Name: Ontleding van een muis Oog voor een hele berg van de retinaal pigment epitheel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 47 s
Description: Leer de dissectie van een muizenogen om een whole mount van het retinale pigmentepitheel te verkrijgen. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar retinale ontwikkeling en ziekten in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Environmental Health Sciences [K22ES012264 om AJRB] en een American Cancer Society InstitutionalResearch Grant [ACS-IRG-00-173-04] piloot projectaward [naar AJRB]. We danken ook de leden van de bisschop lab voor de kritische lezing van het manuscript en commentaren op de video-en Adam Brown in het bijzonder, voor het voorbeeld van hoe het niet moet. Wij danken dr. Donald McEwen of Cancer Greehey Children&#39;s Research Institute voor het toestaan ​​van ons het gebruik van zijn ontleden omvang / video-camera set-up voor het filmen van de dissectie video. Wij danken Daron Brown op Corte Instrumenten voor het slijpen en reparatie van onze microdissectie tools.

1. Verwijderen Vreemd weefsel van de buitenkant van het oog <ol><li> Giet 1X PBS in het deksel van een 35mm schotel. Het niveau moet worden net onder de rand van het deksel. </li><li> Het gebruik van rechte tang, transfer ogen (s) van de opslag buis naar de 35mm schotel. Ogen zijn ondergedompeld in PBS om twee redenen: 1. De vreemde weefsels zal weg "drijven" uit het oog, zodat je kunt zien en ze eenvoudig te verwijderen, en 2. Tijdens de dissectie, zal het oog natuurlijk houden aan haar bolvorm, terwijl in suspensie, zodat u om te werken met deze vorm in plaats van tegen. </li><li> Met behulp van beide paren schuine pincet (45 ° en 15 °), verwijder voorzichtig zo veel spier-en bindweefsel mogelijk te maken, trekt het weefsel tegen de stroom in (dat wil zeggen in de richting van het hoornvlies). Sommige bindweefsel zal blijven. Inspanning moet worden geleverd aan de oogbol knijpen zo min mogelijk. </li><li> Ruil je 15 ° tangen voor de lente schaar. Terwijl het oog stabiel met 45 ° tang, gebruik dan de lente schaar weg te snijden resterende spier-en bindweefsel, evenals de oogzenuw. * Tip: Gebruik de buitenrand van de schaar om het weefsel duwen tegen de korrel (in de richting van de corneo-sclerale verdelen) en vervolgens trim. Ga door totdat alle vreemde weefsel is verwijderd uit het oog. </li></ol> 2. Verwijder het hoornvlies en de lens <ol><li> Met het hoornvlies naar boven, gebruik maken van de 45 ° een tang om knijpen om een ​​kleine vouw in het midden van het hoornvlies. </li><li> Met behulp van de lente schaar, maak een kleine incisie aan de onderkant van de flap. Laat de flap. </li><li> Houd de ogen nog steeds met de tang, plaats de onderste schaar in en loodrecht op de incisie en maak een snede in de richting van de corneo-sclerale verdelen. Probeer je ondermes te houden onder de iris, zodat zowel het hoornvlies en de iris worden gesneden. Knip niet helemaal naar de corneo-sclerale verdelen. Houd schaar gestoken in het oog. </li><li> Met behulp van uw 45 ° tang voorzichtig draai het oog, zodat uw schaar parallel aan de corneo-sclerale verdelen en maakt een klein sneetje. Langzaam draait het oog 360 °, het maken van kleine incisies helemaal rond. Nogmaals, probeer het ondermes van uw lente schaar te houden onder de iris, zodat zowel de iris en het hoornvlies worden gesneden. Til de iris en het hoornvlies weg van de rest van het oog en gooi ze weg. </li><li> Kantel het oog op zijn kant en druk voorzichtig neer op de achterste helft van het oog, waardoor de lens uit. Gooi de lens. De binnenkant van de resterende oogschelp wordt omzoomd door de neurale netvlies, die er glad en ondoorzichtig. </li></ol> 3. Kwart van de resulterende oogklep, wat resulteert in een 4 - "petaled", bloem-achtige structuur <ol><li> Het oog moet zo worden geplaatst dat de opening van de oogschelp loodrecht op je lichaam. Gebruik je 45 ° een tang om stabiel en de positie van de oogschelp. </li><li> Houd je de lente schaar voor je neus, zodat ze loodrecht op je lichaam, plaatst u de ondermes van uw lente schaar in de bovenste rand van het open oog beker. Met behulp van uw 45 ° tang voorzichtig lijn de oogschelp, zodat een enkele, rechte snede kan worden gemaakt van de corneo-sclerale verdelen in de richting van de oogzenuw hoofd. Alle deelstukken moeten loodrecht op het corneo-sclerale verdeel-en-tenzij anders vermeld, moet zo dicht mogelijk bij de oogzenuwkop mogelijk te gaan zonder te snijden in. </li><li> Draai de oogschelp 180 °, behoud van de haaksheid met je lichaam. Gebruik techniek in stap 3.2 een tweede loodrechte snede te maken. </li><li> Draai de oogschelp en herhaal de techniek zoals beschreven in 3.2 tot en met twee meer bezuinigen. Alle vier de vlees moeten zo dicht mogelijk bij 90 ° uit elkaar mogelijk te maken. Houd er rekening mee dat het oog niet perfect bolvormig, dus er zullen een aantal variabiliteit. </li></ol> 4. Snijd elk van de vier "bloemblaadjes" in de helft, wat resulteerde in een acht-kroonblad bloem-achtige structuur <ol><li> Overdracht van de in vieren oogdop van de 35mm schotel naar een schoon objectglas. Met de oogschelp naar boven, schep onder het met de 45 ° tang. Til het uit van de vloeistof en plaats het op een schoon objectglas. </li><li> Met behulp van beide paren schuine pincet, open voorzichtig uit het oog, met de neurale netvlies naar boven. NIET VERWIJDEREN de neurale RETINA-it helpt het oog te houden een aantal van haar ronde vorm, zodat u niet werkt tegen. Het beschermt ook de RPE van wordt per ongeluk beschadigd in de volgende procedures. </li><li> Draai de dia totdat een van de bloemblaadjes is loodrecht op je lichaam. </li><li> Gebruik je 15 ° tang voorzichtig pak de hoek van het blaadje. De hoek van het blaadje moet worden hoornvlies, niet neurale netvlies of RPE. Til op de hoek zachtjes, waardoor het haar kromming behouden. </li><li> Plaats de onderste blad van je veer schaar tussen de bloemblaadjes en de dia. Line-up van uw schaar zodanig dat een enkele, rechte, loodrecht afgesneden kan worden gemaakt van de corneo-sclerale verdelen in de richting van de oogzenuw hoofd. Gesneden zo dicht mogelijk bij de oogzenuw hoofd als mogelijk is zonder te snijden in. Laten gaanhet kroonblad, waardoor het te liggen op de dia. </li><li> Draai het glaasje 90 °, zodat de volgende blaadje loodrecht op je lichaam. Herhaal stap 4.5. </li><li> Herhaal de stappen 4,5 en 4,6 keer meer. De resulterende structuur eruit moet zien als een acht-kroonblad bloem. </li></ol> 5. Verwijder de neurale netvlies <ol><li> Pipetteer 100-200 pi van 1X PBS op het monster. Dit voorkomt dat de neurale netvlies blijft plakken als je het af schil van de RPE. </li><li> Typisch de neurale netvlies is losjes aan de RPE. Maar het vergt wel oefening en vaardigheid om alleen de neurale netvlies en niet de RPE te verwijderen. Voorzichtig greep een bloemblad van de neurale netvlies met een paar schuine pincet te stabiliseren (ingedrukt) de rest van het oog met het andere paar van de schuine pincet. Trek de neurale netvlies weg van de rest van het oog. Herhaal deze procedure totdat het gehele neurale netvlies is verwijderd. * Tip: plak het puntje van je 15 ° pincet in de oogzenuw hoofd naar de ogen te verankeren. Gebruik dan de 45 ° tang op te vegen onder de neurale netvlies en til hem uit en weg. Het is meestal het beste om de neurale netvlies lift van de oogzenuw naar de corneo-sclerale verdelen. Zorg ervoor dat u weg te trekken eventuele losse resten van de iris. De iris is vrij kleverig en kan anders vast komen te zitten aan de RPE. </li><li> Spoel het preparaat met 1X PBS. Pipetteer 100-200 pi van 1X PBS in het model en zuigen het back-up. Gooi de PBS. Herhalen als nodig is om stof en vuil te verwijderen. </li></ol> 6. Mount je monster (s) op een dia <ol><li> Pipetteer 80 tot 90 pl van 90% glycerol op een nieuwe dia in een rechthoekige vorm. Gebruik maken van de zijde van de pipet tip om een ​​gelijkmatige, rechthoekige uitstrijkje van glycerol te maken. (Dit is de procedure voor het bevestigen van twee RPE op een dia.) </li><li> Steek de onderarm van 15 ° pincet onder het monster. Til het monster uit de ontleden dia. </li><li> Langzaam zakken het monster in de glycerol. Voorzichtig wiebelen de tang als je ze halen van onder het monster. </li><li> Herhaal de stappen 6,1-6,3 voor de andere exemplaren. </li><li> Draai het glaasje, zodat de lange zijde loodrecht op je lichaam. Houd je dekking van glas in een hoek van 45 ° naar de dia zodat het aanraken van de glijbaan. Verplaats het naar de glycerol uitstrijkje totdat ze aan te raken. Onderhouden van de contacten tussen het dekglas en schuif langzaam verplaats de dekking van glas uit de buurt van het uitstrijkje, naar de rand van de dia. Line-up van de lange zijden van de dia en het deksel glas, zodat ze parallel. Houd de hoeken van de dekking van glas tussen duim en wijsvinger. </li><li> Pak de 15 ° pincet in de andere hand. Cradle de bovenste (gratis) rand van het deksel glas in de holte van de arm. Heel langzaam, hoe lager het dekglas. Wanneer contact wordt gemaakt tussen de dekking van glas en de glycerol, stoppen en wachten tot de glycerol om te migreren. Herhaal deze zakken en wachten tot de RPE hele mounts zijn volledig gedekt. Dit is om de zeer stroperige glycerol voorkomen dat het vastleggen van luchtbellen. NIET Duw op de dekglaasje - de glycerol zal uit persen van onder hem, waardoor de hechting zeer slecht. </li><li> Met duidelijke nagellak, verf rond de perimeter waar de dekking van glas en schuif te ontmoeten. </li><li> Plaats de slide op de top van een lege rek te drogen. </li></ol> 7. Representatieve resultaten: Het resultaat van deze procedure moet een structuur die lijkt op een bloem en moet redelijk symmetrisch zijn. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Whole mount RPE van een wildtype C67Bl/6J muis. RPE uit zwart of agouti dieren worden donker bruin van kleur en moet een glad oppervlak te hebben. Is het normaal om golvingen aankondiging in de topografie van de bloemblaadjes. De pigmentatie op een geven monster kan enigszins variabel, als gevolg van een variabele dichtheid van pigmentatie van zowel de RPE en het onderliggende vaatvlies. Witte pijlen wijzen naar hypopigmented "kanalen" - dit is normaal en is te wijten aan de onderliggende bloedvaten van het oog. Blauwe pijl wijst naar fysieke schade aan zowel de RPE en het onderliggende vaatvlies. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Whole mount RPE van een verdunde muis. Monsters geoogst uit verdunde dieren kan variëren in kleur van bijna transparant tot cafe au lait en elk een exemplaar is om variabiliteit binnen het, in zwart aangegeven cirkels hier. In het algemeen, RPE geoogst van jongere dieren zijn lichter en die geoogst uit oudere dieren zijn donkerder. Zwarte pijlen geven een aantal van de onderliggende bloedvaten, die verschijnt hypopigmented. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Phalloidin kleuren kunnen worden gebruikt om fysieke schade aan de RPE op te sporen. Phalloidin kleuren schetst duidelijk de celmembranen, waarin de zeshoekige vorm van het epitheel. (A) Voorbeeld van een zwarte muis. (B) Voorbeeld van een verdunde muis. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Een slecht ontleed RPE van een verdunde muis. (A) Haakjes duiden op de marges van het hoornvlies die te breed zijn, wat kan leiden tot knik en / of vouwen. Binnen de zwarte cirkel zie je grote hoeveelheden van vreemde weefsel dat niet zijn verwijderd uit de achterkant van het oog. Ze zijn bijzonder duidelijk, omdat het monster is van een verdunde dier. Het blaadje op de linker onderkant is gedeeltelijk gevouwen. (B) De hele berg heeft het uiterlijk van een pinwheel. Zwarte pijlen geven een aantal van de bezuinigingen die werden gemaakt. Veel van de bezuinigingen van de corneo-sclerale verdelen in de richting van de oogzenuw zijn niet in lijn met de diameter. (C) Zwarte pijlen geven aan hoe de bezuinigingen had moeten worden, in lijn met de diameter en loodrecht op de raaklijn.

<ol><li>Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzo%28a%29pyrene+andX-rays+induce+reversions+of+the+pink-eyed+unstable+mutation+in+the+retinal+pigmentepithelium+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.%22%5BJournal%5D)">Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice.</a> Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).</li>
<li>Reliene, R. H. lavacove, Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diesel+exhaust+particles+cause+increased+levels+of+DNA+deletions+after+transplacental+exposure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice.</a> Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).</li>
<li>Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atm+deficiency+causes+increased+frequency+of+intrachromosomal+homologous+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice.</a> Cancer Res. 60, 395-399 (2000).</li>
<li>Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+WRN+helicase+domain+is+not+required+for+spontaneous+homologous+recombination-mediated+DNA+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion.</a> J. Nucleic Acids. , (2010).</li>
<li>Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1+suppresses+homologous+recombination+events+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53-%2C+and+Gadd45a-deficient+mice+show+an+increased+frequency+ofhomologous+recombination+at+different+stages+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development.</a> Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).</li>
<li>Bodenstein, L., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+development+of+the+mouse+retinalpigment+epithelium.+Part+I.+Cell+and+tissue+morphometrics+and+topography+of+mitoticactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity.</a> Dev Biol. 121, 192-204 (1987).</li>
<li>Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+phenotype+and+the+RPE%3A+is+the+answer+blowing+in+the+Wnt%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?</a> Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).</li>
</ol>

De RPE is de site van de p un test, een in vivo onderzoek van homologie-gericht te herstellen. De p un test is gebruikt om de effecten van de verschillende DNA-schade 1,2 en DNA-schade signalering en repair genen 3,4,5 op de frequentie van homologie-directed reparatie studie. Deze test is zeer gevoelig, het detecteren van single-cell gebeurtenissen op de RPE 1. Het kan ook ontdekken verschillen in de timing van homologie-directed reparatie...

<table><tbody><tr><td>rechte pincet</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-4903</td><td>punt: .08 x .04 mm materiaal: INOX</td></tr><tr><td>45&amp;#x00B0; pincet</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5005</td><td>punt: .05 x.01 mm materiaal: INOX</td></tr><tr><td>15&amp;#x00B0; &quot;gebogen&quot; pincet</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5045A</td><td>punt: .1 x.06 mm materiaal: INOX</td></tr><tr><td>veerschaar</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5604</td><td>gecombineerde puntbreedte 0.3mm lengte snijkant 3mm materiaal: roestvrij staal</td></tr><tr><td>binoculaire dissectiemicroscoop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Discovery V.8</td><td>gebruik reflecterende lichtbron</td></tr><tr><td>falloidine</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>Alexa Fluor 546</td></tr></tbody></table>

ontleding van een muis oog voor een hele berg van de retinaal pigment epitheel

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

De retinale pigment epitheel (RPE) ligt aan de achterkant van het oog zoogdieren, net onder de neurale netvlies, die de fotoreceptoren (staafjes en kegeltjes) bevat. De RPE is een monolaag van gepigmenteerde kubische cellen en medewerkers nauw samen met de neurale netvlies er net boven. Deze vereniging maakt de RPE van groot belang voor onderzoekers bestuderen van het netvlies ziekten. De RPE is ook de plaats van een in vivo onderzoek van homologie-gerichte DNA-reparatie, de p un test. De muis oog is bijzonder moeilijk te ontleden door zijn kleine formaat (ongeveer 3,5 mm in diameter) en de bolvorm. Dit artikel toont in detail een procedure voor dissectie van het oog wat resulteert in een hele berg van de RPE. In deze procedure, laten we zien hoe met, in plaats van werk tegen, de bolvormige structuur van het oog. Kortom, zijn het bindweefsel, spieren, en de optische zenuw verwijderd van de achterkant van het oog. Vervolgens worden het hoornvlies en de lens verwijderd. Vervolgens worden de strategische sneden gemaakt die leiden tot een aanzienlijke afvlakking van de resterende weefsel. Ten slotte wordt de neurale netvlies voorzichtig getild, onthullende een intact RPE, die nog steeds is bevestigd aan de onderliggende vaatvlies en de sclera. Deze hele mount kan gebruikt worden om de p un test of voor immunohistochemie of immunofluorescentie de beoordeling van de RPE weefsel uit te voeren.

Een formele demonstratie van het ontleden van een muis oog, wat resulteert in een hele berg van het retinale pigment epitheel.

Ontleding van een muis Oog voor een hele berg van de retinaal pigment epitheel

Het retinaal pigmentepitheel (RPE) bevindt zich aan de achterzijde van het oog van zoogdieren, direct onder de neurale retina, waarin de fotoreceptoren (staafjes en ...

Mijn naam is Allison Clavon. Ik ben onderzoeksassistent van Dr. Alex Bishop aan het Gree Children's Cancer Research Institute bij het UT Health Science Center in San Antonio, Texas. Vandaag ga ik demonstreren hoe u een oog van een knaagdier dissekeert om de volledige hoeveelheid van het retinaal pigmentepitheel te verkrijgen.Dit weefsel is van belang voor het bestuderen van de ontwikkeling van het netvlies en aanverwante ziekten, en is tevens de locatie voor een in vivo homology directed DNA repair assay. Laten we beginnen. Hier is een oog dat klaar is voor dissectie.Laten we eerst kijken naar de anatomische structuren die u gedurende de procedure als oriëntatiepunten zult gebruiken. Dit is het oog van een gedilueerd dier. Hier is de oogzenuw aan de achterzijde van het oog tegenovergesteld.Dit is het hoornvlies. De iris is door het hoornvlies heen zichtbaar. Het witachtige gebied aan de achterzijde van het oog is de sclera.Daarom wordt deze regio de cornea-sclerale overgang genoemd. De eerste stap van de dissectie is het verwijderen van overbodig weefsel, zoals spierbindweefsel en de nervus opticus. Vervolgens moet de cornea worden verwijderd door een cirkelvormige snede te maken.Op dit punt kan de lens worden verwijderd, waardoor een hol oogbekertje ontstaat. Vervolgens worden er vier sneden gemaakt vanaf de grens tussen het hoornvlies en het sclera in de richting van de papil van de oogzenuw. De resulterende structuur vertoont een gelijkenis met een bloem met vier bloembladen.Elk van deze vier bloemblaadjes wordt vervolgens in het midden doorgesneden, wat resulteert in een structuur die lijkt op een bloem met acht bloemblaadjes. In dit stadium kan het materiaal op sommige plaatsen knikken vanwege de sferische vorm. Om dit te voorkomen en een vlakker gatmontage te verkrijgen, kunnen er acht kortere inkepingen worden gemaakt vlak voorbij de knik.U heeft verschillende materialen nodig op uw werkstation, waaronder een 100 of 200 µL pipet en bijbehorende tips, een X-P-B-S-A schaaltje van 35 millimeter, objectglazen en dekglas, 90% glycerol en transparante nagellak voor de preparatie van de glaasjes, een rek voor het drogen van de glaasjes, een doos Kim-doekjes en een afvalbak voor biologisch materiaal. Naast deze gangbare materialen heeft u ook een set gespecialiseerde microdissectie-instrumenten nodig, waaronder rechte pincetten; pincetten onder een hoek van 45 graden worden gebruikt om het oog tijdens de dissectie vast te houden, te draaien en algemeen te manipuleren. Deze pincetten met een hoek van 15 graden zijn naar boven gebogen en worden eveneens gebruikt voor het hanteren en manipuleren van het oog.Ten slotte heb je een veer-schaar nodig. Het is zeer belangrijk dat je een veer-schaar gebruikt in plaats van een traditionele schaar. Controleer voor deze dissectie, voordat je begint met ontleden, of de hoogte van je stoel is aangepast zodat je ogen op gelijke hoogte met de oculairs staan wanneer je rechtop zit.Een gebogen houding bij de microscoop veroorzaakt schouder- en rugpijn en vermindert de kwaliteit van uw dissecties. Begin met het gieten van een hoeveelheid XPBS in het deksel van de schaal van 35 millimeter. Breng vervolgens de ogen die u wilt dissecteren over naar de schaal.Dit is een oog van een wildtype C 57 zwarte muis. Men kan zien dat het zeer klein is, met een diameter van ongeveer drie en een halve millimeter. De opaciteit van de sclera geeft het een blauwachtige tint.De eerste stap bij de dissectie is het verwijderen van alle overbodige weefsels rondom het oog, zoals spierbindweefsel en de oogzenuw. Hier heb ik de pincet van 45 graden in mijn linkerhand en de pincet van 15 graden in mijn rechterhand. U kunt één pincet gebruiken om het oog te stabiliseren terwijl u met de andere pincet het weefsel wegtrekt.Wanneer er een groot stuk weefsel loslaat, veegt u uw pincet voorzichtig schoon met een Kimwipe. Let er wel op dat u het oog niet plet of doorprikt. Een van de voordelen van het uitvoeren van deze dissectie in suspensie is dat u het bindweefsel gemakkelijk ziet wegzweven van het oog.Uiteindelijk bereikt u een punt waarop u met de pincet geen weefsel meer kunt verwijderen. Vervang de pincet met een hoek van 15 graden door de veerschaar. Gebruik de veerschaar om de nervus opticus door te knippen.Gebruik de buitenrand van het mesje om het weefsel naar voren te duwen richting de grens tussen het hoornvlies en het sclera. Trim vervolgens de schaar en veeg deze voorzichtig schoon met een kim wipe. Laten we dat nog eens bekijken.Duw het weefsel naar voren richting de grens tussen het hoornvlies en de sclera met de buitenrand van de schaar wanneer het weefsel omhoog staat. Trim het weefsel, blijf stukjes weefsel naar voren duwen met de stompe zijde van de schaar en trim deze vervolgens weg totdat al het overtollige weefsel is verwijderd. Er bevinden zich gewoonlijk twee banden van taai weefsel op het oog.De eerste is bevestigd bij de overgang tussen het hoornvlies en de sclera, en de tweede wordt getoond terwijl deze wordt bijgesneden. Hier bevindt men zich ongeveer halverwege de overgang tussen het hoornvlies en de sclera en de kop van de oogzenuw. De volgende stap in de dissectie is het verwijderen van het hoornvlies en de lens.Gebruik de 45 graden pincet om een flap op te tillen in ongeveer het midden van het hoornvlies. Maak vervolgens met de veerschaar een kleine incisie aan de basis van de flap. Voer het onderste blad van de schaar via de incisie onder de iris in.Maak een insnijding in de richting van, maar niet in, de grens tussen het hoornvlies en de sclera. Roteer nu het oog langzaam 360 graden en maak kleine insnijdingen rondom. Probeer de schaar onder de iris te houden, zodat zowel het hoornvlies als de iris tegelijkertijd worden doorgesneden.Het vergt veel oefening om dit zo gemakkelijk te doen als ik hier laat zien. Zodra het hoornvlies is verwijderd, draait u het oog op zijn zijkant en drukt u voorzichtig op de buitenkant van het oog om de lens naar buiten te duwen. De resterende structuur zal vervolgens beker-vormig zijn.Het oog moet in kwartieren worden verdeeld. Hiervoor draait u het oog op zijn zijkant en steekt u het onderste blad van uw veerschaar in. Maak een longitudinale snede in de richting van, maar niet geheel tot aan de papil van de oogzenuw.Houd hiervoor uw armen langs uw zij en uw schaar ongeveer loodrecht op uw lichaam en de ooginsnijding voor u. Maak de tweede snede direct tegenover de eerste snede. Neem de tijd om alles goed uit te lijnen, zodat u een gladde snede kunt maken.Het maken van meerdere sneden kan zorgen voor een kartelige rand, maar als deze zorgvuldig worden uitgelijnd, zijn ze niet merkbaar. Let op hoe ik in staat ben om met de bolvorm van het oog mee te werken in plaats van ertegenin, omdat het oog zijn normale vorm behoudt. Terwijl het is opgehangen in PBS, zal de rest van de dissectie op een objectglas plaatsvinden. Steun het oog met uw pincet met een hoek van 45 graden en til het uit de PBS.Plaats het oog op een schone objectglas. Vouw het oog voorzichtig open met behulp van beide paren geknikte pincetten. Let op de kleine rand van het hoornvlies en de iris rond de omtrek van het oog, wat handig is bij het hanteren.Vervolgens moet u elk van de vier bloemblaadjes doormidden snijden. Draai het oog zodanig dat een van de bloemblaadjes loodrecht op uw lichaam staat. Pak de hoek van het bloemblaadje vast met uw pincet met een hoek van 15 graden.Til het weefsel lichtjes op en maak vervolgens een incisie vanaf de grens tussen het hoornvlies en het sclera richting de papil van de oogzenuw. Deze incisies moeten loodrecht op een raaklijn staan. Een raaklijn is een lijn die loodrecht staat op de diameter.Uw sneden moeten daarom in lijn liggen met de diameter van het oog. Draai de objectglas nu zodat het volgende pedikel loodrecht op uw lichaam staat en herhaal de handeling. Pak de hoek van de pedikel vast.Til het weefsel voorzichtig op en snijd. Herhaal dit proces totdat elk van de vier grote bloemblaadjes in tweeën is gesneden. De witachtige substantie is het neurale retina, dat direct bovenop het RPE ligt.Het neurale netvlies kan het RPE beschermen, laat het daarom intact tot alle sneden zijn gemaakt. Let op dat de pedalen licht gebogen zijn. Werk niet tegen deze kromming in.Neem de tijd om de snede goed uit te lijnen, zodat u één schone snede kunt maken. Omdat het oog rond is, neigt het tot plooien; om dit te voorkomen, kunt u acht kortere inkepingen maken.Eén op elk bloemblad. Gebruik dezelfde basisstrategie als bij de vorige ronde van vier sneden. Til de hoek van het bloemblad op en snijd, maar snijd in dit geval slechts tot ongeveer halverwege de lengte van het bloemblad.Zodra alle incisies zijn gemaakt, kunt u het neurale retina verwijderen. Hier voeg ik een paar druppels 1x PBS toe aan het specimen. Zorg ervoor dat het RPE niet uitdroogt.Het neurale netvlies moet slechts losjes verbonden zijn met het onderliggende RPE. U kunt zien dat het vrij gemakkelijk loslaat. Meestal blijft het echter vastzitten bij de overgang tussen hoornvlies en sclera, wat aan de binnenzijde van het oog een hobbelige rand is die het ciliaire lichaam wordt genoemd.U kunt de punt van uw pincet van 15 graden in de oogzenuwkop plaatsen om het preparaat te verankeren terwijl u het neurale netvlies lostrekt. Het ciliaire lichaam markeert de rand van het RPE, het donker gepigmenteerde weefsel dat is losgekomen. Hier is de iris, niet het RPE.Ik raad aan om zoveel mogelijk van de iris te verwijderen, omdat deze erg kleverig is en kan omvouwen en aan het RPE blijven plakken als het neurale retina schilferig is of als er resten ervan aan het RPE vastgeplakt blijven. Waarschijnlijk is er een van twee dingen misgegaan. Ofwel de ogen zijn niet correct gefixeerd, bijvoorbeeld gedurende een te lange of te korte periode, of ze zijn te lang bewaard voordat de dissectie plaatsvond.Het pedaal dat ik hier blootleg heeft nog geen inkeping gehad. U kunt zien dat het pedaal zich ongeveer op een derde van de rand van de RPE bevindt. Dit is de reden waarom de acht inkepingen worden aanbevolen.Zodra alle neurale retina is verwijderd, spoelt u het RPE meerdere keren met 100 tot 200 µL PBS met behulp van een pipet, totdat al het stof en het debris zijn verwijderd. Pipetteer 80 tot 90 µL 90% glycerol in een rechthoekige vorm op een nieuw objectglas. Let op: dit is het optimale glycerolvolume voor een dekglas van 22 bij 50 mm en dient dienovereenkomstig te worden aangepast.Gebruik voor andere formaten dekglas de pipetpunt om het glycerol te verspreiden. Let erop dat er geen luchtbellen in het glycerol terechtkomen. Als er toch een bel ontstaat, sleep deze dan naar de rand zodat deze knapt.Schuif de onderste arm van uw pincet van 15 graden onder het RPE en til dit voorzichtig op, waarna u het RPE langzaam in de glycerol laat zakken. Het RPE zal op de glycerol drijven en kan enigszins krullen of draaien. Gebruik uw pincet om het RPE recht te trekken en om de glycerol over het oppervlak van het RPE te verspreiden.Indien er luchtbellen ontstaan: sleep deze terwijl u dit doet naar de rand waar ze zullen knappen, door het dekglas onder een hoek van ongeveer 45 graden vast te houden. Raak hiermee de rand van de glycerol aan.Verplaats het vervolgens naar de rand van het preparaatglas. Houd de onderkant van het dekglas vast met uw duim en wijsvinger en ondersteun de tegenoverliggende rand met uw pincet van 15 graden. Laat het dekglas zeer langzaam op het preparaatglas zakken zodra er contact is gemaakt.Stop met het laten zakken zodra u het RPE bereikt, zodat het glycerol kan migreren, en laat vervolgens uw dekglas langzaam verder zakken. Als u het dekglas te snel laat zakken, zullen er luchtbellen in uw preparaat terechtkomen. Ik laat het dekglas langzaam zakken terwijl het het RPE raakt, zodat het glycerol kan migreren.U ziet dat er luchtbellen ontstaan wanneer ik het dekglas te snel loslaat. Gebruik een ruime hoeveelheid transparante nagellak om de rand van het dekglas aan de objectglas te bevestigen, over de gehele omtrek.Dit is een typisch RPE van een C 57 zwarte muis. Het is normaal om onderliggende vasculatuur te zien, zoals hier aangegeven. Het is ook normaal om enige variatie in pigmentatie te zien, zoals plekken die minder gepigmenteerd lijken te zijn.Heldere plekken zoals deze zijn echter waarschijnlijk het gevolg van fysieke beschadiging van het RPE en het onderliggende choroidea. Omdat het choroidea van het oog ook gepigmenteerd is, is het mogelijk dat beschadiging van een zwart RPE onopgemerkt blijft als het choroidea intact blijft.Dit is een typisch RPE van een dilute muis. Zoals aangegeven, is de vasculatuur zichtbaar en is er sprake van variatie in pigmentatie, zoals donkere en lichtere vlekken. Het is echter vrijwel onmogelijk om schade op een dilute RPE waar te nemen.Zijn deze kleine vlekjes beschadigingen of is dit een normale variatie in pigmentatie? Ik stel een kleuring en staining voor om deze vraag te beantwoorden. Dit geeft u een idee of u te ruw met de I twee omgaat.De kleuring bakent de celmembranen duidelijk af, waardoor beschadigde plekken zichtbaar worden, maar in werkelijkheid is het RPE vrij veerkrachtig en is de kans op schade klein als u het oog bij het hoornvlies vasthoudt. Hier is een whole mount met een reeks problemen; het minst ernstige daarvan, hier aangegeven, is een te brede marge van het hoornvlies, wat kan leiden tot kromtrekken en plooien van het golvende materiaal. Hier is te zien dat er een aanzienlijke hoeveelheid vreemd weefsel op de achterkant van het oog is achtergebleven.Dit pedaal is gedeeltelijk omgevouwen, en hier is te zien dat het RPE gedeeltelijk is gescheurd. Een ander probleem is dat dit oog de aanblik heeft van een windmolen. Hier heb ik de hoeken van de incisies ingetekend.Dit is echter hoe ze hadden moeten zijn. Onthoud dat uw sneden loodrecht op de raaklijn en in lijn met de diameter moeten staan. Ik heb zojuist gedemonstreerd hoe u een muis-oog moet dissekeren voor een whole mount van het retinaal pigment.Epitheel, het belangrijkste is om een goede houding aan te nemen, maar probeer ontspannen te blijven. Ik hoop dat u deze video nuttig vond en wens u veel succes met uw toekomstige experimenten.

dissection-mouse-eye-for-whole-mount-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De dissectie techniek illustreert ingewanden te ontdoen van het glasvocht, netvlies, en de lens van de muis oog, scheiding door centrifugeren, en karakterisering met eiwit assays.

Verwijderen van de ingewanden van de muis glasvocht en het netvlies voor Proteoom Analyses

De dissectie techniek illustreert enucleatie van de muis oog voor weefsel fixatie te fenotypering presteren in high-throughput-schermen.

Mouse Eye Enucleatie voor Remote High-throughput Fenotypering

Het hier beschreven protocol is voor structurele beoordeling van een wholemount retinale preparatie. Dit omvat beschrijvingen van weefseldissecatie, montage op een hydrofiliseerde polytetrafluorethyleen (PTFE) membraaninzet, bolusbelasting met fluorescente markeringen, en een vergelijking van fixatie met carbodiimide en paraformaldehyde voor immunohistochemische analyse van cellulaire en synaptische componenten.

Geoptimaliseerd protocol voor Retina Wholemount Voorbereiding voor Imaging en Immunohistochemistry

Dit rapport beschrijft uitgebreide methoden voor de voorbereiding van bevroren muis Retina secties voor Immunohistochemistry (IHC).  Beschreven methoden omvatten dissectie van de oculaire posterior Cup, Paraformaldehyde fixatie, inbedding in optimale snij-temperatuur (OCT) media en weefsel oriëntatie, sectioneren en immunokleuring.

Voorbereiding van de muis netvlies Cryo-profielen voor Immunohistochemistry

Dit protocol, dat oorspronkelijk werd gerapporteerd door Fernandez-Godino et al. in 20161, beschrijft een methode om RPE-cellen van muizen efficiënt te isoleren en te cultiseren, die binnen een week een functionele en gepolariseerde RPE-monolaag vormen op Transwell-platen. De procedure duurt ongeveer 3 uur.

Efficiënte dissectie en cultuur van primaire muis retinale pigment epitheelcellen

Dit artikel presenteert een protocol voor oculaire microdissectie bij knaagdieren. Het proces omvat de enucleatie van de oogbol samen met het nictitating membraan (d.w.z. het derde ooglid). Dit wordt dan gevolgd door de scheiding van de achterste en voorste oogschelpen.

Microdissectie van het knaagdieroog

Muismodellen kunnen nuttige hulpmiddelen zijn voor het onderzoeken van de biologie van het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE). Er is vastgesteld dat muizen een reeks RPE-pathologieën kunnen ontwikkelen. Hier beschrijven we een fenotyperingsprotocol om RPE-pathologieën bij muizen op te helderen en te kwantificeren met behulp van licht, transmissie-elektron en confocale microscopie.

Een protocol voor het evalueren en kwantificeren van retinale gepigmenteerde epitheelpathologieën in muismodellen van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie

Retinaal pigmentepitheel (RPE) fungeert als een cruciale barrière tussen het vaatvlies en het netvlies en bevordert de gezondheid en functie van retinale celtypen, zoals fotoreceptoren. Hierin beschrijven we een eenvoudig en effectief protocol voor het isoleren en kweken van RPE van volwassen muizen.

Een vereenvoudigde methode voor isolatie en kweek van retinale pigmentepitheelcellen van volwassen muizen

Dit protocol beschrijft de procedure voor het isoleren van het netvlies van de hele muis en het uitvoeren van immunokleuring om alle retinale ganglioncellen (RGC's) te labelen. Het proces wordt gevolgd door het in beeld brengen en automatisch tellen van RGC's met behulp van op AI gebaseerde software, waardoor een eenvoudige, snelle en nauwkeurige methode wordt geboden voor het kwantificeren van RGC's in het hele netvlies van de muis.

Immunokleuring en automatische telling van retinale ganglioncellen van muizen

Er wordt een protocol beschreven voor het voorbereiden van retinale cryosecties van muizen en het uitvoeren van immunokleuring op fotoreceptoren. Dit artikel stelt onderzoekers in staat om consequent bevroren secties van het netvlies van muizen te produceren met goed bewaarde morfologie en hoogwaardige immunokleuringsresultaten.

Cryosectie en immunokleuring van het netvlies van de muis

Het netvlies vertoont een complexe ruimtelijke organisatie over zijn laminaire structuur. Moderne ruimtelijke transcriptomics en sequencingtechnieken vereisen weefselcoupes &lt; 20 μm dik, waardoor hun toepasbaarheid voor retinaal onderzoek wordt beperkt. Deze vers ingevroren cryosectiemethode produceert dunne delen van het netvlies van de muis met behoud van vlakke ruimtelijke relaties, waardoor uitgebreide moleculaire kartering over laminae mogelijk is.

En gezicht Cryosectie van het netvlies van de muis voor hoogdimensionale ruimtelijke moleculaire analyse

Leer de dissectie van een muizenogen om een whole mount van het retinale pigmentepitheel te verkrijgen. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar retinale ontwikkeling en ziekten in vivo.

Ontleding van een muis Oog voor een hele berg van de retinaal pigment epitheel

Meer video's verkennen