Modified ES / OP9 co-cultuur protocol biedt verbeterde Karakterisatie van hematopoietische Progeny

Het algemene doel van het volgende experiment is om muis-embryonale stamcellen te differentiëren in diverse primitieve en definitieve hematopoëtische lijnen. Om alle nakomelingen van de ES-cellen te karakteriseren, wordt muis-hematopoëtische celdifferentiatie bereikt door ES-cellen te plaatsen op een confluente, fluorescent gelabelde M strawberry OP nine stromale cellaag. Elke dag van differentiatie of co-cultuur vertegenwoordigt de verschillende stadia van hematopoëtische ontwikkeling op het juiste oogstmoment.

Gedifferentieerde ES-cel-nakomelingen kunnen door middel van cel sortering worden gescheiden van de M strawberry OP nine stromale cellijn. Dit ES-differentiatieprotocol recapituleert primitieve en definitieve hematopoëse zoals in vivo wordt waargenomen en kan worden gebruikt om hematopoëtische defecten geassocieerd met knockout ES-cellijnen te karakteriseren zonder het gebruik van embryo's. Hallo, welkom in het laboratorium van Dr. Judith Gassen aan het Johnson Comprehensive Cancer Center van UCLA.

Mijn naam is Alicia Poz. Het belangrijkste voordeel van de techniek die ik u vandaag ga tonen ten opzichte van bestaande ESO-OP9-cocultuurmethoden is dat deze procedure de passage van alle cellen van dag 5 en dag 8 mogelijk maakt, evenals de volledige scheiding van alle uit ES-cellen afgeleide nakomelingen. Vanuit het OP9-stroma worden OP9-cellen gekweekt in OP9-celcultuurmedium, dat elke twee dagen vervangen moet worden.

De OP9-cellen moeten drie dagen voordat ze nodig zijn voor de cocultuur worden gesubcultured. Het is belangrijk om te weten dat de OP9-cellen tijdens het onderhoud nooit op een dichtheid van meer dan 90% confluentie mogen worden gehouden. Was de cellen eerst twee keer met PBS, voeg vervolgens VOORVERWARMD 0,1%trypsine-EDTA toe gedurende vijf minuten totdat de cellen zijn losgekomen. VOEG OP9-celkweekmedium toe en breng de cellen over naar een conische buis van 50 milliliter.

Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 300 G bij kamertemperatuur om een pellet te vormen, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in vers M strawberry OP nine celkweekmedium. Zaai de cellen uit met een minimale dichtheid van 10⁴ cellen/cm² op de dag dat het co-kweekexperiment begint. De OP nine-cellen die drie dagen geleden zijn gesubcultiveerd, moeten confluent zijn. De ES-cellen moeten worden gekweekt volgens het standaardprotocol voor uw specifieke cellijn.

Was de ES-cellen twee keer met PBS, behandel ze met 0,25% trypsine-EDTA en incubeer ze gedurende vijf minuten bij 37 °C. Voeg vervolgens co-cultuur differentiatiemedium toe aan de ES-cellen en breng ze over naar conische buizen van 15 ml. Pelleteer de ES-cellen bij 400 ×g gedurende vijf tot zeven minuten bij kamertemperatuur.

Na het verwijderen van het supernatant worden de ES-cellen resuspendeerd in co-cultuurdifferentiatiemedium. Gebruik een stompe naald van 21 gauge om een enkelcellesuspensie te verkrijgen. Tel de cellen met behulp van trypanblauw en een hemocytometer.

Haal nu de kolf met M strawberry uit de incubator. Neem de OP nine cellen uit de incubator. Verwijder het medium van de OP nine cellen en voeg co-culture differentiatiemedium toe aan de kolfplaat.

Voeg 1 × 10³ ES-cellen per vierkante centimeter toe aan elke fles met M strawberry OP9-cellen; incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO₂ met vochtigheid. Dit is dag nul en de co-cultuur moet er als volgt uitzien. Drie dagen na de start van de ES M strawberry OP9 co-cultuur.

Er worden hoofdzakelijk grote, platte clusters van uit ES afgeleide nakomelingen met gedefinieerde randen waargenomen, en sommige wervelingen van cellen zullen zijn begonnen te vormen. Verwijder voorzichtig het medium uit de co-cultuur en vervang dit door vers differentiatiemedium vijf dagen na de start van de co-cultuur. Correcte differentiatie van ES-cellen op een confluente laag M strawberry OP nine-cellen zou moeten resulteren in hemaneblasten, die verschijnen als opgestapelde wervelingen van cellen.

Het meest kritische aspect van deze procedure is ervoor zorgen dat er een correcte differentiatie optreedt op dag vijf van de co-cultuur. Op dit punt zijn de heman eblast-kolonies niet alleen microscopisch, maar ook macroscopisch zichtbaar. Was de co-cultuur zorgvuldig twee keer met PBS en trypsiniseer de cellen met 0,25% trypsin EDTA, was de cellen uit de kolf met ES-differentiatiemedium en breng ze over naar een buis; pelletiseer de cellen bij 400 G gedurende zeven minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder na centrifugatie het supernatant en voeg nieuw medium toe. Gebruik vervolgens een stompgeëindde naald van 21 gauge om de cellen te resuspenderen. Om een enkelcel-suspensie te garanderen, dienen de cellen te worden geteld met een hemocytometer; er zou een 100- tot 150-voudige toename in het aantal ES-cellen moeten zijn ten opzichte van dag nul. Zaai de co-cultuurcellen op dag acht of negen opnieuw uit op een nieuwe laag concurrente M strawberry OP nine-cellen en tel de cellen op dag 12 opnieuw. Verwijder het medium met de hematopoëtische cellen en reserveer dit.

Was de monolaag één keer met PBS. Om de hematopoëtische cellen in suspensie te verwijderen en te bewaren, wordt 0,25% tripsin EDTA aan de kolf toegevoegd. Nadat de tripsin de cellen heeft losgemaakt, worden de adherentiecellen van de kolf gewassen met ES-differentiatiemedium en toegevoegd aan de hematopoëtische cellen in suspensie. Centrifugeer de cellen bij 400 G gedurende zeven minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen tenslotte met een stomp naald van 21 gauge en tel de cellen. De cellen zijn nu klaar om opnieuw te worden gezaaid of te worden gebruikt in downstream-assays.

Het ES M strawberry OP nine co-cultuursysteem kan worden gebruikt om de beschreven hematopoëtische ontwikkeling te modelleren. Hier is een overzicht van het verloop van de co-cultuur; de dagen waarop gedifferentieerde ES-nakomelingen overgeplaatst moeten worden naar nieuwe M strawberry OP nine-cellen zijn aangegeven. Correcte differentiatie van ES-cellen op een convergente laag M strawberry OP nine-cellen zal leiden tot de productie van flick one positieve cellen.

Angioblasten op dag vijf van de co-cultuur. Osteoblasten zijn de gemeenschappelijke mesodermale precursor voor de endotheliale en hematopoëtische lijnen en zouden moeten verschijnen als opgehoopte whorls van cellen, zoals getoond in deze afbeelding. Naarmate de co-cultuur vordert, zouden er op dag zes of zeven clusters van twee tot vier cellen moeten verschijnen die uitgroeien tot grotere celclusters. Tegen dag acht of negen zijn hematopoëtische precursors aanwezig, terwijl terminaal gedifferentieerde hematopoëtische lijnen verschijnen tegen dag 14.

In tegenstelling hiermee zal een co-cultuur met onjuiste ESL-differentiatie resulteren in ES-afgeleide nakomelingen die op dag vijf geen wereldpatroon vertonen. De afwezigheid van cellen in een wereldpatroon duidt op een onjuiste vorming van GIO-blasten. Een co-cultuur met een onjuiste eblast-vorming zal uiteindelijk leiden tot een belemmerde differentiatie van de hematopoëtische lijn en moet worden weggegooid volgens dit gemodificeerde ES OP nine co-cultuurprotocol.

Uit ES-cellen afgeleid nageslacht is m-aardbei negatief en kan via flowsortering worden gescheiden van M-aardbei positieve cellen. Neem op een willekeurige dag van de co-cultuur negen cellen op voor evaluatie. De resultaten van een representatief experiment worden hier getoond.

Eerder gepubliceerde ES OP negen co-culture protocollen waren uitsluitend gericht op het passeren en evalueren van de niet-adherente zwevende cellen. In dit aangepaste protocol worden alle uit ES afgeleide cellen, zowel adherente als niet-adherente cellen, gepasseerd en kunnen deze worden geëvalueerd. Dit leidt tot verhoogde opbrengsten van hematopoëtische cellen, maakt de identificatie van zeldzame celpopulaties mogelijk en biedt een volledige karakterisering van alle ES-nakomelingen, zowel hematopoëtisch als niet-hematopoëtisch.