Murine eilandjes van Langerhans Isolatie

Hallo, ik ben Greg Zott. Ik werk bij het UCSF Diabetes Center in het Bluestone Laboratorium, en vandaag ga ik u het proces laten zien voor het isoleren van muizenoogjes. De procedure omvat het injecteren van een collagenase-oplossing in de alvleesklier van een C3 H donormuis, waarna we die alvleesklier zullen verwijderen, afbreken, de oogjes zullen zuiveren op een fial-gradient en ze vervolgens met de hand zullen kiezen voor uiteindelijke transplantatie in de niercapsule van een diabetische NOD-muis, die onze ontvanger zal zijn.

Voordat we met deze procedure beginnen, hebben we onze ATE-oplossing verdund in een gewijzigde Hanks buffer en we hebben de concentratie aangepast specifiek voor de stam muis die we gebruiken, de C3 H.We hebben ontdekt dat afbraak beter is bij een oplossing van 0,8 mg per duizend collagenase, en die zullen we gebruiken om in de galgang te injecteren om de alvleesklier op te rekken. De procedure vandaag zal worden uitgevoerd door Pavo codre van het diabetescentrum. Hij zal injecteren, de muis openmaken, de darmen blootleggen en vervolgens in de galgang injecteren.

We zullen de muis besproeien met ethanol om het haar te onderdrukken, en we zullen ook verifiëren dat de muis goed geofferd is met een teenprikt. Pavo zal nu de muis openmaken en de darm en de alvleesklier blootleggen met een middenlijnsnede. Het diafragma zal ook worden doorgesneden om te verifiëren dat de muis geofferd is.

Voordat we beginnen, wil ik enkele belangrijke structuren aanwijzen. De maag ligt hier met de alvleesklier eraan vast onder in het duodenum en erboven. Dit is de lever waar we de galblaas en de galgang zullen vinden, die je hier kunt zien.

Dus wat Pavo nu zal doen is dat hij de dunne darm zal isoleren, zal zoeken waar de galgang in de dunne darm komt. Zodra de darm is blootgelegd, klemmen we aan beide kanten van de galgang met muggenklemmen. We hebben gevonden dat dit meer collagenaten toelaat om de alvleesklier binnen te dringen, terwijl andere groepen proberen de klomp bovenop de galgang te richten.

We hebben gevonden dat dit een betere techniek is om het enzym in de alvleesklier te laten komen. Dit is een zachte procedure. Je wilt de darm niet scheuren.

Je wilt de klemmen zachtjes aan beide kanten van de galgang laten liggen. Nu zullen we een galblaas vinden, en zodra de galblaas is blootgelegd, zullen we die gebruiken als leidraad om de collagenase in de galgang te injecteren. Powell gebruikt een 30 gauge naald met een vijf cc spuit die drie ml collagenase-oplossing bevat.

Terwijl hij de galgang binnenkomt, rekt hij die uit met collagenase-oplossing en reist vervolgens door de galgang tot hij dicht bij de darm komt. Terwijl hij naar beneden gaat, wordt de enzymoplossing gepompt in de alvleesklier geïnjecteerd. Nu de alvleesklier opgeblazen is met collagenase-oplossing, gaat Powell de hemostatisten verwijderen en vervolgens de alvleesklier voorzichtig van de darm afscheuren om de muis te verwijderen.

Hij verwijdert het uit de maag. Oké, en vervolgens gebruikt hij de milt als handvat om de alvleesklier op te tillen en snijdt hem dan langzaam weg in de galgang, en dat is het. De alvleesklier wordt neergelegd en vervolgens wordt de milt verwijderd, en daar verwijdert hij het meso-enterisch weefsel, en vervolgens wordt de alvleesklier in een twee ml collagenase-oplossing in een gesteriliseerde glazen fles geplaatst en terug op het ijs geplaatst.

De geïsoleerde alvleesklier die we in de glazen flesjes hebben geplaatst, zal nu ongeveer 17 minuten in een 37 graden waterbad worden geplaatst. We plaatsen ze in een 50 mil conische rek zodat ze niet omhoog drijven. Zodra tijdens het bad, start de timer en begint de vertering.

Zodra de verteringstijd is voltooid, worden de flesjes verwijderd, en vervolgens worden ze zachtjes geschud en verbroken. En zodra het weefsel begint uit elkaar te vallen, wordt de fles op ijs geplaatst. Een steriele zeef wordt geplaatst over een 400 ml beker die wasbuffer bevat.

De alvleesklier-digest wordt vervolgens voorzichtig over de zeef in de wasbuffer gegoten. Voor demonstratiedoeleinden is de kap uitgeschakeld en is het glas van de kap opgeheven, zodat we kunnen zien wat we doen. Zodra de alvleesklier-digest in de beker is gegoten, worden de flesjes gespoeld met dezelfde wasbuffer en wordt de wasbuffer over de zeef geplaatst.

We hebben een spuit gevuld met wasbuffer. We zullen dat gebruiken om het weefsel krachtig door de zeef te spoelen. Het idee is om eventuele losse oogjes die niet aan de matrix zijn bevestigd vrij te maken, maar de membranen en het onverteerde weefsel op de zeef achter te laten.

En wanneer je klaar bent met het wassen van een weefsel, is dit wat je meestal ziet aan het einde van de procedure. Het alvleesweefsel dat zich in de bodem van de buis bevindt, wordt nu overgebracht naar twee 50 mil conische, en het weefsel wordt gewassen, het weefsel wordt gelijkmatig gemengd en vervolgens gelijkmatig verdeeld zodat we een gelijk pelletvolume in elke buis hebben. De beker wordt nu gespoeld met meer wasbuffer.

De zijden worden gespoeld zodat je al het weefsel dat de beker is binnengekomen weer krijgt. Vervolgens wordt het gelijk verdeeld tussen elk van de twee, beide 50 mil. Conische worden vervolgens afgedekt met wasbuffer.

Het weefsel wordt verscheidene keren omgedraaid en vervolgens in een centrifuge geplaatst. Dit is een snelle spin. De centrifuge wordt tot duizend RPM gelaten en vervolgens uitgeschakeld.

Het weefsel is op dit moment erg gevoelig en je wilt ze niet te veel samendrukken. De buizen worden verwijderd en we zullen deze wasstap nog drie keer doen. Dit is het einde van de derde wasbeurt.

De componenten van de 50 mil conische buis worden overgebracht naar de 15 conische buis en gecentrifugeerd voor duizend RPM en vervolgens gestopt. De supernat zal worden verwijderd en het eerste deel van de FI Call zal worden gestart. We zijn op