Name: Organotypische Cerebellaire culturen: apoptotische uitdagingen en Detectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Leer organotypische cerebellaire culturen maken om apoptose te bestuderen in muizen. Deze methode analyseert celoverleving met immunofluorescentie na fast ligand-behandeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd deels gefinancierd door de IPSEN Foundation. IMV is een American Cancer Society hoogleraar Moleculaire biologie, en houdt de Irwin en Joan Jacobs leerstoel Voorbeeldige Life Sciences. Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de NIH, Leducq Foundation, Meriaux Stichting, Ellison Medical Foundation, Ipsen / Biomeasure, Sanofi Aventis, Prostate Cancer Foundation, en de HN-en Frances C. Berger Foundation. PAS wordt gefinancierd door McKnight Endowment Fund voor Neurowetenschappen en het National Institute on Drug Abuse (R01 DA019022). De auteurs willen graag aan Mark Schmitt bedanken. Grafische kunst werd ontworpen door Jamie T. Simon. Sponsoring werd vriendelijk verschaft door Invitrogen.

1. Organotypische Cerebellaire culturen: <ol><li> Om met succes het genereren van organotypische cerebellaire culturen gebruiken muizen tussen P0-P3 of P8-P12. Voor ons experiment gebruikten we muizen in de P8-P12 range omdat deze ontwikkelingsfase is meer geschikt voor ons onderzoek. </li><li> Bereid de dissectie en het kweekmedium: <ol><li> Brain dissectie en slice voorbereiding worden uitgevoerd in een laag natriumgehalte Kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) met 1 mM calciumchloride, 10mm D-Glucose, 4mm kaliumchloride, 5mM magnesiumchloride, natriumbicarbonaat 26mm, 246mm sucrose en fenol rode oplossing (1:1000) , pH 7,3. Voor het steriliseren van de oplossing, filter het door een 0,22 um filter en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Cerebellaire plakjes worden gekweekt in 75% Minimum Essential Medium Eagle (MEM), 25% hitte-geïnactiveerd serum paard, 25mm HEPES, 1 mM glutamine, 5 mg / ml glucose, penicilline (100 U / ml) en streptomycine (100 U / ml). Filter het medium door een 0,22 um filter en bewaren bij 4 ° C voor een maximum van twee weken. </li></ol></li><li> Ontleden hersenen in ijskoude ACSF medium eerder borrelen met Carbogen (95% zuurstof en 5% kooldioxide) Let op, zal dat verzadiging met Carbogen veranderen de pH van de oplossing dus het zal verschuiven van rood naar oranje. De dissectie moeten worden uitgevoerd in het minimum van tijd mogelijk en let niet op de hersenstructuur schade. </li><li> Snijd de hersenen in sagittale secties van 400 urn met behulp van een vibratome. <ol><li> Maak een sagittale snijden met een scheermesje in een halfrond, proberen om zo weinig mogelijk van de kleine hersenen gesneden, dit zal een vlakke ondergrond voor het snijden te bieden. De cortex wordt alleen gebruikt voor ondersteuning om het snijden makkelijker, maar omdat de tijd is een belangrijke kwestie is het handiger uit te snijden de rostrale helft van de cortex met een scheermesje. </li><li> Gebruik cyanoacrylaat (Superlijm) om de positie van de hersenen vast op de metalen vibratome plaat. Het is belangrijk om de plaat op het ijs chill voor het toevoegen van de lijm en goed verspreiden met behulp van de punt van de buis om een ​​dunne lijmlaag te vormen. Als er een overmaat van Superlijm, zal het los van de plaat als het in contact komt met de ACSF en het monster zullen verloren gaan. </li><li> Zodra de hersenen is bevestigd aan de vibratome plaat, voeg genoeg ACSF media om de hersenen te dekken en het ijs zet onder het bord te houden het koud. </li><li> Snijd 400 micrometer plakjes en breng ze met een plastic Pasteur pipet (snijd de tip om het te verbreden en te voorkomen dat schade aan het plakken) om een ​​6-well celkweek plaat met ACSF op ijs. </li><li> Scheid de kleine hersenen van de rest van de hersenen met behulp van twee insulinespuiten (spuiten met een kleine diameter 28-gauge naalden) onder de microscoop te ontleden. Sommige schijfjes zullen Superglue aan de randen: dit is het moment om te proberen om hem te verwijderen als het kan de levensvatbaarheid van de slice beïnvloeden. Het is belangrijk om zorgvuldig te doen zonder schade aan de cerebellaire structuur. </li></ol></li><li> Breng de plakjes cerebellaire tot 6-well platen met 30mm cultuur plaat wisselplaten met 0,4 um poriën. Voeg 1 mL van de cultuur media per goed, dat was door de pre-incubatie gedurende ten minste 2 uur bij 37 ° C en 5% CO 2 (in de celkweek incubator). Plaats de inzetstukken op de top van de media om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen ingesloten onder en vervolgens de cerebellaire plakjes (1-3 per insert) plaats op de top van de inserts ervoor te zorgen dat ze zijn volledig uitgebreid en dat er geen vloeistof is ze te bedekken. Aspireren overmaat van media als dat nodig is. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 het veranderen van de cultuur van media om de 2 of 3 dagen. Het beste is om slechts een gedeelte van het medium (bijv. ½ volume) te vervangen in een keer, aangezien de gebruikte medium bevat slice-afgeleide trofische factoren die belangrijk zijn voor overleving van de cel. </li></ol> 2. Fas behandeling en kleuring van Cerebellaire Slices: <ol><li> Voor de apoptotische uitdaging experiment, moeten we eerst de cultuur van de schijfjes gedurende 5 dagen veranderen van media op dag 3 in vitro (DIV3). Op DIV5 culturen zijn behandeld met 0,5 ug / ml van de Fas agonist antilichaam Jo2 door het toevoegen van het direct aan de media om een ​​schone achtergrond van celdood hebben sinds de veranderingen van de media kunnen leiden tot een aantal sterfte in de culturen. De helft van de putten worden niet behandeld als controlegroep. </li><li> Na 24 uur verwijdert u de media onder de inserts door zuiging. Om vast te stellen de plakjes, voeg 1 ml ijskoude 4% PFA onder en 1 ml boven de insert. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Na 10 minuten verwijderd van de PFA en spoel kort met koud PBS. </li><li> Volgende verwijder de PBS en voeg 1 ml onder en 1 ml boven de insert van 20% ijskoud methanol in PBS en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was opnieuw met PBS en voeg 1 ml onder en 1 ml boven de insert van 0,5% Triton-X-100 in PBS voor permeabilisatie. Incubeer voor een minimum van 12 uur bij 4 ° C. </li><li> Na permeabilisatie, blok met 20% BSA in PBS voor een minimum van4 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. In dit stadium van de schijfjes kan worden gehouden in het blokkeren van oplossing voor ten minste 3 dagen bij 4 ° C. </li><li> Om vlekken op de plakjes voorzichtig het stukje van het membraan gesneden te voegen aan de cerebellaire slice en overbrengen naar 24-well platen met PBS. </li><li> De immunokleuring is sequentieel gedaan, eerst met TUNEL reagens voor een uur en dan met Calbidin antilichaam 's nachts. <ol><li> Zuig het PBS en voeg 250 ul uit TUNEL reagens in elk putje en zorg ervoor dat beslaat de hele oppervlakte van de slice. Incubeer bij 37 ° C gedurende een uur in het donker. </li><li> Na een uur verwijderd van de TUNEL mix en wassen met PBS drie keer voor 10 minuten. </li><li> Na de laatste wasbeurt, verwijder de PBS en voeg 250 ui van een 1 / 1000 verdunning van de Calbindin antilichaam in PBS en incubeer overnacht bij 4 ° C in het donker. </li><li> Verwijder het primaire antilichaam oplossing en wassen met PBS drie keer voor 10 minuten. </li><li> Voeg 250 ul van secundair antilichaam verdund 1 / 500 in PBS en incubeer gedurende ten minste drie uur bij kamertemperatuur in het donker. De TUNEL kit we gebruikten is gemerkt met TMR rood, dus onze tweede antilichaam voor Calbindin is geconjugeerd aan Alexa-488. </li><li> Was driemaal gedurende 10 minuten met PBS en monteer de plakjes op een glazen microscoopglaasje met behulp van een montage media DAPI bevat. </li><li> Het imago van de plakjes met een confocale microscoop met behulp van de 488 nm en 561 nm excitatie golflengte voor Calbindin en TUNEL respectievelijk. </li></ol></li></ol> 3. Representatieve resultaten: De belangrijkste uitdaging van dit protocol is om te kunnen gezond cerebellaire slice culturen te genereren, vooral sinds onze laatste uitlezing zal celdood worden. Een gezonde cultuur verschijnt als een waar de cel lichaam laag is doorzichtig en laat u zien dat de gelaagde structuur van het cerebellum onder de microscoop (zie figuur 1). Na een paar dagen in de cultuur van de plakjes beginnen te dun en niet-neuronale cellen kan worden waargenomen migratie uit de buurt van de marge van de slice. De donkere ronde cellen (waarschijnlijk macrofagen) dat de schijfjes te dekken na een paar dagen in cultuur, zal uiteindelijk daling van het aantal na 10-14 dagen in vitro (figuur 2) 5. Het ultieme bewijs voor de levensvatbaarheid van de schijfjes is het vlek voor de verschillende cellulaire merkers, zoals Calbindin voor de Purkinje-cellen. Figuur 3 toont een vertegenwoordiger confocale microscoop beeld van de Purkinje cel laag met een aantal TUNEL positieve kernen. Het is belangrijk aan te nemen dat zelfs wanneer sommige plakken kregen een apoptotische stimulus, ze alleen werden blootgesteld gedurende 24 uur. Deze voldoende tijd krijgen om DNA-fragmentatie observeren in de stervende cellen met de TUNEL kleuring, maar een bepaald Purkinje cel laag was nog steeds aanwezig. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Gezonde cerebellaire slice op DIV2. Deze afbeelding toont de doorschijnende cellichaam laag en de gelaagde structuur van het cerebellum in een gezond slice. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Gezonde cerebellaire slice bij DIV 7. In dit beeld kunnen we nog steeds de gelaagde structuur van het cerebellum en de verschijning van donkere cellichamen observeren. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Representatief beeld van een Fas-behandelde cerebellaire slice. Confocale Deze afbeelding toont de Purkinje-cellen gekleurd met Calbindin (groen) en de apoptotische cellen positief voor TUNEL kleuring (rood). Purkinje cellen worden niet weergegeven in een enkele rij, maar zijn geclusterd het vormen van een folium-achtige structuur.

<ol><li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+ependymal+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Human fetal ependymal cells in tissue cultures.</a> Anat Rec. 99, 523-529 (1947).</li>
<li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+studies+of+human+fetal+brain+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Etudes+Neonatales%22%5BJournal%5D)">Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures.</a> Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).</li>
<li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+protocol+for+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeat%2C+H+%22Organotypic+Slice+Cultures+of+Neural+Tissue+in+Culturing+Nerve+Cells%22">Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).</li>
</ol>

Alle dieren uitgevoerd werk werd gedaan in overeenstemming met het beleid van de IACUC. Het Salk Institute is een AAALAC geaccrediteerde faciliteit.

Deze methode beschrijft een van de vele mogelijke toepassingen van neuronale organotypische culturen en het heeft ons toegestaan ​​om het effect van apoptotische stimuli studie in wild-type en mutant cerebellaire plakjes. Het meest kritische deel van dit experiment is om te kunnen consequent genereren van gezonde cerebellaire slice culturen. De belangrijkste factoren zijn dissectie en snijden techniek en de mogelijkheid om het protocol uit te voeren in de kortst mogelijke tijd, maar tegelijkertijd zorg dat u de plakjes schade. Een andere cruciale factor is de voorbereiding en samenstelling van de kweekmedia, deze culturen zijn erg gevoelig, dus moesten we een aantal recepten en merken van de media te testen. Zelfs verschillende batches van serum of een andere onderdelen van de media invloed kunnen zijn op de levensvatbaarheid van de schijfjes. We hebben de beste resultaten met het Paard Serum van Invitrogen Lot # 480116. Zodra de cerebellaire schijfjes worden gegenereerd men kan studeren cerebellaire ontwikkeling, elektrofysiologie, overleving van de cel alleen of in reactie op apoptotische stimuli, excitotoxiciteit of zuurstoftekort. Vergelijkende studies met behulp van wild type en mutante cerebellaire schijfjes zijn zeer verhelderend in vele aspecten van de kleine hersenen en de ontwikkeling.

<table><tbody><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>Paardenserum</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Secondelijm</td><td>Krazy Glue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-wells / 24-wells celkweekplaten</td><td>Corning</td><td>3506/ 3527</td><td></td></tr><tr><td>30mm kweekplaat-inserts (0.4-&amp;mu;m poriën)</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Gezuiverd NA/LE hamster anti-muis CD95 (Jo2)</td><td>BD Biosciences</td><td>554254</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In situ&lt;/em&gt; celdood-detectiekit, TMR rood</td><td>Roche Group</td><td>12 156 792 910</td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-Calbindin D-28k antilichaam</td><td>Swant</td><td>CB-38a</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-geit anti-konijn IgG secundair antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield montage medium met DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratoom</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

organotypische cerebellaire culturen: apoptotische uitdagingen en detectie

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypische culturen van neuronaal weefsel werden voor het eerst geïntroduceerd door Hogue in 1947 1,2 en hebben gevormd een belangrijke doorbraak op het gebied van de neurowetenschappen. Sindsdien werd de techniek verder ontwikkeld en momenteel zijn er veel verschillende manieren om organotypische culturen te bereiden. De hier gepresenteerde methode werd aangepast van de ene beschreven door Stoppini et al.. Voor de voorbereiding van de plakken en van Gogolla et al.. Voor de kleuringsprocedure 3,4. Een uniek kenmerk van deze techniek is dat het u toestaat om te studeren verschillende delen van de hersenen, zoals hippocampus of cerebellum in hun oorspronkelijke structuur, waardoor een groot voordeel ten opzichte van gedissocieerd culturen waarin alle cellulaire organisatie en neuronale netwerken zijn verstoord. In het geval van het cerebellum is het nog voordeliger omdat het toelaat de studie van de Purkinje cellen, zeer moeilijk te verkrijgen als gedissocieerd primaire cultuur. Deze methode kan worden gebruikt om bepaalde ontwikkelings-functies van het cerebellum in vitro onderzoek, evenals voor elektrofysiologische en farmacologische experimenten in zowel wild type en mutante muizen. De hier beschreven methode werd ontworpen om het effect van apoptotische stimuli zoals Fas-ligand in de ontwikkelingslanden cerebellum onderzoek, met behulp van TUNEL kleuring tot apoptotische celdood te meten. Als TUNEL kleuring wordt gecombineerd met celtype specifieke markers, zoals de Calbindin voor Purkinje cellen, is het mogelijk om celdood te evalueren in een cel populatie specifieke manier. De Calbindin vlekken dient ook het doel van de evaluatie van de kwaliteit van de cerebellaire culturen.

Deze methode beschrijft de generatie van organotypische cerebellaire culturen en het effect van bepaalde apoptotische stimuli op de levensvatbaarheid van de verschillende cerebellaire celtypen.

Organotypische Cerebellaire culturen: apoptotische uitdagingen en Detectie

Organotypische culturen van neuraal weefsel werden voor het eerst geïntroduceerd door Hogue in 1947 1,2 en hebben een belangrijke doorbraak betekend in het vakgebied van de neurowetenschappen. ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om het effect van de apoptotische stimulus fast ligand in het ontwikkelende cerebellum van wild-type en mutante muizen te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst de hersenen van wild-type en knockout-muizen te dissekeren tussen postnatale dag 8 en 12. De tweede stap is om de hersenen in plakjes van 400 µm dik te snijden en het cerebellum uit elk plakje te isoleren.De derde stap is het kweken van de cerebellaire coupes gedurende vijf dagen om er zeker van te zijn dat ze gezond zijn voordat celdood wordt geïnduceerd met fast ligand. De laatste stap van de procedure is het analyseren van het effect van fast ligand in de verschillende cerebellaire celpopulaties van wild-type en knockout-muizen, op basis van immunofluorescente kleuring voor de apoptotische marker TUNEL, gecombineerd met celtype-specifieke markers zoals calbindine voor Purkinje-cellen. Het belangrijkste voordeel van cerebellaire organotypische kweken is dat ze het behoud van de regionale structuur van het cerebellum mogelijk maken, in tegenstelling tot primaire gedissocieerde kweken waarbij de neuronale netwerken en cellulaire organisatie zijn verstoord.Zo kan dit onderwerp enkele kernvragen in de neurowetenschappen beantwoorden, vooral omdat zowel de wild-type als de mutante muis beschikbaar zijn. Hierdoor kan men de comparatieve ontwikkeling bestuderen, evenals de fysiologie, elektrofysiologie en farmacologie. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de functie van fast ligand bij overleving van cerebellaire cellen, kan ze ook worden gebruikt om de effecten van fast ligand in de cortex en hippocampus te onderzoeken.Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het essentieel is om de weefsels zo snel mogelijk in kweek te plaatsen zonder hun integriteit in gevaar te brengen om een gezonde cerebellaire lysis te verkrijgen. Daarom is het belangrijk om over goede dissectie- en snijvaardigheden te beschikken voordat men het gehele proces probeert, waar dat mogelijk is.De stappen van de volgende procedure moeten in een weefselkweekkast worden uitgevoerd voorafgaand aan de dissectie. Bereid A CSF-medium voor de hersendissectie en het bereiden van de coupes, evenals het medium voor de coupecultuur volgens het schriftelijke protocol en bewaar deze op de dag van dissectie bij vier graden Celsius. Bereid weefselkweekplaten voor het cultiveren van de cerebellaire coupes.Voeg één milliliter kweekmedium voor coupes toe aan elke well van een zes-wells plaat. Gebruik vervolgens steriele pincetten om de inzetstukken voor de kweekplaat in elke well te plaatsen. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder het inzetstuk gevangen zitten.Plaats de kweekplaat in een weefselkweekincubator die is ingesteld op 37 °C en 5% koolstofdioxide gedurende ten minste twee uur om het medium voor te conditioneren. Laat vervolgens carbogengas door het ijskoude CSF-medium borrelen; de verzadiging van het medium met carbogeen verandert de pH van de oplossing en veroorzaakt een kleurverandering van rood naar oranje.Giet een kleine hoeveelheid ijskoud, gebelderd A CSF-medium in een steriele Petrischaal en in een zes-wells plaat. Plaats deze op ijs, samen met de plaat van de vibratoom die zal worden gebruikt voor het snijden van de hersenen. De Petrischaal met gebelderd ijskoud A CSF-medium zal worden gebruikt voor het dissekeren van de hersenen van een muizenpupt van P8 tot P12 na dissectie.Gebruik een scheermesje om een sagittale snede in één hemisfeer te maken om een vlak oppervlak te creëren voor montage op de vibramplaat. Het rostrale deel van de cortex mag ook worden weggesneden. Droog de gekoelde vibramplaat af met een papieren handdoek.Voeg vervolgens een kleine hoeveelheid secondelijm toe aan de objecttafel en verspreid deze in een zigzagpatroon met de punt van de lijmtube. Om een dunne lijmlaag te vormen, gebruikt u een spatel om de hersenen over te brengen naar de vibratietafel, waarbij de afgeplatte zijde in contact komt met de secondelijm. Zodra de hersenen aan de vibratieplaat zijn bevestigd, voegt u voldoende A CSF-medium toe om de hersenen te bedekken en plaatst u ijs onder de plaat om deze koud te houden.Snijd de hersenen in plakjes van 400 micrometer. Gebruik vervolgens een plastic pastapipet met een afgeknipt, verbreed uiteinde om de plakjes onder een dissectiemicroscoop over te brengen naar de zes-wellsplaat met A CSF-medium op ijs.Gebruik twee insulinespuiten met dunne naalden van gauge 28 om het cerebellum van de rest van de hersenen te scheiden. Als er op de rand van de plakjes secondelijm zit, gebruik dan de twee spuitnaalden om de lijm van het plakje te verwijderen. Gebruik de plastic pastapipet met een afgeknipt, verbreed uiteinde om de plakjes bovenop de filters over te brengen.Door één tot drie plakjes per insert toe te voegen, wordt gewaarborgd dat de plakjes volledig zijn uitgestrekt en dat ze niet door vloeistof worden bedekt. Aspireer indien nodig overtollig medium met de pipet; incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 48 uur. Vervang na 48 uur de helft van het mediumvolume door vers medium, waarbij u erop let dat er geen luchtbellen onder de insert bekneld raken.Het resterende oorspronkelijke medium bevat afgeleide trofische factoren die essentieel zijn voor de overleving van de cellen. De apoptotische uitdaging wordt uitgevoerd na vijf dagen cultuur. Voeg het fast agonistische antilichaam JO twee toe aan het celkweekmedium in de putjes die behandeld moeten worden.Laat de helft van de wells onbehandeld als controles. Zodra er 24 uur zijn verstreken, wordt het medium uit de wells geaspireerd. Fixeer vervolgens de coupes door één milliliter ijskoud, 4% paraformaldehyde onder de insert en één milliliter PFA boven op de insert te pipetteren.Laat de coupes fixeren in de PFA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Aspireer de PFA en was kort met twee milliliters koud PBS door middel van pipetteren. Breng één milliliter bovenop de insert en één milliliter onder de insert aan.Aspireer vervolgens de PBS en pipetteer één milliliter ijskoude 20% methanol in PBS onder de insert en één milliliter boven de insert. Incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur, aspireer daarna de 20% methanol uit de well en was de slice en D well met PBS. Pipetteer, zoals eerder gedaan, één milliliter 0,5% Triton X 100 in PBS bovenop de insert en nogmaals één milliliter onder de insert.Incubeer gedurende minimaal 12 uur bij vier graden Celsius om de coupes te permeabiliseren na de permeatie. Aspireer de 0,5% Triton X 100 in PBS en pipetteer één milliliter 20% BSA in PBS bovenop de coupe en één milliliter onder de coupe. Blokkeer de coupes gedurende minimaal vier uur bij kamertemperatuur of overnacht bij vier graden Celsius.Wanneer het blokkeren is voltooid, gebruik dan een schone schaar om het stukje membraaninsert dat aan de cerebellaire slice is bevestigd voorzichtig weg te knippen. Gebruik vervolgens een schone pincet om het stukje membraan over te brengen naar een 24-well plaat met PBS, aspireer de PBS en voeg 250 µL tunnel-reagens toe aan elke well. Zorg ervoor dat het reagens het gehele oppervlak van de slice bedekt.Incubeer gedurende één uur in het donker bij 37 °C. Aspireer na afloop van het uur het tunnelreagens uit de wells en vervang dit door 500 µL PBS. Bescherm de plaat tegen licht en incubeer deze gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om te wassen.Herhaal dit proces twee keer na de laatste wasstap. Aspireer de PBS en voeg 250 µL van een 1:1000 verdunning van het calbindine-antilichaam in PBS toe en incubeer dit gedurende de nacht bij 4 °C in het donker. De volgende dag.Zuig de primaire antilichaamoplossing af en was 3 keer met PBS gedurende 10 minuten. Voeg vervolgens 250 µL secundair antilichaam toe, verdund 1:500 in PBS. Dek de plaat af met aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen en incubeer gedurende ten minste drie uur bij kamertemperatuur na de incubatie.Was de coupes drie keer gedurende 10 minuten met PBS en gebruik montage medium dat DAPI bevat. Monteer de coupes op een glazen microscoop OBJECTglas en een dekglas. Beeld de coupes af met een confocale microscoop met behulp van de excitatiegolflengten van 488 nanometer en 561 nanometer voor respectievelijk kale, bendin en tunnel.Deze afbeelding toont een gezonde cerebellaire slice. Na twee dagen in vitro ziet de cellichaamlaag er doorschijnend uit en is de geplooide structuur van het cerebellum duidelijk zichtbaar onder de microscoop. Na zeven dagen in vitro is de geplooide structuur van de gezonde cerebellaire slice nog steeds zichtbaar.Daarnaast zijn de coupes meestal bedekt met donkere cellichamen, waarschijnlijk macrofagen. De hier getoonde confocale afbeelding is representatief voor een snel behandelde cerebellaire coupe. De bikini-cellen kleuren groen na kleuring met een primair antilichaam, gevolgd door een secundair antilichaam geconjugeerd met Alexa 488.De apoptotische cellen die positief zijn voor TUNEL-kleuring verschijnen rood, aangezien de gebruikte TUNEL-kit is gelabeld met TMR. Rode Bikini-cellen verschijnen niet in een enkele rij, maar vormen clusters in een clusterachtige structuur. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om zoveel mogelijk in een weefselkweekkast te werken en de tijd dat het cerebrale weefsel is blootgesteld aan mogelijke contaminanten zoals bacteriën of schimmels te minimaliseren.Met deze procedure kunnen andere methoden op deze coupes worden toegepast, waaronder biochemische en elektrofysiologische analyses om aanvullende informatie te verkrijgen over het eiwitgehalte en de neuronale exciteerbaarheid. Deze techniek werd oorspronkelijk ontwikkeld om het effect van snel gemedieerde celdood te bestuderen in Perkin-cellen met mutaties die de snelle route beïnvloeden. Perial-cellen overleven zelden in primaire culturen.Deze procedure was dus de beste experimentele aanpak. Ik hoop dat u na het bekijken van deze video een goed beeld heeft van hoe u cerebrale schijfjes kunt maken en hoe men epileptische stimuli en het effect daarvan op verschillende typen cerebrale cellen kan bestuderen.

organotypic-cerebellar-cultures-apoptotic-challenges-and-detection

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Live-cell imaging van caspase-3-gemedieerde apoptose in vereeuwigd N19-oligodendrocyt celculturen met behulp van...

Monitoring gekliefde caspase-3 activiteit en apoptose van geïmmortaliseerde Oligodendrogliale cellen met behulp van live-cell imaging en Cleaveable fluorogene-dye Substraten Na Kalium-geïnduceerde membraandepolarisatie

We beschrijven een protocol dat toelaat om en kwantitatief beoordelen van de morfologie van de dendritische structuur van afzonderlijke Purkinje cellen gekweekt in organotypische cerebellum slice culturen. Dit protocol is bedoeld om studies te bevorderen over de mechanismen van Purkinje cel dendritische ontwikkeling.

De Analyse van de Purkinje cel dendritische morfologie in organotypische slice culturen

This video illustrates a technique for obtaining cerebellar organotypic slices from a mouse pup's brain and culturing the slices in media supplemented with nutrients and growth factors to mimic cerebellar development in vitro. Additionally, specific cerebellar slices are treated with a test compound, and the compound's neuroprotective ability is analyzed using an immunofluorescence staining technique.

Analyzing Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

This video demonstrates the method of identifying neurons from a mixed culture of cerebellar granule neurons and glial cells using dual staining with fluorescein diacetate (FDA) and propidium iodide (PI), where live neurons appear green and dead neurons appear red.

Assessing Neuronal Viability in a Cerebellar Neuron Culture via Double Staining

Cerebellaire granule uitwendige laag is de plaats van de grootste doorvoer versterking in de zich ontwikkelende hersenen. Hier presenteren we een protocol voor genetische modificatie om deze laag te richten op het hoogtepunt van proliferatie via ex vivo elektroporatie en cultuur van cerebellaire plakjes uit embryonale dag 14 kippenembryo's.

Ex Vivo Cultuur van Chick Cerebellaire Slices en Ruimtelijk Gerichte Elektroporatie van Korrel cel precursoren

Dit protocol beschrijft hoe om neuronale levensvatbaarheid nauwkeurig te meten met behulp van Fluorescein Diacetate (FDA) en Propidium Iodide (PI) dubbele kleuring in gekweekte cerebellar granule neuronen, een primaire neuronale cultuur die gebruikt wordt als een in vitro model in neurowetenschappen en neurofarmacologie onderzoek.

Beoordeling van neuronale levensvatbaarheid met behulp van Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Dubbele Verf In Cerebellaire Granule Neuron Cultuur

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om te isoleren en primaire muisknop cerebrale submodule neuronen (CGNs) van 6-7 dag oud pups, efficiënte transductie van CGNs voor verlies en winst van functie studies, kweken en modellering NMDA-geïnduceerde neuronale excitotoxicity, lage-kalium-veroorzaakte celdood, DNA-schade en oxidatieve stress met behulp van de zelfde cultuur-model.

Modelleren van neuronale dood en degeneratie in muis primaire cerebellaire submodule neuronen

Hier presenteren we een methode ter voorbereiding organotypic segment culturen van muis cerebellum en myelineschede kleuring door immunohistochemistry geschikt voor onderzoek naar mechanismen van myelinisering en remyelination in het centrale zenuwstelsel.

Voorbereiding en immunokleuring van Myelinating Organotypic cerebellaire segment culturen

Het uitvoeren van in vitro experimenten om zo goed mogelijk te reflecteren in vivo omstandigheden is geen gemakkelijke taak. Het gebruik van primaire celculturen is een belangrijke stap naar begrip van celbiologie in een heel organisme. Het meegeleverde protocol schetst hoe succesvol groeien en cultuur embryonale muis cerebellaire neuronen.

Primaire cultuur van neuronen geïsoleerd van embryonale muis cerebellum

Organotypische segment culturen zijn een krachtig hulpmiddel om neuroontwikkelingsof degeneratieve/regeneratieve processen te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol dat de neuroontwikkelingsdood van Purkinje-cellen in muizen cerebellaire segment culturen modelheeft. Deze methode kan profiteren van onderzoek in neuroprotectieve Drug Discovery.

Purkinje-celoverleving in Organotypische cerebellaire segment culturen

Cerebellaire Purkinje-cellen (PC's) zijn bijzonder gevoelig voor tekortkomingen in de DNA-schaderespons. Er wordt een protocol gepresenteerd voor de visuele evaluatie van de dynamiek van PC-respons op DNA-schade, waarbij eiwitgebonden poly(ADP-ribose) ketens worden gekleurd binnen cerebellaire organotypische culturen.

Visualisatie van de DNA-schaderespons in Purkinje-cellen met behulp van cerebellaire organotypische culturen

Leer organotypische cerebellaire culturen maken om apoptose te bestuderen in muizen. Deze methode analyseert celoverleving met immunofluorescentie na fast ligand-behandeling.

Organotypische Cerebellaire culturen: apoptotische uitdagingen en Detectie

Meer video's verkennen