Isolatie en Cultuur van Cellen van de nefrogene Zone van de embryonale Mouse Kidney

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van een primaire cultuur van cellen uit de nefrogene zone van de ontwikkelende nier. Dit wordt bereikt door eerst de nieren te dissekeren uit embryo's van dag 17.5. De volgende stap van de procedure is het verwijderen van de nierecapsules.

Vervolgens wordt een beperkte enzymatische digestie van de organen uitgevoerd om cap-mesenchym en corticale stromacellen uit de nefrogenerische zone los te maken. De laatste stap van de procedure is het uitplaten van de cellen in fibronectine en het kweken in serumvrij medium. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een gezuiverde populatie cellen uit de nefrogenerische zone aantonen middels immunokleuring van specifieke markers.

Hoewel deze methode kan worden gebruikt om cel-signalering te bestuderen, kan deze ook worden toegepast om de substraateisen voor cellulaire expansie te begrijpen. Voor engraftment-technieken zullen de procedure worden gedemonstreerd door Derek Adams, een technicus in mijn laboratorium, en Aaron Brown, een postdoc in mijn laboratorium. Nadat de benodigde oplossingen zijn bereid en de weefselkweekschalen zijn behandeld volgens het schriftelijke protocol, begint de dissectie van de embryonale muisnier door de moeder op E 17.5 te offeren.

Verwijder, overeenkomstig de richtlijnen van uw instelling, de baarmoeder en plaats deze in een Petrischaal met enkele milliliters DPBS, gebufferde zoutoplossing of DPVS met calcium en magnesium. Gebruik onder een dissectiemicroscoop horlogemakerspincetten om elk embryo te verwijderen en een tweede paar pincetten voor de decapitaties. Zodra het gehele nest uit de baarmoeder is gehaald en gedecapiteerd, brengt u de embryo's over naar een schone Petrischaal met voldoende DPBS met calcium en magnesium om de embryo's te bedekken.

Laat voor elk embryo zoveel mogelijk bloed en weefselresten achter, maak met een pincet een cirkelvormige incisie in de buikwand op het niveau van de navelstrengen. Plaats het embryo vervolgens op de rug en zet de schouders vast met één pincet. Verwijder met een tweede pincet de interne organen, van de longen tot de blaas.

De nieren zijn bevestigd aan de achterzijde van de massa van interne organen. Scheid vervolgens voorzichtig de nieren van de rest van de organen. Let erop dat de nieren met elkaar verbonden blijven.

Houd vervolgens het weefsel tussen de nieren vast met één set pincetten en pak de bijniersklier die aan het kapsel van een van de nieren vastzit met de andere pincet. Pel het kapsel voorzichtig van de nier af. Wees voorzichtig om de nier niet te beschadigen.

Zorg ervoor dat alle resterende capsule van de nier en van de uterus, indien nog vastgehecht, wordt verwijderd. Herhaal dit voor de overige nier. Snijd tenslotte een transferpipet op de juiste diameter en breng de nieren voorzichtig over in een polystyreen buis van 5 mL met HBSS.

Herhaal de isolatie van de nieren voor elk embryo en voeg de nieren in de buis samen, tot maximaal acht nieren per buis, in een steriele omgeving. Begin het proces van enzymatische digestie door eerst de HBSS-oplossing uit de buis van vijf milliliter met de nieren te verwijderen met een pipet. Zorg ervoor dat u de nieren niet aanraakt en voeg onmiddellijk 1,5 milliliter collagenase toe, een Pancreatin-digestie-oplossing.

Herhaal dit voor elke buis met nieren en sluit de buizen af. Plaats ze vervolgens op een mutator in een incubator van 37 °C gedurende 15 minuten. Vlak voor het einde van de incubatie voegt u drie µL van one unit per µL DNAs toe aan een nieuwe polystyreen buis van vijf ml voor elke digestie die wordt uitgevoerd.

Verwijder na de incubatie snel het digestaat uit de incubator, voeg 75 µL FBS toe en keer de buis drie keer om om te mengen. Laat dit twee minuten bij kamertemperatuur staan. Breng vervolgens 1,4 mL van de cel-suspensie over naar een polystyreen buis van vijf milliliter die DNAs Mix bevat en plaats deze 10 minuten op een rotator in een incubator van 37 °C.

Breng na de incubatie elke celsuspensie over naar een Eppendorf-buis van 1,5 milliliter en centrifugeer 5 minuten bij 325 ×g. Verwijder vervolgens het supernatant. Resuspendeer het pellet in één milliliter 5% FBS in HBSS door de vloeistof vijf tot zes keer met een pipette op en neer te zuigen.

Sluit elke buis af voordat u naar het volgende monster gaat. Verwijder na centrifugatie de SNAT en voeg 500 µL KSFM met additieven aan elke buis toe, nadat het medium aan alle buizen is toegevoegd. Resuspendeer elke celpellet voorzichtig door vijf tot zes keer op en neer te pipetteren met een 1 mL micropipet. Combineer alle celsuspensies in een nieuwe polystyreen buis van 5 mL.

Filtreer nu de cel-suspensie door een vooraf bevochtige cell strainer cap van 40 micron en vang het filtraat op in een nieuwe polystyreenbuis. Vermijd contact tussen de pipetpunt en de zeef zodra al het filtraat is opgevangen. Filtreer het filtraat voor een tweede maal door een nieuwe, vooraf bevochtigde cell strainer.

Verwijder de zeef en sluit de buis af met een nieuwe steriele dop van een nieuwe buis. Tel de cellen en zaai deze uit met een dichtheid van 100 000 tot 200 000 cellen per vierkante centimeter in KSM met additieven in een fiber-encoded kweekplaat. Laat de cellen van de nefrogene zone herstellen en hechten in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende twee tot vier uur voordat er enige stimulatie voor experimenten plaatsvindt.

Hier wordt een fasecontrastafbeelding (20x) getoond van cellen uit de nefrogene zone, geplaatseem op 200 000 cellen per vierkante centimeter en gedurende 24 uur gekweekt. In deze afbeelding zijn de cellen uit de nefrogene zone gekleurd met een anti-PAX2-antilichaam, dat specifiek is voor nefron-progenitorcellen en in het rood wordt weergegeven, terwijl de kernen in het blauw zijn tegengekleurd met DAPI.

Een fasecontrastbeeld van een cluster nefron-progenitoren wordt getoond bij een 40x vergroting. Om de specificiteit verder aan te tonen, werden nefrogene zonecellen geïsoleerd uit embryo's waarin laxy onder controle stond van de Fox D one-promotor, die tot expressie komt in de stromale celpopulatie. Binnen de nefrogene zone van de ontwikkelende nier werden de cellen vervolgens gekleurd met DAPI voor kernen in blauw, phalloidine voor F-actine in groen en anti-beta-lactamase in rood.

Zodra de methode onder de knie is, kan er in ongeveer twee uur een monolaag primaire cultuur van cellen uit de nefrogene zone worden gegenereerd. Deze culturen maken snelle high-throughput studies mogelijk naar cel-signaleringspaden tijdens de ontwikkeling van nefronprogenitoren, aangezien ze zeer geschikt zijn voor virustransductie, behandeling met recombinante eiwitten en behandeling met kleine moleculen. Daarnaast kunnen verdere cel-sorteerprocedures worden gebruikt om specifieke celtypen uit deze culturen te isoleren.