lengte van het doel-mRNA. Er is een mogelijkheid dat sommige ORF&#39;s bevatten uridine traktaten kan hebben opgenomen dit nucleotide gewijzigd in hun sequenties, die hun vertaling. Variabele relatieve concentraties van biotin-16-UTP/UTP moeten worden getest tijdens de synthese van het mRNA in om de meest efficiënte vertaling te verkrijgen. Alternatieve methoden van biotine de etikettering kunnen worden gebruikt, gericht op het 5&#39;-uiteinde, de meest stabiele einde van het mRNA&#39;s. (I) Biotine kan worden bevestigd aan het 5&#39;-uiteinde van het mRNA met behulp van 3&#39;-NH2ATP (3&#39;-amino, 3&#39;-deoxyadenosine trifosfaat) en T4 RNA-ligase 19. (Ii) 5&#39;-uiteinde biotine-gelabelde oligonucleotide kan worden bevestigd aan het 5&#39;-uiteinde van het mRNA met behulp van RNA-T4 ligase ook 20. (Iii) 3&#39;-uiteinde biotine-gelabeld oligodeoxynucleotides om de complementaire sequentie overeenkomen aan het 5&#39;-uiteinde van het mRNA kan ook worden gebruikt om het vertalen van complexen te isoleren. Deze biotine gelabelde oligodeoxynucleotides kunnen worden gehecht aan de SMB voorafgaand aan de isolatie. Later werd de SMB aan de biotine-gelabelde oligodeoxynucleotides kan worden gemengd met de vertaling reactiemengsel zodat interactie mogelijk is met hun complementaire mRNA-sequenties. Na isolatie van de hybride RNA-DNA regio - en het gebied hybridiseren tussen de biotine-gelabelde oligodeoxynucleotide en de mRNA-volgorde - kon worden afgebroken met behulp van RNAse H, het scheiden van de vastgelopen complexen uit de streptavidine kralen. Deze alternatieve methode kan toestaan ​​dat de complexen te worden ingezet in de toekomst structurele analyses met behulp van een hogere resolutie methoden.

<table><tbody><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumacetaat</td><td>Fluka</td><td>63049</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumglutamaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetaat</td><td>Fluka</td><td>09688</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Protein A sepharose 4B slurry-beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9424</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptine-inhibitor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9783</td><td></td></tr><tr><td>Taq-DNA-polymerase</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>201223</td><td></td></tr><tr><td>T7 Maxiprep-kit</td><td>Promega Corp.</td><td>P1300</td><td></td></tr><tr><td>SMB</td><td>Promega Corp.</td><td>Z5482</td><td></td></tr><tr><td>Biotine-16-UTP</td><td>Roche Group</td><td>1388908</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7002</td><td></td></tr><tr><td>PK</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7768</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleenglycol 8000</td><td>Fluka</td><td>81268</td><td></td></tr><tr><td>Foliumzuur</td><td>Fluka</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Fluka</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>tRNA uit &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5816</td><td></td></tr><tr><td>L-aminozuren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LAA21</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fluka</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>magnetische scheidingsstatieven</td><td>Promega Corp.</td><td>Z5342</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van vertalen ribosomen bevattende peptidyl-trna&#39;s voor functionele en structurele analyses

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Onlangs hebben de structurele en biochemische studies gedetailleerde veel van de moleculaire gebeurtenissen die in het ribosoom tijdens de remming van de eiwitsynthese door antibiotica en tijdens de ontluikende polypeptide synthese. Een aantal van deze antibiotica, en de regelgeving ontluikende Polypeptiden meestal in de vorm van peptidyl-tRNA&#39;s, remmen of peptide binding vorming of vertaling beëindiging 1-7. Deze remmende gebeurtenissen kunnen de beweging van het ribosoom te stoppen, een fenomeen aangeduid als &quot;translationeel arresteren&quot;. Vertaling arrestatie veroorzaakt door ofwel een antibioticum of een ontluikende polypeptide is aangetoond dat de expressie van genen die betrokken zijn bij diverse cellulaire functies, zoals celgroei, resistentie tegen antibiotica, eiwit translocatie en celmetabolisme 8-13 reguleren. Kennis van hoe antibiotica en regelgeving ontluikende Polypeptiden alter ribosoom-functie is van essentieel belang als we de volledige rol van het ribosoom in vertaling, in elk organisme te begrijpen. We beschrijven hier een eenvoudige methodologie die gebruikt kan worden om uitsluitend te zuiveren,, voor analyse, die ribosomen vertalen van een specifiek mRNA en met een specifieke peptidyl-tRNA 14. Deze procedure is gebaseerd op de selectieve isolatie van het vertalen van ribosomen gebonden aan een biotine-gelabelde mRNA. Deze translationeel complexen worden gescheiden van de andere ribosomen in hetzelfde mengsel, met behulp van streptavidine paramagnetische kralen (SMB) en een magnetisch veld (MF). Biotine-gelabelde mRNA&#39;s worden gesynthetiseerd door run-off transcriptie testen met behulp van sjablonen als PCR-gegenereerde DNA-fragmenten die T7 transcriptionele promoters bevatten. T7 RNA-polymerase bevat biotine-16-UMP van biotine-UTP; onder onze voorwaarden ongeveer tien biotine-16-UMP moleculen worden opgenomen in een 600 nt mRNA met een 25% UMP inhoud. Deze biotine-gelabelde mRNA&#39;s worden dan geïsoleerd, en worden gebruikt in de in vitro translatie testen uitgevoerd met versie factor 2 (RF2)-lege cel-vrij verkregen extracten van Escherichia coli stammen die wild-type of mutant ribosomen. Ribosomen vertalen van de biotine-gelabelde mRNA sequenties zijn vastgelopen op het stopcodon regio, te wijten aan de afwezigheid van de RF2 eiwit, dat normaal gesproken vervult vertaling beëindiging. Vastgelopen ribosomen met de nieuw gesynthetiseerde peptidyl-tRNA zijn geïsoleerd en verwijderd uit de vertaling reacties met behulp van SMB en een MF. Deze kralen binden biotine-bevattende berichten. De geïsoleerde, translationele complexen, kan gebruikt worden om de structurele en functionele kenmerken van wild type of mutant ribosomaal onderdelen, of peptidyl-tRNA sequenties, alsmede voor het bepalen ribosoom interactie met antibiotica of andere moleculaire factoren 1,14-16 te analyseren. Om te onderzoeken van de functie van deze geïsoleerde ribosoom complexen, kan peptidyl-transferase onderzoeken worden uitgevoerd in de aanwezigheid van het antibioticum puromycine 1. Om te studeren structurele veranderingen in de translationele complexen, kan goed vastgelegde procedures worden gebruikt, zoals i) het verknopen van specifieke aminozuren 14 en / of ii) de bescherming van alkylering assays 1,14,17.

Een belangrijke belemmering voor de biochemische analyses van de ribosomen met ontluikende peptidyl-tRNA&#39;s is de aanwezigheid van andere ribosomen zijn in dezelfde monsters, ribosomen niet betrokken bij de vertaling van de specifieke mRNA-sequentie worden geanalyseerd. We ontwikkelden een eenvoudige methode om uitsluitend te zuiveren,, de ribosomen met de ontluikende peptidyl-tRNA van belang.

Isolatie van vertalen Ribosomen bevattende peptidyl-tRNA&#39;s voor functionele en structurele analyses

Recent structurele en biochemische studies hebben veel van de moleculaire gebeurtenissen gedetailleerd die in het ribosoom plaatsvinden tijdens de inhibitie van de eiwitsynthese ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de structuur en functie te analyseren van zuivere ribosomen die een uniek peptidyl-tRNA bevatten. Dit wordt bereikt door in vitro translatie-assays uit te voeren met celvrije extracten die ontdaan zijn van release-factoren en met biotine-gelabelde mRNA's, om gestagneerde pep-tRNA-ribosoomcomplexen te genereren die gebonden zijn aan de biotine-gelabelde mRNA's. Als tweede stap worden streptavidine-gebonden paramagnetische beads gemengd met de in vitro translatie-assays om interactie mogelijk te maken met de biotine-moleculen in het mRNA.Later worden de beads geëxtraheerd met behulp van magnetische velden, waardoor de gestopte peptid-tRNA-ribosoomcomplexen die aan de mRNAs zijn gebonden, uit de totale reactie worden getrokken. Vervolgens kunnen de gezuiverde peptid-tRNA-ribosoomcomplexen worden gemengd met translationele factoren, zoals release-factoren voor translatie, remmende antibiotica of chemische modificerende agentia om de functie te analyseren. Er worden resultaten verkregen over de inhibitie en structuur van het ribosoom die de remming van hydrolyse van de peptide-tRNA's laten zien en de correlatie hiervan met structurele veranderingen in de ribosomen op basis van peptidetransferase-activiteit of translationele terminatie-assays met behulp van SDS- of Tris-Racin-PAGE-gels en modificatiebeschermingsassays met behulp van ureum-PAGE-gels.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals differentiële centrifugatie, is dat de geïsoleerde monsters grotendeels ribosomen bevatten met slechts één populatie pep tRNA. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van genexpressie, zoals de aard van nascente polypeptiden en de wijze waarop antibiotica de ribosoomfunctie beïnvloeden door het translatieproces te moduleren. Om deze procedure te starten, neem twee gram van een droog e coli bacterieel pellet uit kweekculturen in de log-fase.Was het pellet door het opnieuw te suspenderen in één liter buffer A, gevolgd door centrifugatie bij 5.000 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Na het uitvoeren van twee wasbeurten wordt het resulterende bacteriële pellet opnieuw gesuspendeerd in 40 milliliter buffer A en worden de bacteriële cellen gelyseerd met behulp van een French press onder een druk van 6.000 PSI. Deze druk komt overeen met 600 eenheden bij gebruik van een zuiger van één inch.Verzamel de gedestructureerde suspensie in een schone glazen buis van 50 milliliter. Behandel de gedestructureerde suspensie met één millimolar DIO triol of DTT en centrifugeer het monster bij 30.000 Gs gedurende 30 minuten. Verwijder het resulterende supernatant en herhaal de centrifugeringsprocedure.Bewaar het supernatant dat is verkregen na de tweede centrifugatie en verdeel het uiteindelijke supernatant over microbuisjes. Bevries de aliquots vervolgens snel (flash-freeze) met behulp van een mengsel van droogijs en ethanol of vloeibare stikstof en bewaar de monsters bij -60 of -80 °C.Begin de bereiding van celvrije extracten die zijn uitgeput van RF two door 4,5 milliliters protein A spheros four B slurry-beads te mengen met vijf milliliters van een anti-RF two antiserum. Roteer het mengsel op een rotatiewiel bij kamertemperatuur gedurende één uur. Centrifugeer het mengsel bij 2 500 Gs om de beads van het antiserum te scheiden.Verwijder het supernatant. De beads bevatten nu de anti RF twee-antilichamen en zullen voortaan worden aangeduid als anti RF twee-beads. Was de beads door ze opnieuw te suspenderen in 1 mL buffer bee.Centrifugeer vervolgens de beads zoals voorheen om de anti-RF2-beads van buffer B te scheiden. Herhaal deze wasprocedure tweemaal. Meng na het wassen van de beads één milliliter van het celvrije extract met 150 µL anti-RF2-beads en incubeer dit na de incubatie gedurende twee uur op een draaiwiel bij 4 °C. Centrifugeer het mengsel bij 10.000 ×g om het celvrije extract van de beads te scheiden.Verwijder het supernatant en behandel het opnieuw met nog eens 150 µL anti RF two-beads voordat de incubatie wordt herhaald en er opnieuw een pull-down wordt uitgevoerd. Verdeel de uiteindelijke RF two-depleteerde celvrije extractoplossing in microcentrifugebuisjes van 100 µL per buisje. Vries de aliquots in met behulp van een mengsel van droogijs en ethanol of vloeibare stikstof en bewaar deze bij -60 of -80 °C.Bereid de PCR-reactie voor door het plasmide-template dat de sequenties bevat, oligo-deoxynucleotiden, dNTP's, intact DNA-polymerase en strategy PCR-buffer te combineren. Zodra het PCR-monster is voorbereid, wordt de amplificatiereactie uitgevoerd. Precipiteer het DNA om de PCR-producten te zuiveren door een tiende volume drie molair natriumacetaat pH 5,2 en twee volumes ijskoude ethanol toe te voegen. Na het nogmaals herhalen van de precipitatieprocedure suspenderen we het resulterende DNA in 100 µL dathylpercarbonaat of DEPC-behandeld water.Verifieer de integriteit van de PCR-producten via elektroforese op agarosegels. Doorgaans levert deze procedure 100 microgram van een DNA-product van 600 basenparen op. Bereid een 100 microliter in vitro transcriptie-reactie voor in DEP-behandeld water door vijf microgram van het via PCR gegenereerde DNA-fragment te mengen met ribonucleotiden, biotine-gelabeld UTP en T7-enzymmix.Incubeer het reactiemengsel gedurende drie uur bij 37 °C. Om de hoeveelheid verkregen mRNA te kwantificeren, wordt het DNA-sjabloon geëlimineerd door RNA-vrije DNase toe te voegen. Incubeer de reactie gedurende 10 minuten bij 37 °C.Om de mRNA-producten te zuiveren, wordt het RNA tweemaal neergeslagen door één tiende volume drie molar natriumacetaat pH 5,2 en twee volumes koude ethanol toe te voegen; resuspendeer het neergeslagen mRNA in 100 µL DEPC-behandeld water. Verifieer de integriteit van de biotinyl-gelabelde mRNA-producten door middel van elektroforese op agarosegels. Gewoonlijk levert deze procedure tussen één en twee milligram van een biotinyl-gelabeld mRNA-product van 600 nucleotiden op. Om te beginnen met de isolatie van translerende ribosomen die een peptidyl-tRNA bevatten, wordt een in vitro translatie-reactiemengsel van 500 µL bereid in DEPC-behandeld water.Bereid eerst het gebufferde reactiemengsel voor zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol, en voeg vervolgens 75 µM van elk van de aminozuren toe, behalve het aminozuur dat zal worden vervangen door een radioactief aminozuur. Voeg daarna 20 tot 50 µL van het RF twee-gedepleteerde celvrije extract toe aan de bufferoplossing die de aminozuren bevat. Incubeer het mengsel vijf minuten bij kamertemperatuur om de activering van de ribosomen mogelijk te maken.Zodra de ribosomen zijn geactiveerd, voegt u 10 tot 15 µg biotinyl-gelabelde mRNA's toe aan het monster. Incubeer het reactiemengsel 10 minuten bij 37 °C.Bereid ondertussen drie milliliters streptavidine paramagnetische kralen of SMB voor in buffer C. Voeg na incubatie de SMP-suspensie toe aan het translatiereductiemengsel. Incubeer de nieuwe suspensie 10 minuten bij kamertemperatuur. Scheid de SMB van het mengsel door een magnetisch veld aan te leggen met behulp van magnetische scheidingsstatieven. Resus.Suspendeer de SMB in buffer C en scheid de beads opnieuw met behulp van het magnetische rekje. Nadat deze wasprocedure twee keer is herhaald, worden de beads opnieuw gesuspendeerd in 500 µL buffer C. Bewaar de suspensie op ijs en voer de volgende procedure onmiddellijk uit. Om de peptid TRNA te visualiseren, worden 10 µL van de gesuspendeerde SMB in buffer C gemengd met 10 µL ladingsbuffer; de componenten die aan de beads gebonden zijn, worden gescheiden door de monsters te analyseren op 10% Tris-tric polyacrylamidegels.Droog de gels met een vacuümgeldroger. Verifieer vervolgens de integriteit en zuivering van het peptide TRNA door de gedroogde gel bloot te stellen aan een röntgenfilm. Combineer voor de analyse van het ribosomaal RNA 190 µL van een 2 mM EDTA-oplossing bereid met dpci-behandeld water, 200 µL fenol gelijkgesteld aan water en 10 µL van een kralessuspensie.Meng de resulterende suspensie door krachtig te vortexen. Scheid de anorganische fase van de organische fase door centrifugatie bij 10, 000 Gs gedurende drie minuten. Verzamel bij kamertemperatuur de bovenste waterlaag in een nieuwe microbuis, precipiteer het RNA uit de waterlaag door toevoeging van één tiende volume drie molar natriumacetaat pH 5.2, 1 µL van een 20 mg/mL glycogeenoplossing en twee volumes ijskoude ethanol. Resuspendeer het geprecipiteerde RNA in 10 µL dpci-behandeld water.Verifieer de integriteit van de ribosomale RNA's via elektroforese op niros-gels. Meestal levert 50 µL beat-suspensie één µg ribosomaal RNA op. Hier worden de resultaten gepresenteerd van een reeks analyses waarin de kwaliteit en functionaliteit van geïsoleerde translerende ribosomen worden geëvalueerd.De waarneming van een unieke band die is gescheiden in polyacrylamidegels duidt op de aanwezigheid van polypeptiden die gebonden zijn aan de met biotine gelabelde mRNA's die zijn bevestigd aan de SMB. De zuivering van ribosomale RNA's. Het gebruik van deze procedure bevestigt eveneens de aanwezigheid van ribosomen die gebonden zijn aan deze met biotine gelabelde mRNA's.Toevoeging van puromycine, een antibioticum dat de peptidyltransferase-activiteit van het ribosoom induceert, resulteert in splitsing van de nascente peptidyl-tRNA's. Dit is waarneembaar als een verschuiving in het migratiepatroon van het geïsoleerde polypeptide in polyacrylamidegels. Samen wijzen deze gegevens erop dat biotinyl-gelabelde mRNA's die aan de SMB zijn gebonden, functionele ribosomen met peptidyl-tRNA's bevatten.De isolatie van translerende ribosomen die specifieke peptid-tRNA's bevatten, maakt het mogelijk om de effecten van peptid-tRNA-antibiotica en andere moleculen op de ribosoomfunctie en de ribosoomstructuur te bestuderen. In de hier gepresenteerde voorbeelden remmen het antibioticum parsamyn en het aminozuur tryptofaan de hydrolytische splitsing van de nascente TNAC tRNA peptid-tRNA door RF twee in de geïsoleerde ribosomen.De interactie van tryptofaan of sparsomycine met het ribosoom induceert ook structurele veranderingen in sommige nucleotiden die het 23 S-R-R-N-A van het translatie-ribosoom vormen. Eenmaal beheerst, kan het hoofdgedeelte van deze techniek in vijf uur worden voltooid, mits deze procedures correct worden gevolgd. Andere methoden, zoals cryo-EM, kunnen worden ingezet voor extra structurele analyse om aanvullende vragen te beantwoorden over de structuur van het ribosoom dat unieke Pepin-RNA bevat.

isolation-translating-ribosomes-containing-peptidyl-trnas-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft een protocol voor de extractie van het vertalen van ribosomen van eukaryotische cellen. Eenmaal uitgepakt, worden ribosomen gescheiden in monosomes en polyribosomes door sucrose gradiënt fractionering om verschillende ribosomale populaties te analyseren. Als zodanig is deze methode is de gouden standaard voor de behandeling van de regulering van de vertaling.

Eukaryotische Polyribosome Profiel Analyse

Een techniek om translationeel pauze sites op mRNA te identificeren wordt beschreven. Deze procedure is gebaseerd op isolatie van beginnende Polypeptiden ophopen op ribosomen tijdens in vitro translatie van een doel-mRNA, gevolgd door de grootte analyse van de ontluikende ketens met een denaturerende gelelektroforese.

Isolatie van Ribosoom Bound Nascent Polypeptiden<em&gt; In vitro</em&gt; Om Translationeel Pauze plaatsen langs mRNA identificeren

We beschrijven hier een techniek die nu standaard wordt gebruikt om stabiel gebonden ribosoom ontluikende keten complexen (RNC) te isoleren. Deze techniek maakt gebruik van de ontdekking dat een 17 aminozuur lange SecM "arrestatie sequentie" kan vertaling rek halt toe te roepen in een prokaryotische...

Met behulp van SecM Arrestatie sequentie als een Tool om Ribosoom Bound Polypeptiden Isoleer

Dit protocol illustreert wezenlijke modificaties van polyribosome fractionering om de translatome in vivo CZS monsters te bestuderen. Het maakt het mogelijk globale beoordeling van vertaling en transcriptie regulatie door de isolatie en vergelijking van de totale RNA gebonden RNA fracties ribosoom.

In vivo Ondervraging van het centrale zenuwstelsel Translatome door Polyribosome Fractionation

Veel mRNAs coderend mitochondriale eiwitten zijn geassocieerd met de mitochondriën buitenmembraan. We beschrijven een subcellulaire fractionering procedure gericht op isolatie van gist mitochondriën met de bijbehorende mRNA en ribosomen. Dit protocol kan worden toegepast op cellen onder verschillende omstandigheden gekweekt om de mechanismen van mRNA lokalisatie en translatie gelokaliseerd nabij de mitochondriën onthullen.

Isolatie van mRNA&#39;s geassocieerd met Gist Mitochondriën Mechanismen van Gelokaliseerde Vertaling Studie

Ribosomen spelen een centrale rol in de eiwitsynthese. Polyribosome (polysome) fractionering van sucrose dichtheidsgradiëntcentrifugatie maakt een directe bepaling van de vertaling efficiëntie van de individuele mRNA's op een genoom-brede schaal. Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor biochemische analyse van de ribosoom-en-polysome geassocieerde factoren zoals chaperonnes en signaalmoleculen.

Polysome fractionering en analyse van zoogdieren Translatomes op een genoom-brede schaal

Het vertalen van Ribosoom Afiniteitszuivering (TRAP) kan de celtype-specifieke translatie van mRNA vastleggen. Hier rapporteren we het eerste TRAP-protocol dat zich richt op de isolatie van mRNA in zeldzame celpopulaties van Drosophila-embryo's.

TRAP-rc, vertalen Ribosoom Affiniteitszuivering van Rare Cell Populaties van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo

We presenteren een techniek om translationele (eiwitbiosynthese) complexen snel te stabiliseren met formaldehyde crosslinking in levende gist- en zoogdiercellen. De aanpak maakt het mogelijk om transiënte tussenproducten en dynamische RNA:eiwitinteracties te ontleden. De crosslinked complexen kunnen worden gebruikt in meerdere downstream-toepassingen, zoals in op diepe sequencing gebaseerde profileringsmethoden, microscopie en massaspectrometrie.

Snelle in vivo fixatie en isolatie van translationele complexen uit eukaryote cellen

Dit protocol beschrijft hoe u een polysoomprofiel kunt genereren zonder gebruik te maken van geautomatiseerde gradiëntmakers of gradiëntfractioneringssystemen.

Polysoomprofilering zonder gradiëntmakers of fractioneringssystemen

Co-translationele interacties spelen een cruciale rol bij ontluikende ketenaanpassingen, targeting-, vouw- en assemblagepaden. Hier beschrijven we Selective Ribosome Profiling, een methode voor in vivo, directe analyse van deze interacties in het model eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Wereldwijde identificatie van co-translationele interactienetwerken door selectieve ribosoomprofilering

AviTag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylatie (ALIBi) is een nieuwe optogenetisch geactiveerde methode ontwikkeld voor het labelen en affiniteitszuiveren van subcellulaire populaties van ribosomen voor downstream sequencing en proteomische analyse.

Isolatie van subcellulaire ribosoomsubpopulaties op basis van recombinante peptide-tag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylering

Leer een methode voor de isolatie van vertalende ribosomen met specifieke peptidyl-tRNA's via biotine-gelabelde mRNA's en magnetische extractie. Deze techniek maakt nauwkeurige structurele en functionele analyses van ribosoomdynamica mogelijk.

Isolatie van vertalen Ribosomen bevattende peptidyl-tRNA's voor functionele en structurele analyses

Meer video's verkennen