Name: Modified ES / OP9 co-cultuur protocol biedt verbeterde Karakterisatie van hematopoietische Progeny (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Leer een gemodificeerd ES/OP9 co-cultuurprotocol voor hematopoietische differentiatie met mStrawberry OP9 stromale cellen. Deze methode maakt volledige karakterisatie van alle ES-afgeleide progenitorcellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken U. Ganapati voor het opzetten en testen van de mStrawberry OP9 cellijn. Bovendien, wij danken H. Shafifor haar hulp bij de co-cultuur. HP wordt ondersteund door een beurs van de National Heart, Lung, and Blood Institute (F31HL087714) (HP). De inhoud van dit werk is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteur en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Heart, Lung, and Blood Institute of van de National Institutes of Health (NIH). De UCLA Flow Cytometry Core Facility wordt ondersteund door het NIH (CA-16042-en AI-28697), de Jonsson Cancer Center, het UCLA Aids Institute, en de UCLA School of Medicine.

1. Voorbereiding van de ES-cellen <ol><li> Cultuur ES-cellen volgens de standaard protocol voor uw specifieke cellijn. Zorg ervoor dat u voldoende ES cellen voor te bereiden op plaat op van de mStrawberry OP9 cellen voor Dag van 0 (ES-cellen worden uitgeplaat op 1x10 ^ 3 cellen per cm 2 op dag 0) </li></ol> 2. Voorbereiding van de OP9 cellen <ol><li> Voordat groeiende mStrawberry OP9 cellen, de voorbereiding van de OP9 groeimedia OP-9 celcultuurmedium <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Voorraad </td><td> Final conc. </td><td> Volume (ml) </td></tr><tr><td> aMEM </td><td></td><td></td><td> 39,5 </td></tr><tr><td> FBS (OP-9 getest) </td><td> 100% </td><td> 20% </td><td> 10 </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> 100X (200mm) </td><td> 2 mM </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50ml </td></tr></tbody></table> Bewaren bij 4 ° C en te gebruiken binnen een week van voorbereiding </li><li> Met het oog op mStrawberry OP9 cellen te behouden, moeten de media worden veranderd om de 2 dagen en cellen moeten voorafgaand aan de cellen te bereiken confluentie (subcultuur bij 70-90% confluentie) worden subcultuur. mStrawberry OP9 celkweken zijn nooit groter geworden dan 90% confluentie, omdat dit zal resulteren in hun differentiatie tot adipocyten. Zie figuur 3. <ol class="lalpha"><li> Subcultuur cellen door cellen te wassen 2X met PBS (of 1x met PBS + 1x 0,1% met trypsine-EDTA) </li><li> Voeg voorverwarmde 0,1% trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 5 minuten (of tot de cellen los) </li><li> Wanneer de cellen hebben losgemaakt, voeg OP-9 groeimedium. Overdracht cellen om een ​​50 ml conische buis. </li><li> Pellet cellen op 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder supernatans. </li><li> Resuspendeer cellen in verse mStrawberry OP9 groeimedia </li><li> Plaat cellen met een minimum dichtheid van 10 4 cellen / cm 2 </li><li> Grow mStrawberry OP9 cellen confluentie vanaf 3 dagen voor dag die nodig zijn voor co-kweken van embryonale stamcellen (dag 0, dag 5, of Day8 / 9 van het experiment) </li></ol></li></ol> 3. ES / mStrawberry OP9 Co-cultuur <ol><li> Bereid Co-cultuur differentiatie media <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Voorraad </td><td> Finale </td><td> Volume (ml) </td></tr><tr><td> aMEM </td><td></td><td></td><td> 39,5 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 100% </td><td> 20% </td><td> 10 </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> 200MM </td><td> 2 mM </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50ml </td></tr></tbody></table></li><li> mStrawberry OP9 cellen (dag -3) <ol class="lalpha"><li> ALTIJD Subculture OP9 cellen op dag -3, zodat u de samenvloeiing lagen mStrawberry OP9 cellen voor dag 0 van de co-cultuur. Zie Figuur 4b. Plaat mStrawberry OP9 cellen bij 1x10 4 / cm 2 voor confluentie op dag 0. Zorg ervoor dat u subcultuur extra cellen voor dag 5 en dag 8 / 9 voor de voortzetting van de co-cultuur. </li></ol></li><li class="jove_content"> ES / mStrawberry OP9 co-cultuur Set-Up (Day 0) <ol class="lalpha"><li class="jove_content"> Was de ES-cellen 2x met PBS </li><li> Trypsinize ES-cellen met voorverwarmd 0,25% trypsine-EDTA, incubeer gedurende 5min @ 37 ° C </li><li> Add Co-cultuur differentiatie media aan cellen </li><li> Pellet ES-cellen in 400xg, 5-7min, RT. Gooi supernatans </li><li> Resuspendeer cellen in co-cultuur differentiatie media </li><li> Verwijder het afdrukmateriaal uit mStrawberry OP9 cellen </li><li> Add Co-cultuur differentiatie media mStrawberry OP9 kolven </li><li> Plaat 1x10 3 ES-cellen / cm 2 tot en met fles mStrawberry OP9 cellen. Incubeer cellen bij 37 ° C, 5% CO 2 met vocht. </li></ol></li><li> mStrawberry OP9 cellen (dag 2) <ol class="lalpha"><li> Subcultuur mStrawberry OP9 zodat je samenvloeiing lagen mStrawberry OP9 cellen voor dag 5 van co-cultuur. Plaat mStrawberry OP9 cellen bij 1x10 4 / cm 2 voor confluentie op dag 5 (zoals in stap 3.2). Zorg ervoor dat u subcultuur extra cellen voor Dag 8 / 9, indien nodig (zoals in stap 2.2). </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9 co-cultuur (Dag 3) <ol class="lalpha"><li> Verwijder voorzichtig medium uit co-cultuur en te vervangen door verse Co-cultuur van differentiatie medium </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9 co-cultuur (Dag 5) <ol class="lalpha"><li> Zorgvuldig wassen co-culturen 2x met PBS </li><li> Trypsinize cellen met voorverwarmd 0,25% trypsine-EDTA </li><li> Was cellen af ​​fles met Co-cultuur differentiatie media </li><li> Pellet cellen 400xg, 7min, RT. Verwijder supernatans </li><li>Add Co-cultuur differentiatie media aan cellen. Gebruik een 21-gauge bluntended naald om cellen hersuspenderen en om te zorgen voor enkele celsuspensie </li><li> Tellen cellen met behulp van een hemocytometer. Moeten 100 tot 150-voudige toename in ES aantal cellen van dag 0. </li><li> Re-seed 6.48x10 4 / cm 2 - 7.76x10 4 / cm 2 co-cultuur cellen op om een nieuwe laag van confluerende, mStrawberry OP9 cellen </li><li> Dag 5 TESTEN-Resterende co-cultuur cellen kunnen worden gebruikt voor flowcytometrie-analyse, cytopreps (30K cellen), ChIP testen, etc. </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9 co-cultuur (Dag 8 / 9 en dag 12) <ol class="lalpha"><li> Verwijder de differentiatie media van kolf en op te slaan. Was monolaag 1x met PBS om hematopoietische cellen te verwijderen in suspensie. Gooi geen uit hematopoietische cellen. </li><li> Trypsinize hechtende cellen met voorverwarmd 0,25% trypsine-EDTA </li><li> Was cellen af ​​kolf met ES differentiatie media en toe te voegen aan hematopoietische cellen in suspensie = </li><li> Pellet cellen 400xg, 7min, RT. Verwijder supernatans </li><li> Add Co-cultuur differentiatie media of PBS aan cellen. Gebruik een 21-gauge bluntended naald om cellen hersuspenderen en om te zorgen voor enkele celsuspensie tellen cellen met behulp van een hemocytometer. </li><li> Co-cultuur kan worden voortgezet gedurende 14 dagen naar meer volwassen hematopoietische voorlopercellen te evalueren door het opnieuw zaaien co-cultuur cellen op een nieuwe laag van confluerende, mStrawberry OP9 cellen op dag 8 of 9 en dan weer op dag 12. Re-seed geoptimaliseerde mobiele nummer op basis van de gewenste cel herstel voor dag van de test. </li></ol></li><li> Evaluatie van de ES-afgeleide nageslacht (Dag 1-14). ES-afgeleide nakomelingen kan worden geëvalueerd op elke dag van co-cultuur door de stroming het uitzoeken mStrawberry negatieve cellen (ES-afgeleid nageslacht). <ol class="lalpha"><li> Verwijder de differentiatie media van kolf en op te slaan. Was monolaag 1x met PBS om hematopoietische cellen te verwijderen in suspensie. Geen toss uit hematopoietische cellen. </li><li> Trypsinize hechtende cellen met voorverwarmd 0,25% trypsine-EDTA </li><li> Was cellen af ​​fles met Co-cultuur differentiatie media en toe te voegen aan hematopoietische cellen in suspensie </li><li> Pellet cellen 400xg, 7min, RT. Gooi supernatans </li><li> Resuspendeer cellen met 21-gauge naald bluntended en tellen </li><li> ES-afgeleide nageslacht (mStrawberry negatieve cellen) kan stromen gesorteerd van mStrawberry positief OP9 cellen. ES-afgeleide nakomelingen kan vervolgens worden gekenmerkt door flowcytometrie-analyse, cytopreps, ChIP testen, etc. </li></ol></li></ol> 4. Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. ES / mStrawberry OP9 co-cultuur systeem. Ons laboratorium maakt gebruik van een in-vitro-ES-cel co-cultuur systeem te modelleren hematopoietische ontwikkeling. In deze co-cultuur systeem, ES-cellen differentiëren, in hemangioblasts op Dag 5, bij plaatsing op een confluente laag van mStrawberry OP9 cellen. Als de co-cultuur gaat, hematopoëtische voorlopers aanwezig zijn op dag 8, terwijl de terminaal gedifferentieerde hematopoietische lijnen verschijnen op dag 14. Pijlen geven dag van differentiatie bij passage van de ES-afgeleide nageslacht op nieuwe samenvloeiing lagen van mStrawberry OP9 cellen in dat nodig is. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Juiste ES celdifferentiatie. ES-cellen worden gezaaid op een confluente laag mStrawberry OP9 op dag 0. ES-afgeleide nageslacht beginnen zichtbaar te worden op dag 3 van differentiatie, met ES-afgeleide nakomelingen uitzien als een cluster van cellen met een bepaalde grens of het begin tot een krans patroon te vormen. Hemangioblasts, die de gemeenschappelijke mesodermale voorloper van de endotheel-en hematopoietische lineages, moet verschijnen als opgestapeld kransen van cellen op dag 5. Voor co-cultuur periodes langer dan vijf dagen, moet ES-afgeleide nageslacht verschijnen als clusters van hematopoietische cellen. Twee tot vier eencellige clusters, op dag 6 / 7, moeten verschijnen en uitgroeien tot grotere cel clusters op dag 8 / 9 van de co-cultuur. Andere ES afgeleid nakomelingen zijn ook gevonden strak gebonden aan de hechtende stromale cellen laag. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Mislukte ES celdifferentiatie. Resultaten van deze co-cultuur weerspiegelen oneigenlijk ES-cel differentiatie. Merk op hoe de ES-derived nageslacht niet in een krans patroon op dag 5. De afwezigheid van cellen in een krans patroon geeft onjuiste hemangioblast formatie. Als hemangioblast niet goed ontwikkelen, dan bleef co-cultuur zal resulteren in onvolgroeide hematopoietische lijn differentiatie. Co-culturen met oneigenlijke hemangioblast formatie moet worden weggegooid. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. mStrawberry OP9 celculturen. (A) mStrawberry OP9 cel zijn subcultuur op70-90% confluentie. (B) Voor een goede differentiatie, zijn ES-cellen en ES-derived nakomelingen geplaatst op een overdreven samenvloeiing laag van mStrawberry OP9 cellen. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Vertegenwoordiger ES / mStrawberry OP9 Co-cultuur stromingsprofiel. Alle ES-derived nakomelingen zijn mStrawberry negatieve cellen en kan stromen gesorteerd van de mStrawberry OP9 cellen. mStrawberry negatieve cel poort werd bepaald met behulp van een traditionele ES/OP9 co-cultuur.

<ol><li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origins+of+mammalian+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Embryonic origins of mammalian hematopoiesis.</a> Exp Hematol. 31, 1160-1160 (2003).</li>
<li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+patterning+of+the+mouse+embryo%3A+implications+for+hematopoietic+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Early patterning of the mouse embryo: implications for hematopoietic commitment and differentiation.</a> Exp Hematol. 33, 1015-1015 (2005).</li>
<li>Baron, M. H., Fraser, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+specification+of+early+hematopoiesis+in+the+mammal%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">The specification of early hematopoiesis in the mammal.</a> Curr Opin Hematol. 12, 317-317 (2005).</li>
<li>Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryoid+bodies%3A+an+in+vitro+model+of+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis.</a> Exp Physiol. 85, 645-645 (2000).</li>
<li>Ganapati, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+notch+signaling+in+normal+and+neoplastic+hematopoiesis%3A+global+gene+expression+profiling+in+response+to+activated+notch+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Modeling notch signaling in normal and neoplastic hematopoiesis: global gene expression profiling in response to activated notch expression.</a> Stem Cells. 25, 1872-1872 (2007).</li>
<li>Hogan, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHogan%2C+B+%22Manipulating+the+mouse+embryo+%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual</a>. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, N.Y. (1994).</li>
<li>Keller, G., Kennedy, M., Papayannopoulou, T., Wiles, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+commitment+during+embryonic+stem+cell+differentiation+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic commitment during embryonic stem cell differentiation in culture.</a> Mol Cell Biol. 13, 473-473 (1993).</li>
<li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, (1995).</li>
<li>Nakano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphohematopoietic+development+from+embryonic+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphohematopoietic development from embryonic stem cells in vitro.</a> Semin Immunol. 7, 862-862 (1995).</li>
<li>Nakano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+development+of+hematopoietic+system+from+mouse+embryonic+stem+cells%3A+a+new+approach+for+embryonic+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">In vitro development of hematopoietic system from mouse embryonic stem cells: a new approach for embryonic hematopoiesis.</a> Int J Hematol. 65, 1-1 (1996).</li>
<li>Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+lymphohematopoietic+cells+from+embryonic+stem+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture.</a> Science. 265, 1098-1098 (1994).</li>
<li>Turksen, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTurksen%2C+K+%22Embryonic+stem+cells+%3A+methods+and+protocols%22">Embryonic stem cells : methods and protocols</a>. , Humana Press. Totowa, N.J. (2002).</li>
</ol>

Een goede differentiatie van ES-cellen op de samenvloeiing laag van mStrawberry OP9 cellen resulteert in de productie van Flk1 + hemangioblasts op dag vijf van co-cultuur. Hemangioblasts moeten als opgestapeld kransen van cellen, zoals waargenomen in figuur 1. Voor de rest van de co-cultuur, moet zichtbaar ES-afgeleide nageslacht verschijnen als clusters van hematopoietische cellen (figuur 1). Bij Day6 / 7 twee tot vier cel-clusters moeten verschijnen en uitgroeien tot grotere cel clusters (zowel aanhanger en in suspensie), op dag 8 / 9 van de co-cultuur. Andere ES afgeleid nakomelingen zijn ook gevonden handen en voeten gebonden in de klevende stromale cellen laag. Hoewel niet opgenomen in het protocol, is het essentieel om te pre-testen van de FBS gebruikt in de ES groeimedium, de mStrawberry OP9 groei media en de ES / mStrawberry OP9 differentiatie media. Goed getest serum moeten een goede groei van mStrawberry OP9 cellen, maar ook, een goede differentiatie van embryonale stamcellen in co-cultuur zorgen tot Dag 5 van differentiatie. Als alternatief of in aanvulling op mStrawberry OP9 cellen, kan OP9 cellen worden bestraald, op 8000 rad, voorafgaand aan zaaien bij confluentie (7.8x10 4 cellen / cm 2). Bestraling van OP9 cellen die zorgt voor de eliminatie van herhaalde replating stappen, maar ook, zorgt voor bijna volledige eliminatie van oude, vervuilende OP9 cellen van stroomafwaarts assays. OP9 cellen werden ontworpen om mStrawberry eiwit tot expressie door transduceren OP9 cellen met 3ug/mL van een lentivirale vector die mStrawberry onder de controle van een CMV-promoter (pRRLsin-CMV vector, UCLA vector kern). Standaard ES/OP9 co-cultuur protocollen leiden tot de plaatsing van ES-cellen op een confluente laag OP9 cellen, evenals, een dag vijf replating stap om te verminderen oude, vervuilende OP9 cellen van cel-passage. Daarnaast worden alleen hematopoietische cellen in suspensie verwijderd voor de evaluatie van ES-afgeleid nageslacht. Echter, met zowel een replating stap en de oogst van slechts een suspensie cellen mist mogelijk een aanzienlijk aantal van de zich ontwikkelende ES-afgeleide hematopoietische cellen. Deze kwestie wordt van belang aan te pakken wanneer het proberen om hematopoietische afwijkingen geassocieerd met knock-out-ES lijnen karakteriseren. Om dit probleem te omzeilen ons lab gebruikt een aangepaste co-cultuur, door het gebruik van mStrawberry-expressie OP9 cellen. Dit zorgt ervoor dat alle ES nakomelingen worden overgebracht naar de voortdurende co-cultuur op dag 5, en voor de oogst van alle ES-afgeleid nageslacht voor downstream-assays. Deze wijziging zorgt voor een handige tools bij de evaluatie en karakterisering van hematopoietische nakomelingen van zowel mens en muis ES lijnen. Deze ES-mStrawberry OP9 co-cultuur model recapituleert de verschillende stadia primitieve en definitieve hematopoiese. Bij het bestuderen van de vroegste stadia van hematopoietische ontwikkeling, veel mensen gebruik maken van de BL-CFC (Blast-achtige kolonievormende cel) test, die de ontwikkeling van de hemangioblast uit de ES-cel te beoordelen. Terwijl de BL-CFC-test is een nuttig hulpmiddel bij het onderzoek naar vroege hematopoietische ontwikkeling, de mStrawberry-ES co-cultuur systeem vertoont te verhogen nut als het staat voor de beoordeling van hemangioblast, evenals, meer volwassen hematopoietische geslachten. Eerdere werk met behulp van traditionele OP9/ES en EB differentiatie protocollen heeft aangetoond dat andere factoren misschien wel nodig zijn, zoals overexpressie van HoxB4, om te leiden op lange termijn repopulatie hematopoietische stamcellen in vitro. Meerwerk is nodig om te beoordelen of mStrawberry negatief, gesorteerd ES-afgeleide populaties waar hematopoietische stamcellen bevatten.

OP-9 Cell Maintenance Medium Stock Components <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> aMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Omega Wetenschappelijke </td><td> FB01 </td><td> Pre-Getest </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Cellgro </td><td> 25 tot 005-CI </td><td> 200nm </td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 07901 </td><td></td></tr></tbody></table> ES/OP-9 Celdifferentiatie Medium Stock Components <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> aMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td> Pre-Getest </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Cellgro </td><td> 25 tot 005-CI </td><td> 200MM </td></tr><tr><td> PBS (zonder Ca 2 + en Mg 2 +) </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 07901 </td><td></td></tr></tbody></table>

modified es / op9 co-cultuur protocol biedt verbeterde karakterisatie van hematopoietische progeny

Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

De in vitro differentiatie van embryonale stamcellen tot een lot van hematopoietische cellen is nuttig bij het ​​bestuderen van celpopulaties die moeilijk toegang in vivo en voor het karakteriseren van de vroegste genen die betrokken zijn bij hematopoiese, zonder dat te maken met embryonale letaliteit. De ES/OP9 co-cultuur systeem is oorspronkelijk ontworpen om hematopoietische nakomelingen te produceren, zonder dat de overproductie van macrofagen, zoals de OP9 stromale cellijn is afgeleid van de Calvaria van osteopetrose mutante muizen dat het gebrek aan functionele M-CSF. De in vitro ES/OP9 co-cultuur systeem kan worden gebruikt om de vroege hematopoietische ontwikkeling samenvatten. Wanneer gekweekt op OP9 stromale cellen, ES-cellen differentiëren tot Flk-1 + hemangioblasts, hematopoëtische voorlopercellen, en tenslotte volwassen, terminaal gedifferentieerde lijnen. De standaard ES/OP9 co-cultuur protocol omvat de plaatsing van ES-cellen op een confluente laag OP9 cellen, evenals, periodieke replating stappen om oude te verwijderen, besmetten OP9 cellen. Bovendien, de huidige protocollen betrekking hebben op de evaluatie van alleen de hematopoietische cellen in suspensie en zijn niet geoptimaliseerd voor de evaluatie van ES-afgeleid nakomelingen op elke dag van differentiatie. Echter, met replating stappen en de oogst van slechts een suspensie cellen mist mogelijk een groot deel van ES-afgeleid nageslacht en het ontwikkelen van hematopoietische cellen. Deze kwestie wordt van belang aan te pakken wanneer het proberen om hematopoietische afwijkingen geassocieerd met knock-out-ES lijnen karakteriseren. Hier beschrijven we een gemodificeerde ES / mStrawberry OP9 co-cultuur, die zorgt voor de verwijdering van vervuilende OP9 cellen van stroomafwaarts assays. Deze methode maakt het mogelijk om volledige evaluatie van alle ES-afgeleide nakomelingen op alle dagen van co-cultuur, wat resulteert in een hematopoietische differentiatie patroon, die meer direct overeenkomt met de hematopoietische differentiatie patroon waargenomen binnen de embryo.

mStrawberry OP9 cellen zorgen voor volledige evaluatie van alle ES-afgeleide nakomelingen van co-cultuur.

Modified ES / OP9 co-cultuur protocol biedt verbeterde Karakterisatie van hematopoietische Progeny

De in vitro differentiatie van ES-cellen naar een hematopoëtisch cellot is nuttig bij het bestuderen van celpopulaties die in vivo moeilijk toegankelijk zijn ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om muis-embryonale stamcellen te differentiëren in diverse primitieve en definitieve hematopoëtische lijnen. Om alle nakomelingen van de ES-cellen te karakteriseren, wordt muis-hematopoëtische celdifferentiatie bereikt door ES-cellen te plaatsen op een confluente, fluorescent gelabelde M strawberry OP nine stromale cellaag. Elke dag van differentiatie of co-cultuur vertegenwoordigt de verschillende stadia van hematopoëtische ontwikkeling op het juiste oogstmoment.Gedifferentieerde ES-cel-nakomelingen kunnen door middel van cel sortering worden gescheiden van de M strawberry OP nine stromale cellijn. Dit ES-differentiatieprotocol recapituleert primitieve en definitieve hematopoëse zoals in vivo wordt waargenomen en kan worden gebruikt om hematopoëtische defecten geassocieerd met knockout ES-cellijnen te karakteriseren zonder het gebruik van embryo's. Hallo, welkom in het laboratorium van Dr. Judith Gassen aan het Johnson Comprehensive Cancer Center van UCLA.Mijn naam is Alicia Poz. Het belangrijkste voordeel van de techniek die ik u vandaag ga tonen ten opzichte van bestaande ESO-OP9-cocultuurmethoden is dat deze procedure de passage van alle cellen van dag 5 en dag 8 mogelijk maakt, evenals de volledige scheiding van alle uit ES-cellen afgeleide nakomelingen. Vanuit het OP9-stroma worden OP9-cellen gekweekt in OP9-celcultuurmedium, dat elke twee dagen vervangen moet worden.De OP9-cellen moeten drie dagen voordat ze nodig zijn voor de cocultuur worden gesubcultured. Het is belangrijk om te weten dat de OP9-cellen tijdens het onderhoud nooit op een dichtheid van meer dan 90% confluentie mogen worden gehouden. Was de cellen eerst twee keer met PBS, voeg vervolgens VOORVERWARMD 0,1%trypsine-EDTA toe gedurende vijf minuten totdat de cellen zijn losgekomen. VOEG OP9-celkweekmedium toe en breng de cellen over naar een conische buis van 50 milliliter.Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 300 G bij kamertemperatuur om een pellet te vormen, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in vers M strawberry OP nine celkweekmedium. Zaai de cellen uit met een minimale dichtheid van 10⁴ cellen/cm² op de dag dat het co-kweekexperiment begint. De OP nine-cellen die drie dagen geleden zijn gesubcultiveerd, moeten confluent zijn. De ES-cellen moeten worden gekweekt volgens het standaardprotocol voor uw specifieke cellijn.Was de ES-cellen twee keer met PBS, behandel ze met 0,25% trypsine-EDTA en incubeer ze gedurende vijf minuten bij 37 °C. Voeg vervolgens co-cultuur differentiatiemedium toe aan de ES-cellen en breng ze over naar conische buizen van 15 ml. Pelleteer de ES-cellen bij 400 ×g gedurende vijf tot zeven minuten bij kamertemperatuur.Na het verwijderen van het supernatant worden de ES-cellen resuspendeerd in co-cultuurdifferentiatiemedium. Gebruik een stompe naald van 21 gauge om een enkelcellesuspensie te verkrijgen. Tel de cellen met behulp van trypanblauw en een hemocytometer.Haal nu de kolf met M strawberry uit de incubator. Neem de OP nine cellen uit de incubator. Verwijder het medium van de OP nine cellen en voeg co-culture differentiatiemedium toe aan de kolfplaat.Voeg 1 × 10³ ES-cellen per vierkante centimeter toe aan elke fles met M strawberry OP9-cellen; incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO₂ met vochtigheid. Dit is dag nul en de co-cultuur moet er als volgt uitzien. Drie dagen na de start van de ES M strawberry OP9 co-cultuur.Er worden hoofdzakelijk grote, platte clusters van uit ES afgeleide nakomelingen met gedefinieerde randen waargenomen, en sommige wervelingen van cellen zullen zijn begonnen te vormen. Verwijder voorzichtig het medium uit de co-cultuur en vervang dit door vers differentiatiemedium vijf dagen na de start van de co-cultuur. Correcte differentiatie van ES-cellen op een confluente laag M strawberry OP nine-cellen zou moeten resulteren in hemaneblasten, die verschijnen als opgestapelde wervelingen van cellen.Het meest kritische aspect van deze procedure is ervoor zorgen dat er een correcte differentiatie optreedt op dag vijf van de co-cultuur. Op dit punt zijn de heman eblast-kolonies niet alleen microscopisch, maar ook macroscopisch zichtbaar. Was de co-cultuur zorgvuldig twee keer met PBS en trypsiniseer de cellen met 0,25% trypsin EDTA, was de cellen uit de kolf met ES-differentiatiemedium en breng ze over naar een buis; pelletiseer de cellen bij 400 G gedurende zeven minuten bij kamertemperatuur.Verwijder na centrifugatie het supernatant en voeg nieuw medium toe. Gebruik vervolgens een stompgeëindde naald van 21 gauge om de cellen te resuspenderen. Om een enkelcel-suspensie te garanderen, dienen de cellen te worden geteld met een hemocytometer; er zou een 100- tot 150-voudige toename in het aantal ES-cellen moeten zijn ten opzichte van dag nul. Zaai de co-cultuurcellen op dag acht of negen opnieuw uit op een nieuwe laag concurrente M strawberry OP nine-cellen en tel de cellen op dag 12 opnieuw. Verwijder het medium met de hematopoëtische cellen en reserveer dit.Was de monolaag één keer met PBS. Om de hematopoëtische cellen in suspensie te verwijderen en te bewaren, wordt 0,25% tripsin EDTA aan de kolf toegevoegd. Nadat de tripsin de cellen heeft losgemaakt, worden de adherentiecellen van de kolf gewassen met ES-differentiatiemedium en toegevoegd aan de hematopoëtische cellen in suspensie. Centrifugeer de cellen bij 400 G gedurende zeven minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen tenslotte met een stomp naald van 21 gauge en tel de cellen. De cellen zijn nu klaar om opnieuw te worden gezaaid of te worden gebruikt in downstream-assays.Het ES M strawberry OP nine co-cultuursysteem kan worden gebruikt om de beschreven hematopoëtische ontwikkeling te modelleren. Hier is een overzicht van het verloop van de co-cultuur; de dagen waarop gedifferentieerde ES-nakomelingen overgeplaatst moeten worden naar nieuwe M strawberry OP nine-cellen zijn aangegeven. Correcte differentiatie van ES-cellen op een convergente laag M strawberry OP nine-cellen zal leiden tot de productie van flick one positieve cellen.Angioblasten op dag vijf van de co-cultuur. Osteoblasten zijn de gemeenschappelijke mesodermale precursor voor de endotheliale en hematopoëtische lijnen en zouden moeten verschijnen als opgehoopte whorls van cellen, zoals getoond in deze afbeelding. Naarmate de co-cultuur vordert, zouden er op dag zes of zeven clusters van twee tot vier cellen moeten verschijnen die uitgroeien tot grotere celclusters. Tegen dag acht of negen zijn hematopoëtische precursors aanwezig, terwijl terminaal gedifferentieerde hematopoëtische lijnen verschijnen tegen dag 14.In tegenstelling hiermee zal een co-cultuur met onjuiste ESL-differentiatie resulteren in ES-afgeleide nakomelingen die op dag vijf geen wereldpatroon vertonen. De afwezigheid van cellen in een wereldpatroon duidt op een onjuiste vorming van GIO-blasten. Een co-cultuur met een onjuiste eblast-vorming zal uiteindelijk leiden tot een belemmerde differentiatie van de hematopoëtische lijn en moet worden weggegooid volgens dit gemodificeerde ES OP nine co-cultuurprotocol.Uit ES-cellen afgeleid nageslacht is m-aardbei negatief en kan via flowsortering worden gescheiden van M-aardbei positieve cellen. Neem op een willekeurige dag van de co-cultuur negen cellen op voor evaluatie. De resultaten van een representatief experiment worden hier getoond.Eerder gepubliceerde ES OP negen co-culture protocollen waren uitsluitend gericht op het passeren en evalueren van de niet-adherente zwevende cellen. In dit aangepaste protocol worden alle uit ES afgeleide cellen, zowel adherente als niet-adherente cellen, gepasseerd en kunnen deze worden geëvalueerd. Dit leidt tot verhoogde opbrengsten van hematopoëtische cellen, maakt de identificatie van zeldzame celpopulaties mogelijk en biedt een volledige karakterisering van alle ES-nakomelingen, zowel hematopoëtisch als niet-hematopoëtisch.

modified-es-op9-co-culture-protocol-provides-enhanced

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft de afleiding van transplanteerbare hematopoietische stamcellen uit muis embryonale stamcellen (ESC) en de daaropvolgende injectie in dodelijk bestraalde ontvangende muizen. In het kort, worden ESC gedifferentieerd embryoid lichamen, die vervolgens besmet zijn met retrovirale HoxB4 en co-gekweekt met OP9 stromale cellen en hematopoietische cytokines.

Afleiding van hematopoietische stamcellen van muriene embryonale stamcellen

Een methode om de verdeling van beenmerg hematopoietische stamcellen in flowcytometrie en efficiënt isoleren sterk gezuiverde hematopoietische stamcellen (HSC) analyse beschreven. De isolatie procedure is in hoofdzaak gebaseerd op magnetische verrijking van c-Kit + cellen en cel sortering tot HSCs voor cellulaire en moleculaire studies te zuiveren.

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

This video describes the technique for long term 2D co-culture of leukemia cells with bone marrow stromal cells to study their interaction with the bone marrow microenvironment. The 2D coculture model utilizes the acute lymphoblastic leukemia cells and the bone marrow stromal or osteoblasts that influence tumor cell phenotype. This study will support investigation of the mechanisms that underlie bone marrow supported survival of leukemic cells during chemotherapy exposure.

2D Co-culture of Leukemic Cells with BMSCs: A Method to Obtain Subpopulations of Leukemic Cells

Muis embryonale stamcellen kunnen in vitro worden gedifferentieerd tot T-cellen met behulp van het OP9-DL1 co-cultuursysteem. Succes bij deze procedure vereist zorgvuldige aandacht voor reagens/celonderhoud en belangrijke techniekgevoelige stappen. Hier bespreken we deze kritieke parameters en bieden we een gedetailleerd protocol om de adoptie van deze technologie te stimuleren.

Afleiding van T cellen In Vitro Van muis embryonale stamcellen

De huidige protocollen om geïmmortaliseerde multipotente otische voorlopercellen (iMOP) en otische differentiatie te onderhouden worden beschreven.  Cultuurcondities en moleculaire markers die differentiatie naar sensorische epitheel en spiraalvormige ganglionneuronen (SGN) aangeven, worden benadrukt.

Initiëren Differentiatie in Onsterfelijk Multipotent Otic Progenitor Cellen

Hier presenteren we menselijke pluripotente de protocollen van de cultuur van het cel van de stam (hPSC), gebruikt om te onderscheiden van hPSCs in CD34+ hematopoietische progenitorcellen. Deze methode maakt gebruik van fase-specifieke manipulatie van canonieke WNT signalering cellen uitsluitend naar ofwel het definitieve of primitieve hematopoietische programma opgeven.

Regie van differentiatie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen

Kwantificering van donor-afgeleide cellen is vereist voor het controleren van engraftment na stamceltransplantatie bij patiënten met Hemoglobinopathieën. Een combinatie van stroom cytometry gebaseerde cel sorteren, kolonie vorming assay, en na diverse analyses van korte tandem herhalingen kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de proliferatie en differentiatie van de progenitoren in het compartiment van de erythroid.

Detectie van residuele Donor Erythroid voorlopercellen na hematopoietische stamceltransplantatie voor patiënten met Hemoglobinopathieën

Dit protocol beschrijving van het gebruik van gekweekte Aorta-gonaden-Mesonephros voor expressie analyses, kolonie-vormende eenheden in de cultuur en milt, en op lange termijn reconstitutie om te bepalen van het effect van regelgevende factoren en signaalroutes op hematopoietische stamcellen cel ontwikkeling. Dit is aangetoond als een doeltreffend systeem voor het bestuderen van hematopoietische stamcelbiologie en functie.

Toepassing van de Aorta-gonaden-mesonephros Explant cultuur System in Developmental Hematopoiesis

We laten zien hoe te identificeren en te isoleren 6 deelverzamelingen van myeloïde voorlopercellen uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een combinatie van magnetische en fluorescentie sorteren (MACS en FACS). Dit protocol kan worden gebruikt voor in vitro cultuur assays (methylcellulose of vloeistof culturen), in vivo adoptief overdracht experimenten en RNA/eiwit analyses.

Identificatie en isolatie van de Oligopotent en Lineage-begaan myeloïde voorlopercellen uit beenmerg van de muis

Dit protocol beschrijft een procedure voor het induceren van differentiatie van menselijke hematopoëtische stam- en voorlopercellen afkomstig van het beenmerg en perifere bloed mononucleaire cellen. De assay gebruikt een halfvaste kweekmedium ter ondersteuning van erythroïde en myeloïde lijnbinding en bevat gestandaardiseerde metrics voor reproduceerbare kolonieclassificatie voor preklinische geneesmiddelkarakterisering.

Colony-Forming Unit assay aangepast voor door patiënten afgeleide beenmerg- en perifere bloedmononucleaire cellen

Leer een gemodificeerd ES/OP9 co-cultuurprotocol voor hematopoietische differentiatie met mStrawberry OP9 stromale cellen. Deze methode maakt volledige karakterisatie van alle ES-afgeleide progenitorcellen mogelijk.

Modified ES / OP9 co-cultuur protocol biedt verbeterde Karakterisatie van hematopoietische Progeny

Meer video's verkennen