Ontleding van een muis Oog voor een hele berg van de retinaal pigment epitheel

Mijn naam is Allison Clavon. Ik ben onderzoeksassistent van Dr. Alex Bishop aan het Gree Children's Cancer Research Institute bij het UT Health Science Center in San Antonio, Texas. Vandaag ga ik demonstreren hoe u een oog van een knaagdier dissekeert om de volledige hoeveelheid van het retinaal pigmentepitheel te verkrijgen.

Dit weefsel is van belang voor het bestuderen van de ontwikkeling van het netvlies en aanverwante ziekten, en is tevens de locatie voor een in vivo homology directed DNA repair assay. Laten we beginnen. Hier is een oog dat klaar is voor dissectie.

Laten we eerst kijken naar de anatomische structuren die u gedurende de procedure als oriëntatiepunten zult gebruiken. Dit is het oog van een gedilueerd dier. Hier is de oogzenuw aan de achterzijde van het oog tegenovergesteld.

Dit is het hoornvlies. De iris is door het hoornvlies heen zichtbaar. Het witachtige gebied aan de achterzijde van het oog is de sclera.

Daarom wordt deze regio de cornea-sclerale overgang genoemd. De eerste stap van de dissectie is het verwijderen van overbodig weefsel, zoals spierbindweefsel en de nervus opticus. Vervolgens moet de cornea worden verwijderd door een cirkelvormige snede te maken.

Op dit punt kan de lens worden verwijderd, waardoor een hol oogbekertje ontstaat. Vervolgens worden er vier sneden gemaakt vanaf de grens tussen het hoornvlies en het sclera in de richting van de papil van de oogzenuw. De resulterende structuur vertoont een gelijkenis met een bloem met vier bloembladen.

Elk van deze vier bloemblaadjes wordt vervolgens in het midden doorgesneden, wat resulteert in een structuur die lijkt op een bloem met acht bloemblaadjes. In dit stadium kan het materiaal op sommige plaatsen knikken vanwege de sferische vorm. Om dit te voorkomen en een vlakker gatmontage te verkrijgen, kunnen er acht kortere inkepingen worden gemaakt vlak voorbij de knik.

U heeft verschillende materialen nodig op uw werkstation, waaronder een 100 of 200 µL pipet en bijbehorende tips, een X-P-B-S-A schaaltje van 35 millimeter, objectglazen en dekglas, 90% glycerol en transparante nagellak voor de preparatie van de glaasjes, een rek voor het drogen van de glaasjes, een doos Kim-doekjes en een afvalbak voor biologisch materiaal. Naast deze gangbare materialen heeft u ook een set gespecialiseerde microdissectie-instrumenten nodig, waaronder rechte pincetten; pincetten onder een hoek van 45 graden worden gebruikt om het oog tijdens de dissectie vast te houden, te draaien en algemeen te manipuleren. Deze pincetten met een hoek van 15 graden zijn naar boven gebogen en worden eveneens gebruikt voor het hanteren en manipuleren van het oog.

Ten slotte heb je een veer-schaar nodig. Het is zeer belangrijk dat je een veer-schaar gebruikt in plaats van een traditionele schaar. Controleer voor deze dissectie, voordat je begint met ontleden, of de hoogte van je stoel is aangepast zodat je ogen op gelijke hoogte met de oculairs staan wanneer je rechtop zit.

Een gebogen houding bij de microscoop veroorzaakt schouder- en rugpijn en vermindert de kwaliteit van uw dissecties. Begin met het gieten van een hoeveelheid XPBS in het deksel van de schaal van 35 millimeter. Breng vervolgens de ogen die u wilt dissecteren over naar de schaal.

Dit is een oog van een wildtype C 57 zwarte muis. Men kan zien dat het zeer klein is, met een diameter van ongeveer drie en een halve millimeter. De opaciteit van de sclera geeft het een blauwachtige tint.

De eerste stap bij de dissectie is het verwijderen van alle overbodige weefsels rondom het oog, zoals spierbindweefsel en de oogzenuw. Hier heb ik de pincet van 45 graden in mijn linkerhand en de pincet van 15 graden in mijn rechterhand. U kunt één pincet gebruiken om het oog te stabiliseren terwijl u met de andere pincet het weefsel wegtrekt.

Wanneer er een groot stuk weefsel loslaat, veegt u uw pincet voorzichtig schoon met een Kimwipe. Let er wel op dat u het oog niet plet of doorprikt. Een van de voordelen van het uitvoeren van deze dissectie in suspensie is dat u het bindweefsel gemakkelijk ziet wegzweven van het oog.

Uiteindelijk bereikt u een punt waarop u met de pincet geen weefsel meer kunt verwijderen. Vervang de pincet met een hoek van 15 graden door de veerschaar. Gebruik de veerschaar om de nervus opticus door te knippen.

Gebruik de buitenrand van het mesje om het weefsel naar voren te duwen richting de grens tussen het hoornvlies en het sclera. Trim vervolgens de schaar en veeg deze voorzichtig schoon met een kim wipe. Laten we dat nog eens bekijken.

Duw het weefsel naar voren richting de grens tussen het hoornvlies en de sclera met de buitenrand van de schaar wanneer het weefsel omhoog staat. Trim het weefsel, blijf stukjes weefsel naar voren duwen met de stompe zijde van de schaar en trim deze vervolgens weg totdat al het overtollige weefsel is verwijderd. Er bevinden zich gewoonlijk twee banden van taai weefsel op het oog.

De eerste is bevestigd bij de overgang tussen het hoornvlies en de sclera, en de tweede wordt getoond terwijl deze wordt bijgesneden. Hier bevindt men zich ongeveer halverwege de overgang tussen het hoornvlies en de sclera en de kop van de oogzenuw. De volgende stap in de dissectie is het verwijderen van het hoornvlies en de lens.

Gebruik de 45 graden pincet om een flap op te tillen in ongeveer het midden van het hoornvlies. Maak vervolgens met de veerschaar een kleine incisie aan de basis van de flap. Voer het onderste blad van de schaar via de incisie onder de iris in.

Maak een insnijding in de richting van, maar niet in, de grens tussen het hoornvlies en de sclera. Roteer nu het oog langzaam 360 graden en maak kleine insnijdingen rondom. Probeer de schaar onder de iris te houden, zodat zowel het hoornvlies als de iris tegelijkertijd worden doorgesneden.

Het vergt veel oefening om dit zo gemakkelijk te doen als ik hier laat zien. Zodra het hoornvlies is verwijderd, draait u het oog op zijn zijkant en drukt u voorzichtig op de buitenkant van het oog om de lens naar buiten te duwen. De resterende structuur zal vervolgens beker-vormig zijn.

Het oog moet in kwartieren worden verdeeld. Hiervoor draait u het oog op zijn zijkant en steekt u het onderste blad van uw veerschaar in. Maak een longitudinale snede in de richting van, maar niet geheel tot aan de papil van de oogzenuw.

Houd hiervoor uw armen langs uw zij en uw schaar ongeveer loodrecht op uw lichaam en de ooginsnijding voor u. Maak de tweede snede direct tegenover de eerste snede. Neem de tijd om alles goed uit te lijnen, zodat u een gladde snede kunt maken.

Het maken van meerdere sneden kan zorgen voor een kartelige rand, maar als deze zorgvuldig worden uitgelijnd, zijn ze niet merkbaar. Let op hoe ik in staat ben om met de bolvorm van het oog mee te werken in plaats van ertegenin, omdat het oog zijn normale vorm behoudt. Terwijl het is opgehangen in PBS, zal de rest van de dissectie op een objectglas plaatsvinden. Steun het oog met uw pincet met een hoek van 45 graden en til het uit de PBS.

Plaats het oog op een schone objectglas. Vouw het oog voorzichtig open met behulp van beide paren geknikte pincetten. Let op de kleine rand van het hoornvlies en de iris rond de omtrek van het oog, wat handig is bij het hanteren.

Vervolgens moet u elk van de vier bloemblaadjes doormidden snijden. Draai het oog zodanig dat een van de bloemblaadjes loodrecht op uw lichaam staat. Pak de hoek van het bloemblaadje vast met uw pincet met een hoek van 15 graden.

Til het weefsel lichtjes op en maak vervolgens een incisie vanaf de grens tussen het hoornvlies en het sclera richting de papil van de oogzenuw. Deze incisies moeten loodrecht op een raaklijn staan. Een raaklijn is een lijn die loodrecht staat op de diameter.

Uw sneden moeten daarom in lijn liggen met de diameter van het oog. Draai de objectglas nu zodat het volgende pedikel loodrecht op uw lichaam staat en herhaal de handeling. Pak de hoek van de pedikel vast.

Til het weefsel voorzichtig op en snijd. Herhaal dit proces totdat elk van de vier grote bloemblaadjes in tweeën is gesneden. De witachtige substantie is het neurale retina, dat direct bovenop het RPE ligt.

Het neurale netvlies kan het RPE beschermen, laat het daarom intact tot alle sneden zijn gemaakt. Let op dat de pedalen licht gebogen zijn. Werk niet tegen deze kromming in.

Neem de tijd om de snede goed uit te lijnen, zodat u één schone snede kunt maken. Omdat het oog rond is, neigt het tot plooien; om dit te voorkomen, kunt u acht kortere inkepingen maken.

Eén op elk bloemblad. Gebruik dezelfde basisstrategie als bij de vorige ronde van vier sneden. Til de hoek van het bloemblad op en snijd, maar snijd in dit geval slechts tot ongeveer halverwege de lengte van het bloemblad.

Zodra alle incisies zijn gemaakt, kunt u het neurale retina verwijderen. Hier voeg ik een paar druppels 1x PBS toe aan het specimen. Zorg ervoor dat het RPE niet uitdroogt.

Het neurale netvlies moet slechts losjes verbonden zijn met het onderliggende RPE. U kunt zien dat het vrij gemakkelijk loslaat. Meestal blijft het echter vastzitten bij de overgang tussen hoornvlies en sclera, wat aan de binnenzijde van het oog een hobbelige rand is die het ciliaire lichaam wordt genoemd.

U kunt de punt van uw pincet van 15 graden in de oogzenuwkop plaatsen om het preparaat te verankeren terwijl u het neurale netvlies lostrekt. Het ciliaire lichaam markeert de rand van het RPE, het donker gepigmenteerde weefsel dat is losgekomen. Hier is de iris, niet het RPE.

Ik raad aan om zoveel mogelijk van de iris te verwijderen, omdat deze erg kleverig is en kan omvouwen en aan het RPE blijven plakken als het neurale retina schilferig is of als er resten ervan aan het RPE vastgeplakt blijven. Waarschijnlijk is er een van twee dingen misgegaan. Ofwel de ogen zijn niet correct gefixeerd, bijvoorbeeld gedurende een te lange of te korte periode, of ze zijn te lang bewaard voordat de dissectie plaatsvond.

Het pedaal dat ik hier blootleg heeft nog geen inkeping gehad. U kunt zien dat het pedaal zich ongeveer op een derde van de rand van de RPE bevindt. Dit is de reden waarom de acht inkepingen worden aanbevolen.

Zodra alle neurale retina is verwijderd, spoelt u het RPE meerdere keren met 100 tot 200 µL PBS met behulp van een pipet, totdat al het stof en het debris zijn verwijderd. Pipetteer 80 tot 90 µL 90% glycerol in een rechthoekige vorm op een nieuw objectglas. Let op: dit is het optimale glycerolvolume voor een dekglas van 22 bij 50 mm en dient dienovereenkomstig te worden aangepast.

Gebruik voor andere formaten dekglas de pipetpunt om het glycerol te verspreiden. Let erop dat er geen luchtbellen in het glycerol terechtkomen. Als er toch een bel ontstaat, sleep deze dan naar de rand zodat deze knapt.

Schuif de onderste arm van uw pincet van 15 graden onder het RPE en til dit voorzichtig op, waarna u het RPE langzaam in de glycerol laat zakken. Het RPE zal op de glycerol drijven en kan enigszins krullen of draaien. Gebruik uw pincet om het RPE recht te trekken en om de glycerol over het oppervlak van het RPE te verspreiden.

Indien er luchtbellen ontstaan: sleep deze terwijl u dit doet naar de rand waar ze zullen knappen, door het dekglas onder een hoek van ongeveer 45 graden vast te houden. Raak hiermee de rand van de glycerol aan.

Verplaats het vervolgens naar de rand van het preparaatglas. Houd de onderkant van het dekglas vast met uw duim en wijsvinger en ondersteun de tegenoverliggende rand met uw pincet van 15 graden. Laat het dekglas zeer langzaam op het preparaatglas zakken zodra er contact is gemaakt.

Stop met het laten zakken zodra u het RPE bereikt, zodat het glycerol kan migreren, en laat vervolgens uw dekglas langzaam verder zakken. Als u het dekglas te snel laat zakken, zullen er luchtbellen in uw preparaat terechtkomen. Ik laat het dekglas langzaam zakken terwijl het het RPE raakt, zodat het glycerol kan migreren.

U ziet dat er luchtbellen ontstaan wanneer ik het dekglas te snel loslaat. Gebruik een ruime hoeveelheid transparante nagellak om de rand van het dekglas aan de objectglas te bevestigen, over de gehele omtrek.

Dit is een typisch RPE van een C 57 zwarte muis. Het is normaal om onderliggende vasculatuur te zien, zoals hier aangegeven. Het is ook normaal om enige variatie in pigmentatie te zien, zoals plekken die minder gepigmenteerd lijken te zijn.

Heldere plekken zoals deze zijn echter waarschijnlijk het gevolg van fysieke beschadiging van het RPE en het onderliggende choroidea. Omdat het choroidea van het oog ook gepigmenteerd is, is het mogelijk dat beschadiging van een zwart RPE onopgemerkt blijft als het choroidea intact blijft.

Dit is een typisch RPE van een dilute muis. Zoals aangegeven, is de vasculatuur zichtbaar en is er sprake van variatie in pigmentatie, zoals donkere en lichtere vlekken. Het is echter vrijwel onmogelijk om schade op een dilute RPE waar te nemen.

Zijn deze kleine vlekjes beschadigingen of is dit een normale variatie in pigmentatie? Ik stel een kleuring en staining voor om deze vraag te beantwoorden. Dit geeft u een idee of u te ruw met de I twee omgaat.

De kleuring bakent de celmembranen duidelijk af, waardoor beschadigde plekken zichtbaar worden, maar in werkelijkheid is het RPE vrij veerkrachtig en is de kans op schade klein als u het oog bij het hoornvlies vasthoudt. Hier is een whole mount met een reeks problemen; het minst ernstige daarvan, hier aangegeven, is een te brede marge van het hoornvlies, wat kan leiden tot kromtrekken en plooien van het golvende materiaal. Hier is te zien dat er een aanzienlijke hoeveelheid vreemd weefsel op de achterkant van het oog is achtergebleven.

Dit pedaal is gedeeltelijk omgevouwen, en hier is te zien dat het RPE gedeeltelijk is gescheurd. Een ander probleem is dat dit oog de aanblik heeft van een windmolen. Hier heb ik de hoeken van de incisies ingetekend.

Dit is echter hoe ze hadden moeten zijn. Onthoud dat uw sneden loodrecht op de raaklijn en in lijn met de diameter moeten staan. Ik heb zojuist gedemonstreerd hoe u een muis-oog moet dissekeren voor een whole mount van het retinaal pigment.

Epitheel, het belangrijkste is om een goede houding aan te nemen, maar probeer ontspannen te blijven. Ik hoop dat u deze video nuttig vond en wens u veel succes met uw toekomstige experimenten.