Name: Trekkende gedrag van cellen gegenereerd in ganglion Eminence culturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-21T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Leer hoe celmigratie vanuit de ganglionaire eminence wordt bestudeerd met behulp van 3D-weefselculturen en time-lapse beeldvorming. Deze methode maakt kwantificering van individuele celbewegingen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door DoD Grant PT074620 (SLJ) en NIH Grant R01NS245014 (SLJ).

1. Bereiding van het reagens <ol><li> Ontdooi ingevroren Matrigel op nat ijs, waardoor er genoeg tijd voor het experiment (niet het proces te versnellen door actief de aarde). Matrigel wordt gebruikt om een 3D-omgeving sterk gelijkende een extracellulaire matrix bevorderlijk zijn voor de migratie van cellen vast te stellen. Het biedt cellen met zowel een substraat en mechanische omkasting. Matrigel is bevroren opgeslagen bij -20 ° C. Voorafgaand aan de gebruiken, het moet geleidelijk worden aangepast aan de temperatuur van 0-4 ° C, dat wil zeggen ontdooide op natte ijs of in de koelkast. Matrigel sets onomkeerbaar het vormen van een gel in de temperatuur van de incubatie (37 ° C). Daarom is het niet aan te raden te versnellen ontdooien door onderdompeling van de container in warm water. </li><li> Eiwitfracties worden bereid door iso-elektrische focussering (IEF) van de totale hoeveelheid eiwit uittreksel uit de cerebrale cortex van postnatale dag 0 (P0) fret. Na de scheiding zijn de fracties 's nachts gedialyseerd tegen 20 mm Tris-HCl pH7.2 om de uittreksels reinigen van de focus buffer bestanddelen, die zouden kunnen worden toxisch zijn voor het weefsel. </li><li> Eiwitten leveren systeem. Eiwitten uit de cerebrale cortex worden geadsorbeerd op fluorescerend latex kralen die langzaam vervolgens de eiwitten vrij te geven aan de environment.We vastgesteld dat de fluorescentie functie helpt in de visuele verwerking van microsferen en maakt eenvoudige detectie van zelfs een minimale spillovers van de plaats van kraal storting, wanneer waargenomen onder fluorescentiemicroscoop. <ol class="lalpha"><li> Voeg 10μl van fluorescente beads tot 100-200μl van de eiwitoplossing </li><li> Incubeer 30min in donkere bij RT op een shaker </li><li> Spin de kralen in een bench centrifuge voor 1 uur bij max. snelheid </li><li> Verwijder supernatant </li><li> Re-schorten in een draaikolk met 10μl van vers medium </li><li> Voeg 30μl van Matrigel aan de suspensie, goed mengen, en leg ze op ijs. </li></ol></li><li> Buffers en media <ol><li> Voor te bereiden en filtratie-steriliseren artificiële hersenvocht (aCSF, NaCl 124mM, NaHCO 3 26mm, NaH 2 PO 4 1.2mm, 3.2mm KCl, MgSO 4 1.2mm, CaCl 2 2,4 mm, Glucose 10 mm). Slush-vries de aCSF op voorhand, zodat het klaar is op het moment van weefsel dissectie. Om het, plaatst u een plastic fles gevuld met steriele aCSF in een -80 ° C vriezer. Monitor invriezen om zo vaak, dus als een laagje ijs bouwt aan de binnenkant van de muur, breken en mengen met de vloeistof. Herhaal dit totdat de fles bevat meestal een ijzige slush. Buffer voorbereid op deze manier ondersteunt niet alleen weefsel overleven, maar zal ook houden lage temperatuur langer, en is mechanisch minder schadelijk voor het weefsel dan stevige ijsblokjes. </li><li> Bereid Neurobasal medium met N-2 en B-27 supplementen toegevoegd volgens de fabrikant suggesties, evenals 1mg/100ml gentamycine, 2 mM L-glutamine, en 0,6% glucose. Steriliseer door filtratie door een 0.22μm membraan. Houd warm bij 37 ° C tot gebruik. </li></ol></li><li> Kweekplaten <ol class="lalpha"><li> Cultuur grade plastic zes-well platen zijn voorbereid door puntjes op elk putje in het midden met een kleine hoeveelheid (ongeveer 2μl) koud Matrigel gebruik van 20μl pipetpunt, en het plaatsen van een geautoclaveerd ronde 18mm glas dekglaasje op elke druppel. Noch de platen, noch de dekglaasjes moeten worden anders is de cultuur behandeld. </li></ol></li></ol> 2. Tissue voorbereiding <ol><li> Het verkrijgen van het hersenweefsel <ol class="lalpha"><li> Na diep verlamming het dier met Euthasol, verwijder de hersenen en plaats deze in ijskoud aCSF </li><li> Scheid de hemisferen met een scalpel en snijd coronaalwaarts op 500μm met behulp van een apparaat van keuze, het verzamelen van plakken in een kleine schotel met ijskoud aCSF </li></ol></li><li> Maken explantaten (gebruik dissectiemicroscoop) <ol class="a"><li> Identificeer plakjes met het ganglionisch eminenties (GE) en knip de regio's van de cortex die krullen dan GE en interfereren met de verdere stappen </li><li> Druk op een Harris Uni-Core boring in het gebied dicht bij ventriculaire oppervlakte van GE, trekken een kern met hoofdzakelijk een ventriculaire zone en verdrijven hem met een zuiger in het ijs-koude medium (Fig.1). Drie tot vier explanten van 0,5 mm diameter kan worden gemaakt van de GE in enkele P0 fret hersenen slice. Houdt u er rekening mee dat bij zowel knaagdieren en fretten, de mediale en laterale GEs zijn gefuseerd op deze leeftijd. Als een kern blijft in de slice of zit vast aan het plastic bodem van de schaal, te mobiliseren door spuiten aCSF met een pipet en breng met een pipet in het schaaltje met koude Neurobasal medium. Hou de schotel op nat ijs. </li><li> Overdracht van een partij van explantaten van het medium in een grote druppel ijskoude Matrigel (ongeveer 0,25 0,5 ml) geplaatst in een apart schaaltje en zorg ervoor dat de explantaten volledig ondergedompeld en het vermijden van bubbels. Hou de schotel op nat ijs. De grootte van een partij afhankelijk van de snelheid van de workflow stroomafwaarts. </li></ol></li></ol> 3. Cultuur setup (gebruik dissectiemicroscoop) <ol><li> Altijd Matrigel en Matrigel-bevattende mixen op het ijs tot het genezen te voorkomen. </li><li> Remix de kraal schorsing en een plaats-2μl of minder van de kraal suspensie in ijskoude Matrigel in het midden van een glazen dekglaasje eerder geplaatst in een petrischaal goed af met een 20μl pipetpunt. Laat het set een beetje voorkomen dat ze uitdrogen. </li><li> Met behulp van een 20μl pipettip pick-up 2 explantaten van de Matrigel te laten vallen en plaats ze in de gewenste nabijheid van de kraal aanbetaling (minstens 1 mm afstand van de rand van de borg) symmetrisch op de tegenoverliggende zijden. Laat het voor niet langer dan 5 minuten bij kamertemperatuur. De juiste timing van de stappen b en c is van cruciaal belang. Als de tijd is te kort zal leiden tot onvolledige gelering en onderdelen van de cultuur setup zal bewegen wanneer ze worden bedekt met de laatste laag van de Matrigel, als het te lang is, resulteert dit in over-drogen van de gel en de creatie van fysieke barrières belemmeren het vrije verkeer van cellen. </li><li> Bedek de kralen en de explantatie met een platte laag van ongeveer 30μl van Matrigel, uit te breiden buiten de explantaten (Fig.2). Laat het in de incubator voor ongeveer 15 minuten. </li><li> Voeg 2 ml van Neurobasal medium met supplementen. </li><li> Incubeer bij 37 ° C in 5% CO 2 / 95% O 2 monitoren trekkende activiteit per dag. </li></ol> 4. Live-imaging <ol><li> Na incubatie gedurende 3-4 dagen, herziening van de cultuur platen en kies dekglaasjes van belang. De explantaten zou moeten leiden tot een radiaal uniform wolk van cellen. Vervang de gekozen coverslips in een frisse cultuur plaat die zullen worden gebruikt in live beeldvorming. </li><li> Laat de dekglaasjes zitten in de nieuwe plaat 's nachts. Voor het plaatsen van de plaat op de microscoop voor beeldvorming, in een cel cultuur kap, een steriele spatel om de dekglaasje bewegen om alle microbellen dat verzamelen tussen het dekglaasje en de celkweek plaat release. Interferentie van belletjes zal ruïneren de beelden. Verplaats de dekglaasjes naar het midden van de put. </li><li> Om te voorkomen dat verdamping, vul de ruimte tussen de putten met water. </li><li> Breng voorzichtig de plaat uit de celkweek kap aan de microscoop om niet de dekglaasjes verplaatsen van het midden van de put. </li><li> Definieer een imaging systeem met behulp van imaging-software. Door de 3D-karakter van de cultuur het instellen van de cellen ook verticaal te verplaatsen, daarom is het belangrijk om Z-vliegtuigen te verzamelen omvat volledige diepte van de migratie wolk. De XY omvang van de belichte gebied moet ook worden ingesteld groot genoeg om gebieden zal naar verwachting worden bevolkt door migrerende cellen in de loop van de opname, te dekken en de hiel depot bevat om een hoekige oriëntatie van de Explantatie en migrerende cellen te nemen ten opzichte van de bron van het eiwit. Bedenk ook dat het meer afgebeeld Z vliegtuigen, of het gebied dat onder meer, des te meer tijd het kost om een fiets te nemen op een bepaald tijdstip, waardoor langere intervallen tussen de monsters en een verlies van temporele resolutie van cel tracking. In ons geval, met behulp van een 10x doelstelling, de optimale regeling was een 3x3 tegel opname voor elk van de 10 Z-vliegtuigen uit elkaar elke 20μm, met tussenpozen van 30 minuten. We vonden 30 min. intervallen de langste die ondubbelzinnige identificatie van cellen kunnen ten keer op rij punten, die cruciaal is voor een betrouwbare volgen van hun bewegingen. </li><li> Initiëren time lapse imaging. </li><li> Nadat de gewenste tijd, verwijder de plaat en bevestig culturen in 4% fosfaat-gebufferde paraformaldehyde. Het kan worden gebruikt voor verdere morfologische en immunocytochemische analyse. </li></ol> 5. Analyse van de beweging <ol><li> Zet de geregistreerde tijdreeksen van beelden naar een formaat het meest geschikt voor verdere verwerking, TIFF zijnde de meest draagbare een. </li><li> De verplaatsing van individuele cellen na verloop van tijd door het opnemen van XY-coördinaten. Dit kan worden gedaan met behulp van vrij beschikbare software zoals ImageJ (NIH), met een handmatige Tracking plug-in, of enige andere commerciële toepassingen, zoals ImagePro, Volicity of AutoQuant. </li><li> Plot de sporen met behulp van Excel of in eigen beheer ontwikkelde software. </li><li> Voor elke cel gevolgd kinetische parameters zoals gemiddelde snelheid, de kromming van het pad, richting de variabiliteit in de tijd, vertakking, afwijking in de richting van de bron van eiwitten te berekenen, etc. De berekeningen worden gedaan in MS Excel of een gelijkwaardige spreadsheet. Onze ervaring geeft echter aan dat het veel productiever om te in-house scripts (met behulp van R, Matlab, Python, Perl of andere, meestal Open Source talen) te ontwikkelen, omdat ze zorgen voor meer flexibele maatwerk en integratie van meer verfijnde analytische methoden dan die verkrijgbaar in een basisinstallatie van Excel. </li></ol> 6. Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Schema van de anatomische oorn van explantaten. Dit is een tekening van een coronale deel van een hemisected fret hersenen. De grijze cirkels geven de regio waar de explantaten werden genomen. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Diagram van een cultuur setup. De kraal borg is de bron van eiwitten, de explantaten worden geplaatst aan beide zijden en alle elementen zijn bedekt met Matrigel. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Overeenkomstige percelen van cel tracks gekleurd door kwadranten (pijlen wijzen in de richting van de kraal borg). De cel nummers op rechts zijn migreren in de richting van fractie D, die lijkt aan te trekken cellen, de cellen aan de linkerkant zijn migreren in de richting van fractie A, die lijkt te verdrijven migrerende cellen. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. A) Een reeks beelden van geselecteerde tijdstippen waarop een groeiende wolk van cellen uit een explantatie migreren. Een voorbeeld cel, aangegeven door een pijl, wordt bijgehouden door de tijd, zoals hieronder aangegeven (schaal bar 200μm). Dit explant werd gevisualiseerd met live imaging voor 38 uur Hier ziet u beelden van de cellen het verlaten van de explantatie vanaf het begin van het opnemen van de beelden naar het uiteindelijke beeld. B) De cel die in deel A op de aangegeven tijden. De cel toont repetitieve vertakking (schaal bar 50μm).

<ol><li>Caviness, V. S. Jr, Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cortical+development%3A+a+view+from+mutations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cortical development: a view from mutations in mice.</a> Annu. Rev. Neurosci. 1, 297-326 (1978).</li>
<li>Gelman, D. M., Martini, F. J., Nóbrega-Pereira, S., Pierani, A., Kessaris, N., Marín, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+preoptic+area+is+a+novel+source+of+cortical+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The embryonic preoptic area is a novel source of cortical GABAergic interneurons.</a> J. Neurosci. 29, 9380-9389 (2009).</li>
<li>Hasling, T. A., Gierdalski, M., Jablonska, B., Juliano, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+radialization+factor+in+normal+cortical+plate+restores+disorganized+radial+glia+and+disrupted+migration+in+a+model+of+cortical+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A radialization factor in normal cortical plate restores disorganized radial glia and disrupted migration in a model of cortical dysplasia.</a> Eur. J. Neurosci. 17, 467-780 (2003).</li>
<li>Hirschberg, A., Deng, S., Korostylev, A., Paldy, E., Costa, M. R., Worzfeld, T., Vodrazka, P., Wizenmann, A., Götz, M., Offermanns, S., Kuner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+deletion+mutants+reveal+a+role+for+semaphorin+receptors+of+the+plexin-B+family+in+mechanisms+underlying+corticogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene deletion mutants reveal a role for semaphorin receptors of the plexin-B family in mechanisms underlying corticogenesis.</a> Mol. Cell Biol. 30, 764-780 (2010).</li>
<li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riding+the+glial+monorail%3A+a+common+mechanism+for+glial-guided+neuronal+migration+in+different+regions+of+the+developing+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Riding the glial monorail: a common mechanism for glial-guided neuronal migration in different regions of the developing mammalian brain.</a> Trends Neurosci. 13, 179-184 (1990).</li>
<li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Central nervous system neuronal migration.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 511-539 (1999).</li>
<li>Liodis, P., Denaxa, M., Grigoriou, M., Akufo-Addo, C., Yanagawa, Y., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lhx6+activity+is+required+for+the+normal+migration+and+specification+of+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes.</a> J. Neurosci. 27, 3078-3089 (2007).</li>
<li>Métin, C., Alvarez, C., Moudoux, D., Vitalis, T., Pieau, C., Molnár, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+pattern+of+tangential+neuronal+migration+during+forebrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Conserved pattern of tangential neuronal migration during forebrain development.</a> Development. 134, 2815-2827 (2007).</li>
<li>Martini, F. J., Valiente, M., López Bendito, G., Szabó, G., Moya, F., Valdeolmillos, M., Marín, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+selection+of+leading+process+branches+mediates+chemotaxis+during+tangential+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration.</a> Development. , 136-1341 (2009).</li>
<li>Nóbrega-Pereira, S., Kessaris, N., Du, T., Kimura, S., Anderson, S. A., Marín, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmitotic+Nkx2-1+controls+the+migration+of+telencephalic+interneurons+by+direct+repression+of+guidance+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors.</a> Neuron. 59, 733-745 (2008).</li>
<li>Pearlman, A. L., Faust, P. L., Hatten, M. E., Brunstrom, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+directions+for+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">New directions for neuronal migration.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 8, 45-54 (1998).</li>
<li>Poluch, S., Jablonska, B., Juliano, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+interneuron+migration+in+a+ferret+model+of+cortical+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Alteration of interneuron migration in a ferret model of cortical dysplasia.</a> Cereb Cortex. 18, 78-92 (2008).</li>
<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+neural+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Principles of neural cell migration.</a> Experientia. 46, 882-891 (1990).</li>
<li>Riddle, D. R., Katz, L. C., Lo, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+delivery+of+neurotrophins+into+the+central+nervous+system+using+fluorescent+latex+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Focal delivery of neurotrophins into the central nervous system using fluorescent latex microspheres.</a> Biotechniques. 23, 928-937 (1997).</li>
<li>Wichterle, H., Alvarez-Dolado, M., Erskine, L., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permissive+corridor+and+diffusible+gradients+direct+medial+ganglionic+eminence+cell+migration+to+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Permissive corridor and diffusible gradients direct medial ganglionic eminence cell migration to the neocortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 727-732 (2003).</li>
<li>Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origins of cortical interneuron subtypes.</a> J. Neurosci. 24, 2612-2622 (2004).</li>
</ol>

Gebruik van dieren: Alle procedures waarbij dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de USUHS en NIH institutionele richtlijnen en goedgekeurd door de USUHS IACUC.

Hier presenteren we een eenvoudig systeem te bestuderen en migratie het gedrag van neurale cellen te analyseren in reactie op chemische signalen. In vitro migratie testen zijn gebruikt om de extracellulaire moleculen die de voortbeweging van de cellen te identificeren. Ons paradigma zorgt ervoor dat elke onderzochte individuele cel een 3-dimensionaal (3D) omgeving waarmee interactie heeft. Het is een groot voordeel ten opzichte van culturen waar de cellen uit migreren van explantaten worden gedwongen te verhuizen op het vlakke oppervlak van poly-D-lysine-gecoate dekglaasje, dus verstoken van interacties met de extracellulaire matrix (bv. Hirschberg et al., &#39;10;. 8. Metin et al.. &#39;07). Maar met betrekking tot de grotere schaal van het bijhouden van migrerende cellen, blijft het 2-dimensionaal, omdat de cellen verticaal beperkt tot de ruimte tussen het glas dekglaasje op de bodem en de bovenkant van Matrigel, dat is relatief dun in vergelijking met de horizontale vrijheid van migratie. Een dergelijke setup zorgt voor een eenvoudigere analyse van beweging, die nog steeds in wezen twee-dimensionaal. Vergelijkbare 3D-paradigma&#39;s, bestaande uit GE explantaten of re-aggregaten van GE cellen ingebed in collageen of Matrigel, voorheen in dienst, met behulp van aggregaten van de cellen die een bepaald eiwit signalering als een bron van chemische signalen (bijv. Liodis et al., &#39;07;. Martini et .. al. &#39;09;. Nobrega-Pereira et al., &#39;08; Wichterle et al. &#39;03).. De methode die hier wordt gepresenteerd maakt gebruik van een vertraagde afgifte systeem in de vorm van een latex kralen met gehandeld eiwitten zorgen voor een constant hoog niveau in de plaatselijke omgeving, die hoger is dan eiwitten direct toegevoegd aan het medium, waardoor het systeem uitermate geschikt wanneer het bedrag van de beschikbare eiwit is beperkt of wanneer een complex mengsel van eiwitten is getest. De keuze van kralen is niet beperkt tot latex-gebaseerde producten, en omvat ook andere materialen, bijvoorbeeld agarose parels, elk met verschillende eigenschappen. Verder te verhogen de dichtheid van de test gebruikten we twee explantaten apposed om de kralen storten tegenover elkaar staan. Om ervoor te zorgen een bepaald gebied van herkomst, hebben we gebruik gemaakt ganglion eminentie explantaten als een bron van cellen. Evalueerden we verschillen in de mediale en laterale delen van het ganglion eminentie, maar zag geen verschillen. We moeten erop wijzen dat dit onderzoek fretten gebruikt; in deze soort de mediale en laterale ganglion eminenties eerder zekering dan in knaagdieren (Poluch et al., &#39;08.). Op het moment dat de culturen werden gemaakt (P0) de mediale en laterale ganglion eminenties werden gefuseerd, ook al zijn veel cellen vullen de neocortex nog steeds worden gegenereerd en migratie. Echter, als een echt homogeen bron van cellen heeft de voorkeur, kan een celsuspensie worden bereid uit het weefsel ontleed en direct gemengd met de Matrigel, of als alternatief gesponnen naar beneden en een resulterende pellet geponst om &#39;explantaten&#39; te maken. Het gebruik van enzymatische vertering weefsel naar de cel suspensie te bereiden wordt afgeraden, want zelfs sporen van proteolytische activiteit kan Matrigel vloeibaar te maken in de loop van het experiment. Ook een due diligence moet worden toegepast op de timing van de cultuur setup. Hoewel Matrigel vergt een periode van opwarming te polymeriseren, zelfs een iets langere periode van blootstelling van kleine druppels Matrigel (zoals gebruikt in dit protocol) om de lucht oorzaken drogen en resulteert in een shell die ondoordringbaar is voor migrerende cellen en die niet kunnen worden gewist door latere afdekken met verse Matrigel.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </td><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> Neurobasal Medium (1X), vloeibare </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> N-2 Supplement (100X), vloeibare </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 Supplement (50x) </td><td> Invitrogen </td><td> 0080085-SA </td><td></td></tr><tr><td> BD Matrigel Basement Membrane Matrix </td><td> BD Biosciences </td><td> 354234 </td><td></td></tr><tr><td> Harris Uni-Core, 0.5mm afmeting </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 69036-05 </td><td> Punch boring </td></tr><tr><td> Groen Retrobeads IX </td><td> Lumafluor, Inc </td><td></td><td> Latex microsferen </td></tr></tbody></table>

trekkende gedrag van cellen gegenereerd in ganglion eminence culturen

Migratory Behavior of Cells Generated in Ganglionic Eminence Cultures

Migratie van cellen is een gemeenschappelijk proces dat leidt tot de ontwikkeling en rijping van de gewervelde centrale zenuwstelsel (Hatten, &#39;99). De cerebrale cortex bestaat uit twee fundamentele neuronale types: prikkelende en remmende. Deze cellen ontstaan ​​in verschillende gebieden en migreren naar de cortex langs verschillende routes (Pearlman et al.., &#39;98). Remmende interneuronen migreren tangentiaal uit subcorticale bronnen, voornamelijk uit verschillende regio&#39;s van het ganglion eminenties (Gelman et al., &#39;09;. Xu et al., &#39;04.). Hun beweging vereist een nauwkeurige controle spatiotemporele opgelegd door omgevingsfactoren, zodat voor de oprichting van de juiste cytoarchitecture en connectiviteit in de cerebrale cortex (Caviness &amp; Rakic, &#39;78, Hatten, &#39;90, Rakic, &#39;90). De studie van de trekgedrag van cellen gegenereerd in proliferatieve zones van de ganglion eminenties (GE) bij pasgeboren fretten in vitro hebben we gebruik gemaakt van een 3-dimensionale cultuur arrangement in een BD Matrigel Matrix. De cultuur setup bestond uit twee GE explantaten en een bron van geteste eiwitten uit de cerebrale cortex en geadsorbeerd aan fluorescerende latex Retrobeads IX gepositioneerd tussen de explantaten (Hasling et al., &#39;03;. Riddle et al., &#39;97.). Na 2-3 dagen van de cultuur, de cellen beginnen te verschijnen aan de rand van de explantatie met een neiging om het weefsel te verlaten in een radiale richting. Live-imaging toegestaan ​​observatie van migratiepatronen, zonder de noodzaak van etikettering of markering van de cellen. Bij blootstelling aan fracties van het eiwit extract verkregen uit isochronic fret cortex, de GE-cellen weergegeven verschillende gedragingen zoals beoordeeld door kwantitatieve kinetische analyse van individuele bewegende cellen.

Time lapse beeldvorming van 3D-weefselkweek maakt het bestuderen van trekgedrag van de individuele cellen die afkomstig zijn van ganglion eminentie in reactie op gefractioneerde eiwitten halen uit cerebrale cortex.

Trekkende gedrag van cellen gegenereerd in ganglion Eminence culturen

Celmigratie is een veelvoorkomend proces dat leidt tot de ontwikkeling en rijping van het centrale zenuwstelsel van gewervelde dieren (Hatten, '99). De cerebrale ...

In deze procedure wordt een in vitro-cultuur opgezet om te bestuderen hoe de celmigratie van de ganglionic eminence naar de cerebrale cortex wordt beïnvloed door verschillende fracties van het corticale proteinextract. Eerst worden latex-microsferen geïncubeerd met individuele fracties om bronnen van langzaam vrijkomende proteïnen voor te bereiden. Een fretbrein wordt gedisseceerd en coronale doorsneden van dikke plakken worden gemaakt.Weefselexplantaten worden uit de ganglion eminences geponst. Er worden driedimensionale culturen opgezet waarin de microsferen en explantaten zijn ingebed in extracellulaire matrix. Na een incubatieperiode wordt er een time-lapse beeldopname gemaakt met een lichtveldmicroscoop.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het gebruik van een chemotactische kamer, is dat de bewegingen van individuele cellen kunnen worden geobserveerd en gekwantificeerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de ontwikkeling van het zenuwstelsel, zoals chemotactische en Kama kinetische controle van motiliteit.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het lastig is om de kleine weefselexplantaten met de matrigel te hanteren. Begin met het geleidelijk ontdooien van de bevroren matrigel op nat ijs om ervoor te zorgen dat de temperatuur laag genoeg blijft om voortijdige stolling van de matrix te voorkomen terwijl de matrigel ontdooit. Filtersteriliseer en vries vervolgens 500 milliliters kunstmatig cerebrospinaal vloeistof of A CSF tot een slush door een plastic kolf in de minus 80 vriezer te plaatsen.Wanneer er een dunne laag ijs op de wanden vormt, breek deze dan af door de kolf te schudden en laat vervolgens een nieuwe laag vormen, waarbij dit wordt herhaald totdat een mooie slurry is ontstaan. Bereid vervolgens neurobasaal medium volgens de instructies van de fabrikant en steriliseer dit door filtratie. Gebruik een 0,22 µm filtermembraan; incubeer bij 37 °C tot het klaar is voor gebruik om de eiwitfractie te absorberen op de fluorescente latex-microsferen of kralen voor diffusie in de Matrigel. Voeg 10 µL van de kralen toe aan EPR-buisjes die afzonderlijk 100 tot 200 µL van elk van de vijf verschillende eiwitfracties bevatten.Incubeer 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur op een schudmachine. Centrifugeer na de incubatie van 30 minuten de beads op maximale snelheid gedurende één uur in een benchtop-centrifuge. Dissecteer na diepe anesthesie van het dier met uol de gehele hersenen uit en dompel deze onder in de eerder bereide ijskoude A CSF.Scheid de hemisferen volledig met een scalpel en maak coronale coupes van 500 micrometers. Gebruik een tissue chopper of een vergelijkbaar apparaat om de coupes te verzamelen in een kleine Petrischaal met ijskoud A CSF, geplaatst op nat ijs. Identificeer met een dissectiemicroscoop de coupes die de ganglionic eminences (ge) bevatten en trim de regio's van de cortex weg die volgende stappen kunnen hinderen.Druk een Harris unicorn bore in het gebied nabij het ventriculaire oppervlak van de GE. Trek een kern terug die voornamelijk de ventriculaire zone bevat en stoot deze met een zuiger uit in ijskoud neurobasaal medium. Verplaats een batch implantaten vanuit het medium naar een druppel van 0,5 milliliter ijskoude matrigel in een aparte schaal.Zorg ervoor dat het explantaat volledig is ondergedompeld en voorkom de vorming van luchtbellen. Houd het schaaltje op nat ijs in een weefselkweekkast. Bereid de cultuur voor.Prepare zeswells-platen door in het midden van elke well twee µL koude Matrigel aan te brengen. Gebruik hiervoor een pipetpunt van 20 µL en plaats een geautoclaveerd rond glazen dekglas van 18 mm op elke druppel. Verwijder het supernatant en resuspendeer de beads in 10 µL neurobasaal medium met behulp van een vortex, of voeg 30 µL van de op ijs ontdooide Matrigel toe aan de suspensie.Meng goed en plaats op ijs. Plaats met behulp van de dissectiemicroscoop één tot twee microliter van de kralensuspensie met een 20 microliter pipette en laat dit één tot twee minuten rusten, waarbij u erop let dat het niet uitdroogt. Pak twee x explan uit de Matrigel-druppel en plaats deze in de gewenste nabijheid van de kralendepot.Plaats ze symmetrisch en aan tegenovergestelde zijden op een afstand van 0,5 tot 1 mm. Laat dit maximaal vijf minuten bij kamertemperatuur staan. Bedek de beads in de X-aubergines met een vlakke laag van ongeveer 30 µL Matrigel en plaats ze gedurende 15 minuten in een weefselkweekincubator bij 37 °C. Voeg na incubatie 2 mL neurobasaal medium toe en plaats ze vervolgens gedurende drie tot vier dagen terug in de incubator.Controleer dagelijks de migratieactiviteit na de incubatie en selecteer de dekglasjes van belang met implantaten die een radiaal uniforme wolk van cellen hebben gegenereerd. Plaats de gekozen dekglasjes in een nieuwe kweekplaat en incubeer deze een nacht. Gebruik vóór de beeldvorming een steriele spatel in een weefselkweekkast om het dekglasje te verschuiven, zodat eventuele microbellen onder de dekglasjes kunnen ontsnappen.Vul de ruimte tussen de putjes met water om uitdroging te voorkomen en breng de plaat voorzichtig over naar de microscoop. Definieer een beeldvormingsschema met behulp van beeldvormingssoftware. Houd hierbij rekening met de 3D-aard van de cultuur door een z-vlakserie te verzamelen.Zodra de parameters zijn ingesteld, wordt de time-lapse gestart. Hier wordt een representatieve time-lapse-opname getoond van een ganglion, waarbij de eminence explan migrerende cellen genereert. Cellen migreren radiaal uit het weefsel.Hun aantrekking tot de eiwitbron is variabel, afhankelijk van de aard van de bron. In deze film met een hogere vergroting kunnen individuele bewegende cellen gemakkelijk worden gevolgd. Zoals aangegeven door de pijlpunten, zijn veel cellen te zien die vertakken.Enkele hiervan zijn met pijlen aangegeven. Het volgen van individuele cellen levert positionele informatie op die verder kan worden geanalyseerd. Voorbeelden van plots tonen een differentieel respons tussen fracties A en D, zoals blijkt uit de verschillende trajecten van cellen die de explant verlaten zodra deze beheerst is.Deze techniek kan in vier uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de matgel op ijs moet worden bewaard. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een bron van eiwitten met vertraagde afgifte bereidt, een driedimensionale weefselkweek opzet en time-lapse-imaging uitvoert om bewegingen van individuele cellen te observeren en te analyseren.

migratory-behavior-of-cells-generated-in-ganglionic-eminence-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In dit protocol we zien hoe aangepaste kamers die de toepassing van een gelijkstroom elektrisch veld op time-lapse beeldvorming van volwassen hersenen afgeleide neurale voorlopercel translocatie in galvanotaxis schakelen mogelijk te construeren.

Een Galvanotaxis Assay voor Analyse van neurale precursoren celmigratie Kinetics in een extern aangelegd Direct Current Electric Field

Hier beschrijven we een Schwann-cellen (SC) migratie assay waarin SC kunnen ontwikkelen langs axonen verlenging.

Het analyseren van Murine Schwann Cell Development Samen Groeien Axonen

We presenteren een ex vivo celmigratie analyse die exacte kwantificering van enterische neurale celmigratie potentieel in aanwezigheid van verschillende groeifactoren maakt.

Een kwantitatieve cel-migratie test voor Muriene Enterisch neurale voorlopercellen

Celkweekmodellen gedetailleerde controle milieuomstandigheden en dus een krachtig platform om verschillende aspecten van neuronale cel biologie. We beschrijven een snelle, goedkope en betrouwbare wijze te isoleren, dissociëren en cultuur sensorische neuronen van kippenembryo's. Details van de ondergrond voorbereiding en immuuncytochemie zijn ook aanwezig.

Isolatie en Cultuur van Gedissocieerde sensorische neuronen van Chick Embryo

GABAergische corticale interneuron voorouders te verspreiden, te ontwikkelen en synaptically integreren in een gastheer cortex na transplantatie. Deze cellen kunnen gemakkelijk worden getransduceerd voor transplantatie in vivo studies van genetisch gemodificeerde GABAerge precursoren. Hier tonen we virale etikettering technieken om specifieke interneuron subgroepen met behulp van bestaande Cre lijnen en Cre-afhankelijke verslaggevers richten.

Viraal-gemedieerde Labeling en Transplantatie van Medial ganglion Eminence (MGE) Cellen voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Studies

Epitheliële naar mesenchymale overgang (EMT) maakt het mogelijk dat kankers invasief worden. Om EMT te onderzoeken, wordt een op neurale stamcellen (NSC) gebaseerd in vitro model beschreven dat vrij is van serum en enzymen. Dit gestandaardiseerde systeem maakt een kwantitatieve en kwalitatieve beoordeling van celmigratie, gen- en eiwitexpressie mogelijk. Het model is geschikt voor geneesmiddelontdekking.

Een enzym en Serum-free neurale stamcel Cultuur Model voor EMT Investigation Geschikt voor Drug Discovery

Hier presenteren we een ex-vivo gemengd monolaag cultuur systeem voor de studie van Human glioom Cell (HGC) migratie in real-time. Dit model biedt de mogelijkheid om interacties tussen Hgc's en zowel myelinehoudende als niet-myelinehoudende axonen in een gecompartimenteerde kamer te observeren.

Real-time monitoring van menselijke Glioom Celmigratie op Rugwortel ganglion axon-oligodendrocyte co-culturen

We presenteren drie eenvoudige in vitro testen-de lange afstand migratie test, de co-cultuur migratie test, en chemo-attractie test-dat gezamenlijk evalueren van de functies van de menselijke stamcel afgeleid periventricular endotheliale cellen en hun interactie met GABAergic interneuronen.

Migratie, Chemo-Attraction, en Co-Culture Assays voor menselijke stamcel-afgeleide endotheelcellen en GABAergic Neuronen

Chick ciliary ganglia (CG) maken deel uit van het parasympathische zenuwstelsel. Neuronale culturen van kuiken CG neuronen bleken effectieve celmodellen in de studie van zenuwspier interacties. We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de dissectie, dissociatie en in vitro cultuur van CG neuronen uit kuikenembryo's.

Isolatie en cultuur van Chick Ciliary Ganglion Neurons

Hier presenteren we een eenvoudig te gebruiken co-cultuurtest om glioblastoom (GBM) migratie op neuronen met patronen te analyseren. We ontwikkelden een macro in FiJi-software voor eenvoudige kwantificering van GBM-celmigratie op neuronen en merkten op dat neuronen GBM-celinvasieve capaciteit wijzigen.

Co-cultuur van Glioblastoom Stam-achtige cellen op patroonneuronen om migratie en cellulaire interacties te bestuderen

Dit veelzijdige protocol beschrijft de isolatie van premigratory neural crest cells (NCC's) door de excisie van craniale neurale plooien van kuikenembryo's. Bij plating en incubatie komen migrerende NCC's tevoorschijn uit neurale vouwexplantaten, waardoor celmorfologie en migratie in een vereenvoudigde 2D-omgeving kunnen worden beoordeeld.

Voorbereiding en morfologische analyse van Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

Leer hoe celmigratie vanuit de ganglionaire eminence wordt bestudeerd met behulp van 3D-weefselculturen en time-lapse beeldvorming. Deze methode maakt kwantificering van individuele celbewegingen mogelijk.

Trekkende gedrag van cellen gegenereerd in ganglion Eminence culturen

Meer video's verkennen