Name: Isolatie en Cultuur van Cellen van de nefrogene Zone van de embryonale Mouse Kidney (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-22T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Leer de isolatie en cultuur van cellen uit de nefrogene zone van de embryonale muisnier. Deze methode maakt gedetailleerde studies van signaalwegen in nierprogenitorcellen mogelijk voor regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door R01 DK078161 uit NIDDK (LO), postdoctorale fellowships van de American Heart Association (AB), de Wenner-Gren Grondslagen van Zweden en Kungliga Fysiografiska Sällskapet, Lund, Zweden (UB). Aanvullende ondersteuning werd verleend door Maine Medical Center Research Institute kernfaciliteiten voor histopathologie, Bioinformatica en FACS (ondersteund door 2P20RR18789-06) en de MMCRI Animal Facility.

1. Voorbereiden Reagentia voor Kidney spijsvertering <ol><li> 1,5 ml van 0,25% Collagenase A (w / v) en 1% Pancreatine verteren (w / v) oplossing nodig zullen zijn voor de winning van nefrogene zone cellen (NZCs) vanaf 8 E17.5 nieren. Omdat Pancreatine duurt ongeveer 2 uur om op te lossen bij kamertemperatuur, voldoende verteren oplossing voor het grootste aantal van embryonale nieren verwachting dient voorafgaand aan het experiment worden gemaakt. Bereid verteren oplossing door eerst toevoeging van 25 mg Collagenase A tot Fosfaat 10 ml Dulbecco's gebufferde fysiologische zoutoplossing (DPBS) in een helder 15 ml, steriele centrifugebuis. Het is cruciaal dat de DPBS geen calcium of magnesium bevatten, want dit zal interfereren met de enzymatische verteren. Meng oplossing op een nutator gedurende 10 minuten op te lossen Collagenase A. 100 mg Pancreatine Voeg toe aan opgeloste Collagenase Een oplossing en mix op een nutator voor ten minste 2 uur. Als alternatief kan Collagenase A / Pancreatine digest-oplossing worden gemengd op een nutator overnacht bij 4 ° C. Het is raadzaam dat u een masker te dragen, als Collagenase A en Pancreatine gemakkelijk verspreiden in de atmosfeer tijdens de wegen en kan irriteren neus passages. </li><li> Bereid een 5% foetaal runderserum (FBS) (v / v) oplossing in een gebufferde zoutoplossing Hank's (HBSS). Omkeren om te mengen. 1 ml voor elke buis van 8 nieren zal nodig zijn. </li><li> Bereid kweekmedium door aan te vullen keratinocyten serum vrij medium met 1% glutamine (v / v) en 1% penicilline-streptomycine (Penstrep) (v / v). </li><li> Vacht steriele vlakke bodem polystyreen weefselkweek platen (96, 48, 24 of 6 goed) met menselijke fibronectine oplossing bij een concentratie van 5 mg per cm 2 van de groei oppervlak. 5 mg van fibronectine poeder wordt geresuspendeerd in 5 ml steriele H 2 O. Dit wordt verdund 1:25 in steriele DPBS zonder calcium of magnesium en 250 ml is toegevoegd aan elke well van een 24 wells plaat. Platen worden vervolgens geïncubeerd met fibronectine oplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, gevolgd door 1 uur bij 4 ° C. Als alternatief kan plaatjes gedurende een nacht worden geïncubeerd bij 4 ° C. De oplossing wordt dan opgezogen in een laminaire stroming kap voorafgaand aan de toevoeging van medium / cellen. </li></ol> 2. Ontleden Nieren en verwijderen Capsules (uitgevoerd bij kamertemperatuur) <ol><li> Bij E17.5, offeren de moeder met behulp van een procedure goedgekeurd door uw Institutional Animal Care en gebruik Comite, verwijder de baarmoeder, en plaats deze in een petrischaal met DPBS met calcium en magnesium. Onder een microscoop ontleden, gebruik horlogemakers een tang om elk embryo uit de baarmoeder en elk embryo onthoofden. Zodra de hele nest is uit de baarmoeder, transfer van de embryo's een schone petrischaal met daarin genoeg DPBS met calcium en magnesium volledig dekking van de embryo's met achterlating van zo veel bloed en weefsel puin mogelijk te maken. </li><li> Met behulp van een tang, een omtrek incisie in de buikwand van het embryo op het niveau van de navel. Plaats dan het embryo op zijn rug, pin het neer op de schouders met een set van de tang en verwijder de inwendige organen van de longen naar de blaas met behulp van de andere set tang. Met praktijk kan dit gebeuren in een beweging. De nieren moet worden gehecht aan de achterkant van de massa van organen. Als de nieren niet blijft vastzitten aan het ontdoen van de ingewanden organen, kunnen ze voorzichtig worden verwijderd uit het dorsale lichaamswand. Nieren die zijn beschadigd tijdens dit dissectie proces moet worden weggegooid omdat ze de laatste cultuur besmetten met ongepaste celtypen. </li><li> Voorzichtig plagen weg de nieren van de rest van de organen, en zorg ervoor dat de nieren met elkaar verbonden te houden. Houd het weefsel tussen de nieren met een set van pincet en pak de bijnier aan een van de nieren met de andere tang. De bijnier moet worden gehecht aan de nieren capsule. Haal voorzichtig de bijnier en de capsule uit de buurt van rond de buitenkant van de nier, vergelijkbaar met peeling een banaan. Zorg ervoor dat u de nier in tweeën, terwijl peeling, en zeker niet om de nier weefselbeschadiging onder de capsule worden. Verwijder voorzichtig alle resterende capsule evenals de urineleider als deze nog is aangesloten. Herhaal dit met de resterende nier. </li><li> Gebruik een afgezaagd overdracht pipet om de nieren te plaatsen in een 5 ml polystyreen buis van HBSS. Herhaal stap 2.2-2.4 voor elke embryo. Nieren kunnen worden samengevoegd 8 per tube. Met de praktijk, dissectie en verwijdering capsule duurt 2-3 minuten per embryo. </li></ol> 3. Enzymatische vertering van de nieren (Alle stappen bij kamertemperatuur tenzij anders aangegeven) <ol><li> Verwijder de HBSS oplossing van 5 ml buisjes met nieren met een pipet terwijl zorgvuldig vermijden van contact met de nieren. Onmiddellijk toevoegen 1,5 ml van Collagenase A / Pancreatine verteren oplossing voor de 5 ml buis met de nieren voordat u naar het volgende monster. Herhaal dit voor elke buis van de nieren. </li><li> Plaats de buisjes met enzym / nier verteert op een nutator in een voorverwarmde 37 ° C incubator gedurende 15 minuten. 2 minuten vóór devoltooiing van het verteren, voeg 3 pl DNase (1 U / ml) om een ​​verse 5 ml polystyreen buis voor elke vertering wordt uitgevoerd. </li><li> Verteert snel verwijderen van de incubator, voeg 75 ul van FBS en keer 3 keer te mengen. Laten staan ​​op de bank voor 2 minuten. </li><li> Overdracht 1,4 ml van de celsuspensie om de 5 ml polystyreen buis met DNase (1 U / ml), terwijl de resterende 0,2 ml celsuspensie en nieren achter. De extra 0,2 ml van de oplossing achtergelaten zal onzuiverheden zoals extracellulaire matrix bevatten. </li><li> Mix celsuspensie / DNase op een nutator in een voorverwarmde 37 ° C incubator gedurende 10 minuten. </li><li> Snel verwijderen celsuspensies van de incubator en overdracht elk een 1,5 ml Eppendorf buis. Spin celsuspensies in microfuge bij 325 g gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder supernatant van cel pellet en resuspendeer pellet in 1 ml van 5% FBS / HBSS, en neer te pipetteren 5 tot 6 keer. Cap elke buis voordat u naar het volgende monster. </li><li> Spin celsuspensies in een microcentrifuge bij 325 g gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder supernatant en voeg 0,5 ml van keratinocyten serum vrij medium (KSFM) met additieven aan elke buis en dop tube voordat hij naar het volgende monster. Na het medium is toegevoegd aan alle buizen, voorzichtig resuspendeer elke cel pellet door en neer te pipetteren 5 tot 6 keer met een 1 ml micropipet. Combineer alle celsuspensies in een frisse 5 ml polystyreen buis. </li><li> Pre-nat twee 40 micron cel-zeef caps geplaatst op een 5 ml polystyrol ronde bodem buis met KSFM per monster. Passeren celsuspensies door middel van een cel zeef cap door de overdracht met een 1 ml micropipet. Vermijd het aanraken van het filter met de pipetpunt. Verzamel doorstroming en herhaal filtratie door de tweede zeef dop. Verwijder de cel filter dop en te vervangen door een nieuwe pet van een normale 5 ml polystyreen buis. </li><li> Tellen cellen met een hemocytometer of een andere cel tellen apparaat en overdracht cellen aan putjes van een fibronectine gecoate cultuur plaat bij een dichtheid van 100,000-200,000 cellen per cm 2, verdunnen indien nodig met KSFM met additieven. Over het algemeen halen we ongeveer 4.5x10 6 cellen per 10 embryo nest. </li><li> Incubeer cellen in een 37 ° C bevochtigde incubator met 5% CO 2. </li><li> Laat cellen om te herstellen en voor 2-4 uur in middelgrote hechten voorafgaand aan de stimulatie met extra reagentia. Stimuleer cellen met samengestelde interest van 1 tot 48 uur. Zuiver RNA voor PCR analyse met behulp van de Qiagen RNeasy Micro Kit volgens de instructies van de fabrikant of volg de onderstaande instructies om fluorescent immunostain de cellen. </li></ol> 4. Voorbereiden Reagentia voor de fixatie van cellen en Immunokleuring <ol><li> Bereid 4% PFA: Los 4% paraformaldehyde in PBS (v / v) bij 55 ° C met regelmatige agitatie. Afkoelen tot kamertemperatuur vóór gebruik. Deze oplossing is giftig en moet worden weggegooid in aangewezen afvalcontainers. </li><li> Bereid permeabilisatie oplossing door toevoeging van Triton X-100 naar PBS tot een 0,3% (v / v) oplossing te verkrijgen. </li><li> Bereid een 5%-oplossing te blokkeren in PBS met serum van dezelfde soort als werd gebruikt om het secundaire antilichaam te gebruiken verhogen. Bijvoorbeeld, als u een konijn de opsporing van antilichamen tegen uw doelgroep antigeen met een ezel anti-Rabbit Alexa Fluor 568, bereiden een blokkerende oplossing met 5% ezel serum. Bewaren bij 4 ° C. </li><li> Bereid primaire antistof-oplossing door het toevoegen van de juiste concentratie van antilichaam aan 5% blokkeren oplossing. </li><li> Bereid secundair antilichaam oplossing direct voor gebruik. Voeg fluorofoor geconjugeerd antilichaam in de aanbevolen concentratie van de fabrikant, samen met de nucleaire tegenkleuring DAPI en andere organellen merkers zoals phalloidin tot 5% blokkeren oplossing. Indien opslag is niet vereist, houd oplossing in het donker bij 4 ° C tot gebruik. </li><li> Bereid 50% glycerol / PBS-oplossing (v / v) voor de opslag van immunostained cellen. Als alternatief kan Vectashield worden gebruikt. </li></ol> 5. Fixatie van cellen en Immunokleuring <ol><li> Het volgende protocol is ontworpen voor fixatie en kleuring van NZCs in een 24 wells plaat. Gegeven volumes zijn voor een goed. Reagentia moeten voorzichtig worden gepipetteerd tijdens alle stappen om loslating van cellen te voorkomen, en de plaat opwinding wordt niet aanbevolen bij de incubatie stappen. </li><li> Voorzichtig verwijderen medium met een 1 ml micropipet en voeg 0,5 ml van 4% PFA bijgevoegde gekweekte cellen. Incubeer gedurende 15 minuten ongestoord bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de 4% PFA en voeg 0,5 ml per putje van permeabilisatie oplossing. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder permeabilisatie oplossing en voorzichtig twee keer spoelen met 0,5 ml PBS per spoelen. </li><li> Voeg 0,5 ml van het blokkeren van oplossing en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten. </li><li> Verwijder de blokkering oplossing en voeg 0,225 ml primair antilichaam oplossing. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur of overnacht bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de primaire antistof-oplossing en voorzichtig riNSE tweemaal met 0,5 ml PBS per spoelen. </li><li> Voeg 0,225 ml secundaire antilichaam oplossing. Incubeer plaat in het donker bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten. </li><li> Verwijder secundair antilichaam-oplossing en voorzichtig twee keer spoelen met 0,5 ml PBS per spoelen. </li><li> Voeg 0,3 ml 50% glycerol / PBS-oplossing (v / v) of genoeg Vectashield naar onderkant van goed bedekken. </li><li> Afbeelding cellen met epifluorescentiemicroscoop of op te slaan in folie gewikkeld bij 4 ° C. </li></ol> 6. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2555/2555fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. NZCs werden gezuiverd van E17.5 embryo's, geplateerd op 200.000 cellen per cm 2 en geïncubeerd bij 37 ° C voor een totaal van 24 uur. Cellen werden afgebeeld door de fase-contrast met een Leica DM IRB omkeermicroscoop voorafgaand aan de immunofluorescentie kleuring. (A) 20X fase contrast van NZCs na 24 uur in de cultuur. (B) Cellen werden gefixeerd en gekleurd met behulp van een konijn anti-PAX2 antilichaam specifiek voor nefron progenitor cellen (rood) en een secundaire Alexa Fluor 568 geconjugeerd ezel anti-Rabbit. Opmerking blauwe kernen tegengekleurd met DAPI. (C) 40X fase contrast van een cluster van nefron voorlopers (gecentreerd) na 24 uur in de cultuur. (D) 40X beeld van NZCs geïsoleerd van LacZ + embryo's van de Foxd1 LacZ stam, die β-galactosidase tot uitdrukking onder de controle van de Foxd1 promotor. Foxd1 wordt uitgedrukt in de stromale cel populatie binnen de nefrogene zone van de zich ontwikkelende nier. Cellen werden gekleurd met de F-actine marker phalloidin (Oregon groen primaire conjugaat), de nucleaire vlek DAPI (Blue) en konijn anti-β-galactosidase (secundair - Alexa Fluor ezel anti-Rabbit 568) voor de detectie van Foxd1 + stromale cellen ( rood).

<ol><li>Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP7+promotes+proliferation+of+nephron+progenitor+cells+via+a+JNK-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism.</a> Development. 136, 3557-3566 (2009).</li>
<li>Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlas+of+gene+expression+in+the+developing+kidney+at+microanatomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution.</a> Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).</li>
<li>Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+BMP7+expression+during+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of BMP7 expression during kidney development.</a> Development. 125, 3473-3482 (1998).</li>
<li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inductive+epitheliomesenchymal+interaction+in+cultured+organ+rudiments+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse.</a> Science. 118, 52-55 (1953).</li>
<li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenetic+interaction+between+embryonic+mouse+tissues+separated+by+a+membrane+filter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter.</a> Nature. 172, 869-870 (1953).</li>
<li>Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+stromal+mesenchyme+in+kidney+morphogenesis+revealed+by+targeted+disruption+of+Winged+Helix+transcription+factor+BF-2%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2.</a> Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).</li>
<li>Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFb+superfamily+signals+are+required+for+morphogenesis+of+the+kidney+mesenchyme+progenitor+population%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population.</a> Development. 131, 4593-4605 (2004).</li>
<li>Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).</li>
<li>Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+regulates+proliferation+and+differentiation+of+mesenchymal+cells+in+the+mouse+metanephric+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney.</a> Development. 129, 5301-5312 (2002).</li>
</ol>

In dit protocol beschrijven we een methode om te isoleren en cultuur cellen uit de nefrogene zone van de embryonale nier. Het is de ontwikkeling van een methode in eerste instantie gepubliceerd als onderdeel van een studie van de effecten van BMP7 behandeling op de cellen van de nefrogene zone (Blank et al.., 2009). In de eerste studie werden een reeks experimenten om de cel te typen vertegenwoordigd in de NZC populatie karakteriseren uitgevoerd. Kortom, zuivering van NZCs van genetische verslaggevers voor de c...

<table><tbody><tr><td>Horlogemakerspincet #5&amp;rsquo;</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-4905</td><td>2 paren vereist</td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Roche Group</td><td>10 103 578 001</td><td>Masker dragen</td></tr><tr><td>Porciene pancreatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8096</td><td>Masker dragen</td></tr><tr><td>DPBS m. Ca, Mg</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-513F</td><td>Met Mg &amp;amp; Ca</td></tr><tr><td>Foetaal runderserum (FBS)</td><td>BioWhittaker</td><td>14-901E</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>KSFM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10724-011</td><td>zonder toegevoegde groeifactoren</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>Gebruiken @ 1% v/v</td></tr><tr><td>PenStrep 10,000 U penicilline / ml 10 mg streptomycine / ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>Gebruiken @ 1% v/v</td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>BD Biosciences</td><td>356008</td><td>Geleverd als poeder</td></tr><tr><td>Kweekplaat met 24 wells</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>142485</td><td>Nunclon</td></tr><tr><td>DPBS z. Mg &amp;amp; Ca</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Polystyreen buisjes van 5mL</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>DNase (1 U/&amp;mu;l)</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015</td><td>4 &amp;#x03BC;l per 1.5 ml</td></tr><tr><td>Cell-strainer van 40 micron </td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>m. dop en buisje</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Gebruiken @ 4 % w/v</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>VWR international</td><td>VW3929-2</td><td>Gebruiken @ 0.3 % v/v</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td>Geleverd als poeder</td></tr><tr><td>Ezelserum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td> Gebruiken @ 5 % v/v</td></tr><tr><td>Konijn anti-PAX2 </td><td>Invitrogen</td><td>71-6000</td><td>Verdunnen 1:100</td></tr><tr><td>Konijn anti-&amp;#946;-gal</td><td>MP Biomedicals</td><td>559762</td><td>Verdunnen 1:200</td></tr><tr><td>Oregon Green 488 phalloidine</td><td>Invitrogen</td><td>O7466</td><td>Verdunnen 1:200</td></tr><tr><td>Ezel anti-konijn Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td>Verdunnen 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Verdunnen 1:5000</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-6</td><td>Meng 50 % met H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Gebruik &quot;DNase op kolom&quot; protocol</td></tr><tr><td>Transferpipetten, 3ml</td><td>BD Biosciences</td><td>357575</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en cultuur van cellen van de nefrogene zone van de embryonale mouse kidney

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonale ontwikkeling van de nier is reeds uitgebreid bestudeerd, zowel als een model voor epitheliale-mesenchymale interactie in organogenese en om begrip van de oorsprong van aangeboren nierziekte te krijgen. Meer recent heeft de mogelijkheid van sturing naïeve embryonale stamcellen in de richting van nefrogene lot onderzocht in de opkomende gebied van de regeneratieve geneeskunde. Genetische studies in de muis hebben een aantal wegen die nodig zijn voor nier-ontwikkeling, en een globale catalogus van gentranscriptie in het orgel is onlangs gegenereerd <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a> , het verstrekken van een groot aantal kandidaat-regulatoren van essentiële ontwikkeling functies. Organogenese van het knaagdieren nier kan worden bestudeerd in orgelcultuur, en vele rapporten hebben gebruik gemaakt van deze aanpak om de resultaten te analyseren van een van beide het toepassen van de kandidaat-eiwitten of slopen van de expressie van genen met behulp van siRNA of morpholinos. Echter, is de toepasselijkheid van de orgelcultuur op de studie van signalering die stam / voorlopercellen celdifferentiatie versus vernieuwing regelt in de ontwikkelingslanden nier beperkt gekweekte organen bevatten een compacte extracellulaire matrix het beperken van de verspreiding van macromoleculen en virusdeeltjes. Naar de cel signaleren gebeurtenissen die de stam / voorlopercellen cell niche in de nieren hebben we een primaire cel systeem dat de nefrogene zone of stamceltransplantatie niche van de zich ontwikkelende nier ex vivo los van de epitheliale inductor van differentiatie stelt invloed te bestuderen. Met behulp van beperkte enzymatische vertering, kan nefrogene zone cellen worden selectief bevrijd van de ontwikkeling van de nieren bij E17.5. Na filtratie, kunnen deze cellen worden gekweekt als een onregelmatige monolaag met behulp van optimale condities. Markergen analyse toont aan dat deze culturen een verdeling van celtypen kenmerk van de nefrogene zone in vivo bevatten, en dat ze te onderhouden bijbehorende markering genexpressie tijdens de cultuur periode. Deze cellen zijn zeer toegankelijk is voor kleine moleculen en recombinant eiwit behandeling, en vooral ook om virale transductie, die sterk vergemakkelijkt de studie van de kandidaat-stam / voorlopercellen cel regulator effecten. Fundamentele celbiologische parameters zoals proliferatie en celdood, alsook veranderingen in de expressie van moleculaire merkers kenmerk van nefron stam / voorlopercellen cellen in vivo kunnen succesvol gebruikt worden als experimentele resultaten. De lopende werkzaamheden in ons laboratorium het gebruik van deze nieuwe primaire cel techniek heeft tot doel te ontdekken basis mechanismen voor de regulatie van zelfvernieuwing versus differentiatie in nefron stam / progenitorcellen.

In dit rapport beschrijven we een methode voor de isolatie en de cultuur van de progenitor cel niche van de embryonale muis nier die gebruikt kan worden om signaalwegen reguleren van stam / voorlopercellen van de zich ontwikkelende nier te bestuderen. Deze gekweekte cellen zijn zeer toegankelijk is voor kleine moleculen en recombinant eiwit behandeling, en vooral ook om virale transductie, die een efficiënte manipulatie van de kandidaat-wegen mogelijk maakt.

Isolatie en Cultuur van Cellen van de nefrogene Zone van de embryonale Mouse Kidney

De embryonale ontwikkeling van de nier is uitgebreid bestudeerd, zowel als model voor epitheliale-mesenchymale interactie bij organogenese als om inzicht te krijgen in ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van een primaire cultuur van cellen uit de nefrogene zone van de ontwikkelende nier. Dit wordt bereikt door eerst de nieren te dissekeren uit embryo's van dag 17.5. De volgende stap van de procedure is het verwijderen van de nierecapsules.Vervolgens wordt een beperkte enzymatische digestie van de organen uitgevoerd om cap-mesenchym en corticale stromacellen uit de nefrogenerische zone los te maken. De laatste stap van de procedure is het uitplaten van de cellen in fibronectine en het kweken in serumvrij medium. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een gezuiverde populatie cellen uit de nefrogenerische zone aantonen middels immunokleuring van specifieke markers.Hoewel deze methode kan worden gebruikt om cel-signalering te bestuderen, kan deze ook worden toegepast om de substraateisen voor cellulaire expansie te begrijpen. Voor engraftment-technieken zullen de procedure worden gedemonstreerd door Derek Adams, een technicus in mijn laboratorium, en Aaron Brown, een postdoc in mijn laboratorium. Nadat de benodigde oplossingen zijn bereid en de weefselkweekschalen zijn behandeld volgens het schriftelijke protocol, begi

isolation-culture-cells-from-nephrogenic-zone-embryonic-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video describes the method to isolate intact glomeruli from mouse kidneys. The encapsulated and decapsulated glomeruli thus obtained can further be used for culturing parietal epithelial cell outgrowths from the murine kidney.

Glomeruli Isolation: A Technique to Obtain Intact Glomeruli from Murine Kidney

In this video, we demonstrate the steps to isolate and purify renal tubular epithelial cells for a wide range of molecular biology and cell culture studies.

Murine Renal Cell Isolation: A Technique to Isolate and Generate Primary Culture of Renal Tubular Epithelial Cells

Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren en cultiveren van metanefrische rudimenten uit muisembryo's.

Dissectie en Cultuur van Muis Embryonale Nier

Hier presenteren we een nieuwe klinische rang isolatie en cultuur methode voor nieren gerelateerde stromale cellen (kPSCs) op basis van hele orgel perfusie met spijsverteringsenzymen en NG2-cel verrijking. Met deze methode is het mogelijk om het verwerven van voldoende cel nummers voor cellulaire therapie.

Een nieuwe klinische Grade isolatie methode voor menselijke nieren gerelateerde stromale cellen

Dit protocol biedt een rendabele aanpak om te isoleren en karakteriseren van muis primaire renale tubulaire cellen die vervolgens sub kunnen worden gekweekt om te beoordelen renale biologische functies- ex vivo, met inbegrip van de mitochondriale Bioenergetica.

Isolatie, karakterisering en High Throughput extracellulaire Flux-analyse van muis primaire renale tubulaire epitheliale cellen

De belangrijkste focus van dit protocol is efficiënt isoleren levensvatbare primaire glomeruli culturen met minimale contaminanten voor gebruik in een verscheidenheid van downstream toepassingen. De geïsoleerde glomeruli structurele relaties tussen component celtypes behouden en kunnen gekweekte ex vivo voor een korte tijd.

Een efficiënte zeven methode te isoleren Intact Glomeruli van de nier van volwassen ratten

Dit artikel beschrijft een methode voor het kweken en analyseren van glomerulaire pariëtale epitheelceluitgroeien van ingekapselde glomeruli geïsoleerd van de muis nier. Deze methode kan worden gebruikt om trajecten te bestuderen die betrokken zijn bij pariëtale epitheelcelproliferatie en migratie.

Glomerular Outgrowth als een Ex Vivo Assay om trajecten betrokken bij pariëtale epitheelcelactivering te analyseren

Hier presenteren we een protocol om hoogwaardige kernen uit bevroren muizennieren te isoleren die de representatie van medullaire nierceltypen verbeteren en de genexpressieartefacten van enzymatische weefseldissociatie vermijden.

Nuclei-isolatie van volwassen muizennier voor single-nucleus RNA-sequencing

Deze studie ontwikkelde een geoptimaliseerd protocol voor de isolatie van muizen mesangiale cellen (MC's) en hun ex vivo celcultuur. Deze cellen kunnen meerdere keren worden gepasseerd, ingevroren, nieuw leven ingeblazen en gekweekt zonder de celgroei of eiwitexpressie in gevaar te brengen.

Optimalisatie van isolatie en zuivering van muriene glomerulaire mesangiale cellen

Een robuuste en reproduceerbare methode om 2D-primaire culturen van met zona glomerulosa- en zona-fasciculata-verrijkte cellen te vestigen werd ontwikkeld voor de bijnierschors van de muis. Dit systeem behoudt belangrijke moleculaire en functionele kenmerken van elke zone, waardoor gericht onderzoek mogelijk is naar signaalroutes, hormoonproductie en bijniercorticale celgedrag ex vivo.

Vestiging van zone-verrijkte primaire culturen uit de bijnierschors van de muis

Leer de isolatie en cultuur van cellen uit de nefrogene zone van de embryonale muisnier. Deze methode maakt gedetailleerde studies van signaalwegen in nierprogenitorcellen mogelijk voor regeneratieve geneeskunde.

Isolatie en Cultuur van Cellen van de nefrogene Zone van de embryonale Mouse Kidney

Meer video's verkennen