Name: Modified Annexine V / propidiumjodide Apoptosis Assay Voor een nauwkeurige beoordeling van Dood van de Cel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Leer een verbeterde Annexine V/propidiumjodide methode voor nauwkeurige evaluatie van celdood door apoptose en necrose. Dit protocol vermindert valse positieven door fixatie en RNA-afbraak.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze studie werd ondersteund door een Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC) onderzoek te verlenen en een Alberta Landbouw Financiering Consortium te verlenen aan DRB. AMR wordt ondersteund door een NSERC Vanier Canadese Graduate Scholarship, een Universiteit van Alberta onderwijs assistentschap en een koningin Elizabeth II afstuderen beurs.

Deze procedure kan worden uitgevoerd in 500 pi gesiliconiseerde buizen of 6 mL polystyreen ronde bodem FACS buizen. Dit laatste is gewoonlijk gebruikt bij het uitvoeren van levensvatbaarheid in combinatie met andere procedures. Gegeven alle volumes zijn voor 6 mL polystyreen ronde bodem FACS buizen. Voor 500 pL gesiliconiseerde buizen, verminderen alle volumes met 1 / 5. De optimale concentratie voor flowcytometrie-analyse is 2-4 x 10 6 cellen per 200 pi volume. Cel verlies kan het gevolg zijn van deze procedure en dus raden we aan dat elk monster bestaat uit 4 x 10 6 cellen bij het ​​begin van de procedure. 1. Celpreparaat <ol><li> Oogst cellen - wordt verwezen naar specifieke procedures voor overeenkomstige cellijnen of primaire cel isolaties. </li><li> Centrifugeer monsters op 335 x g gedurende 10 minuten en decanteer het supernatant. </li><li> Resuspendeer cellen in 2 ml 1 x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) - / - (geen calcium, magnesium niet). </li><li> Centrifugeer monsters op 335 x g gedurende 10 minuten en decanteer het supernatant. </li><li> Resuspendeer cellen in 1 ml 1 x Annexine V binding buffer. </li><li> Centrifugeer monsters op 335 x g gedurende 10 minuten en decanteer het supernatant. </li><li> Resuspendeer cellen in 100 ul 1 x Annexine V binding buffer. </li></ol> 2. Toepassing van Annexine V / PI Stain <ol><li> Voeg Annexine V volgens de aanbevelingen van de fabrikant [bijv. 5 microliter Annexine V Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A13201)]. </li><li> Incubeer buizen in het donker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 100 ul van 1 x Annexine V binding buffer om elke reactie buis. Er moet ongeveer 200 pl in elke buis zijn. </li><li> Voeg 4 ul van PI (Sigma, Cat # P-4864-10 ml) dat werd 1:10 verdund in 1 x Annexine V binding buffer (dat wil zeggen een pL PI met 9 il 1 x Annexine V binding buffer). Dit levert een uiteindelijke PI concentratie van 2 ug / ml in elk monster. </li><li> Incubeer buizen in het donker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 500 ul 1 x Annexine V binding buffer om de cellen te wassen. </li><li> Centrifugeer monsters op 335 x g gedurende 10 minuten en decanteer het supernatant. </li><li> Resuspendeer cellen in 500 pi 1 x Annexine V bindingsbuffer en 500 pL 2% formaldehyde tot een 1% formaldehyde (fixatief) oplossing te creëren. Meng buizen door zacht te vegen. </li><li> Fix monsters op ijs gedurende 10 minuten. Als alternatief kan samples 's nachts worden opgeslagen bij 4 ° C in het donker. Als deze laatste methode wordt gekozen, zorg ervoor dat consistent zijn in alle buizen voorzien van Annexine V / PI (inclusief vergoeding controles). </li><li> Voeg 1 ml 1 x PBS - / - aan elk monster en meng voorzichtig door de knop. </li><li> Centrifugebuis bij 425 x g acht minuten en decanteer de bovenstaande vloeistof. </li><li> Herhaal stap 2.10 en 2.11. </li><li> Resuspendeer pellet door de knop de buis. </li><li> Voeg 16 ul van 1:100 verdund RNase A (Sigma, R4642), tot een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml te geven. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C. </li><li> Voeg 1 ml 1 x PBS - / - en meng voorzichtig door de knop. </li><li> Centrifugebuis bij 425 x g gedurende acht minuten. </li><li> Monsters zijn nu klaar om te worden geanalyseerd. Als alternatief kunnen monsters worden gebruikt voor de volgende kleuren stappen als Annexine / PI kleuring wordt uitgevoerd in parallel met andere procedures. </li></ol> 3. Representatieve resultaten: Voorbeelden van celtypen en cellijnen die verschillende graden van vals-positieve PI kleuring zijn weergegeven in figuur 1. Om rekening te houden voor de vals-positieve gebeurtenissen, werden de cellen vast en vervolgens behandeld met RNase A. Dit resulteert in een significante daling van het aantal fout-positieve gebeurtenissen, in vergelijking met cellen die niet ondergaan RNase behandeling (Figuur 2B). Figuur 2C toont representatieve beelden van cellen die RNase behandeling onderging, in vergelijking met cellen die geen RNase behandeling was. Figuur 3 laat zien hoe de gewijzigde Annexine V / PI-protocol, met fixatie en RNase behandeling stappen, verbetert de conventionele protocollen door beperking van het aantal fout-positieve kleuring evenementen. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Conventionele propidiumjodide kleuring protocollen leiden tot een aanzienlijk aantal vals-positieve gebeurtenissen. We hebben eerder de omvang van vals positieve kleuring in primaire cellen geëvalueerd in een breed scala van diermodellen als in een verscheidenheid van cellijnen 10. Representatieve beelden tonen de omvang van vals-positieve kleuring in drie unieke celpopulaties (een veel gebruikte cellijn - RAW macrofagen en twee primaire cellen - beenmerg van muizen macrofagen (BMM) en de goudvis primaire nieren macrofagen (PKM)). Echte positieve gebeurtenissen weer te geven van de verwachte co-localisatie tussen de PI en DRAQ5 binnen de nucleaire compartiment (gele gebieden weer te geven colocalization tussen PI en DRAQ5). DRAQ5 is zeer membrane doorlaatbaar kleurstof die nauwkeurig vlekken nucleaire compartiment zowel in levende en dode cellen 10,11,12. Voor eenvoudiger visuele bepaling van colocalization DRAQ5 vlek kreeg een groen pseudocolour. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Verbetering van de nauwkeurigheid van de PI nucleaire kleuring. (A) Wij hebben de nauwkeurigheid van de PI nucleaire kleuring op basis van mate van overeenstemming van een aantal goed gekarakteriseerde nucleaire vlekken (BrdU, 7-AAD en DAPI) naar DRAQ5. BrdU is een synthetische nucleoside die is ingebouwd in het DNA van delende cellen, en als zodanig zal alleen vlek binnen de nucleaire compartiment. 7-AAD heeft een hoge affiniteit voor DNA en, vergelijkbaar met PI, kan niet over een intact plasmamembraan. DAPI heeft ook een sterke affiniteit voor DNA en is de meest gebruikte nucleaire vlek in fluorescentie microscopie. De mate van overeenstemming was&gt; 99% tussen BrdU, 7-AAD, DAPI en DRAQ5, met de nadruk hun vermogen om nauwkeurig vlekken op de celkern in RAW 264,7 macrofagen. In tegenstelling, cytoplasmatische PI kleuring, gebaseerd op conventionele protocollen leidt tot een duidelijke afname in procenten gelijkenis van vlekken ten opzichte van DRAQ5. (B) Vergelijkbare resultaten worden waargenomen in de twee geteste primaire cellen: muizen beenmerg macrofagen (BMM) en de goudvis primaire nieren macrofagen (PKM). Incorporatie van 50 ug / ml RNase A op specifieke fase binnen de kleuringsprocedure verwijdert niet-nucleaire PI kleuring en verhoogt mate van overeenstemming ten opzichte van DRAQ5 vlekken. (C) Afbeeldingen slechts ter illustratie van de primaire nier macrofagen tonen de mate van overeenstemming voor cellen met en zonder RNase behandeling. Voor eenvoudiger visuele bepaling van de verschillen tussen de behandelingen, was DRAQ5 krijgt een groen. Gele gebieden verbeelden colocalization tussen BrdU en DRAQ5, en PI en DRAQ5. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Modified Annexine V / PI vermindert valse apoptose / necrotische evenementen. Primaire goudvissen nier macrofagen (PKM) werden gekleurd met conventionele en gemodificeerde Annexine V / PI protocollen. Scatterplots verbeelden de Annexine V / PI vlek in goudvissen PKM. De scatterplot aan de linkerkant toont conventionele Annexine V / PI kleuring (geen RNase) van PKM cellen. De scatterplot aan de rechterkant toont PKM-cellen gekleurd met de gewijzigde Annexine V / PI-protocol (met RNase). De toevoeging van RNase resulteert in een duidelijke vermindering van de PI kleuring als gevolg van het verwijderen van vals-positieve vlekken. PKM cellen werden vervolgens geanalyseerd op basis van verschillende populaties binnen de cultuur-vroege voorlopers (EP), monocyten (mono) en rijpe macrofagen (Mat mac). De vermindering van het aantal positieve PI evenementen, te wijten aan de verwijdering van vals-positieve gebeurtenissen is meer uitgesproken in grote rijpe macrofaag-cellen dan in de kleinere begin van de stamcellen. Conclusies gebaseerd op conventionele protocollen zouden ten onrechte hebben gesuggereerd een positieve correlatie in cellulaire dood voor de rijpere macrofagen subsets.

<ol><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J Immunol Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+apoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of apoptotic cell death.</a> J Immunol Methods. 243, 167-190 (2000).</li>
<li>Cornelissen, M., Philippe, J., De Sitter, S., De Ridder, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+V+expression+in+apoptotic+peripheral+blood+lymphocytes%3A+An+electron+microscopic+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Annexin V expression in apoptotic peripheral blood lymphocytes: An electron microscopic evaluation.</a> Apoptosis. 7, 41-47 (2002).</li>
<li>Fried, J., Perez, A. G., Clarkson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytofluorometric+analysis+of+cell+cycle+distributions+using+propidium+iodide.+Properties+of+the+method+and+mathematical+analysis+of+the+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytofluorometric analysis of cell cycle distributions using propidium iodide. Properties of the method and mathematical analysis of the data.</a> J Cell Biol. 71, 172-181 (1976).</li>
<li>Bacso, Z., Everson, R. B., Eliason, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+of+Annexin+V-binding+apoptotic+cells+is+highly+fragmented%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The DNA of Annexin V-binding apoptotic cells is highly fragmented.</a> Cancer Res. 60, 4623-4628 (2000).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. A., Lassota, P., Traganos, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+apoptotic+cells+measured+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Features of apoptotic cells measured by flow cytometry.</a> Cytometry. 13, 795-808 (1992).</li>
<li>Kroemer, G., Dallaporta, B., Resche-Rigon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+death%2Flife+regulator+in+apoptosis+and+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis.</a> Annu. Rev. Physiol. 60, 619-642 (1998).</li>
<li>Denecker, G., Vercammen, D., Declercq, W., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+and+necrotic+cell+death+induced+by+death+domain+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors.</a> Cell Mol. Life Sci. 58, 356-370 (2001).</li>
<li>Faleiro, L., Lazebnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+disrupt+the+nuclear-cytoplasmic+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caspases disrupt the nuclear-cytoplasmic barrier.</a> J Cell Biol. 151, 951-959 (2000).</li>
<li>Rieger, A. M., Hall, B. E., Luong, L. T., Schang, L. M., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+apoptosis+assays+using+propidium+iodide+generate+a+significant+number+of+false+positives+that+prevent+accurate+assessment+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Conventional apoptosis assays using propidium iodide generate a significant number of false positives that prevent accurate assessment of cell death.</a> J Immunol Methods. 358, 81-92 (2010).</li>
<li>Edward, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+Use+of+DNA-specific+anthraquinone+dyes+to+directly+reveal+cytoplasmic+and+nuclear+boundaries+in+live+and+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Minireview: Use of DNA-specific anthraquinone dyes to directly reveal cytoplasmic and nuclear boundaries in live and fixed cells.</a> Mol. Cells. 27, 391-396 (2009).</li>
<li>Njoh, K. L., Patterson, L. H., Zloh, M., Wiltshire, M., Fisher, J., Chappell, S., Ameer-Beg, S., Bai, Y., Matthews, D., Errington, R. J., Smith, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+analysis+of+the+DNA+targeting+bisalkylaminoanthraquinone+DRAQ5+in+intact+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Spectral analysis of the DNA targeting bisalkylaminoanthraquinone DRAQ5 in intact living cells.</a> Cytometry Part A. 69, 805-814 (2006).</li>
</ol>

De Annexine V / PI-protocol hier gepresenteerde is een aangepaste versie van conventionele protocollen en houdt rekening met de aanwezigheid van RNA in het cytoplasma die ook een hoge affiniteit voor PI. Introductie van RNase A (50 ug / mL) na een 1% formaldehyde fixatie stap laat in de kleuringsprocedure verbetert de nauwkeurigheid van de nucleaire PI kleuring. Geen negatieve effecten zijn waargenomen in nucleaire PI vlekken of plasmamembraan Annexine V vlekken. Zonder RNase Een behandeling kan tot 40% van de PI vlek resultaten leiden tot vals positieve gebeurtenissen, wat leidt tot een potentieel significante en negatieve invloed op de downstream conclusies 10. Onze aangepaste Annexine V / PI kleuringsprotocol is simpel en effectief is gebruikt in een breed scala van celtypen (primaire cellen: muizen beenmerg macrofagen en splenocyten; varkens long inwoner cellen-, long-alveolaire macrofagen, mesenteriale lymfeklieren isoleert, perifere bloed leukocyten , splenocyten; kip blastoderm cellen; goudvis primaire nieren macrofagen; karper perifere bloed leukocyten; Cellijnen: RAW 264,7 macrofagen, Jurkat T-cellen, varkens 3D4/31 macrofagen, CCL-71 goudvis fin fibroblasten, 3B11 meerval B-cellen 10). Het is belangrijk op te merken dat verschillend cellen worden beïnvloed door vals positieve PI kleuring, met primaire cellen over het algemeen een groter aantal valse positieve gebeurtenissen 10. De verschillen vals-positieve PI kleuring onder deze cellulaire populaties kan gedeeltelijk worden toegeschreven aan verschillen in celgrootte, maar kan ook het gevolg van verschillen in RNA content. Als zodanig, integratie van deze procedure is met name relevant voor experimentele systemen die gebruik maken van onder andere cellen die genotoxische stress, cellen behandeld met de celcyclus drugs, zoals thymidine of hydroxyurea, viraal-geïnfecteerde cellen, en studies over embryonale cellen waar de ontwikkeling progressie wordt gekenmerkt door discrete veranderingen in de cellulaire RNA-synthese.

<table><tbody><tr><td>1 x PBS-/-</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 x Annexine V-bindingsbuffer</td><td>BD Biosciences</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>Annexine V-Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>A13201</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumjodide (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td>1 mg/mL in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>2% Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1268</td><td></td></tr><tr><td>RNase A uit runderpancreas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td>DR50050</td><td>Verdun 1:60 in 1 x PBS-/-</td></tr></tbody></table>

modified annexine v / propidiumjodide apoptosis assay voor een nauwkeurige beoordeling van dood van de cel

Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death

Studies van cellulaire apoptose zijn aanzienlijk beïnvloed sinds de invoering van flowcytometrie-gebaseerde methoden. Propidiumjodide (PI) wordt veel gebruikt in combinatie met Annexine V om te bepalen of cellen zijn levensvatbaar, apoptotische of necrotische door verschillen in de plasma membraan integriteit en permeabiliteit 1,2. De Annexine V / PI-protocol is een veel gebruikte benadering voor het bestuderen van apoptotische cellen 3. PI is vaker dan andere nucleaire vlekken gebruikt omdat het economisch, stabiel en een goede indicator van de levensvatbaarheid van de cel, op basis van haar vermogen om kleurstof uit te sluiten in levende cellen 4,5. Het vermogen van PI naar een cel in te voeren is afhankelijk van de permeabiliteit van het membraan, PI maakt geen vlekken woont of vroege apoptotische cellen als gevolg van de aanwezigheid van een intacte plasmamembraan 1,2,6. Aan het eind van apoptotische en necrotische cellen, de integriteit van het plasma en de nucleaire membranen daalt 7,8, waardoor PI te passeren door de membranen, in nucleïnezuren intercaleren, en rode fluorescentie 1,2,9 weer te geven. Helaas vinden we dat de conventionele Annexine V / PI-protocollen leiden tot een aanzienlijk aantal vals positieve gebeurtenissen (tot 40%), die worden geassocieerd met PI kleuring van RNA in de cytoplasmatische compartiment 10. Primaire cellen en cellijnen in een breed scala van diermodellen worden beïnvloed, met grote cellen (nucleair: cytoplasmatische ratio &lt;0,5) met de hoogste gebeurtenis 10. Hierin tonen we een aangepaste Annexine V / PI methode die een significante verbetering voor de beoordeling van celdood in vergelijking met conventionele methoden biedt. Dit protocol maakt gebruik van veranderingen in de cellulaire permeabiliteit tijdens de celdeling de vaststelling dat de instroming van RNase A te bevorderen in de cellen na kleuring. Zowel de timing en de concentratie van RNase A zijn geoptimaliseerd voor het verwijderen van cytoplasmatische RNA. Het resultaat is een aanzienlijke verbetering ten opzichte van conventionele Annexine V / PI-protocollen (&lt;5% evenementen met cytoplasmatisch PI kleuring).

Een nauwkeurige methode voor de beoordeling van de cel dood is beschreven. Het protocol verbetert conventionele Annexine V / propidiumjodide (PI) protocollen, die up display tot 40% vals-positieve gebeurtenissen in cellijnen en primaire cellen van een breed scala van diermodellen.

Modified Annexine V / propidiumjodide Apoptosis Assay Voor een nauwkeurige beoordeling van Dood van de Cel

Studies naar cellulaire apoptose zijn aanzienlijk beïnvloed sinds de introductie van methoden gebaseerd op flowcytometrie. Propidiumjodide (PI) wordt op grote schaal...

Het algemene doel van het experiment is om de huidige problemen met conventionele Annexine vijf- en Propidiumjodide-kleuringstechnieken voor de evaluatie van celsterfte door apoptose en/of necrose te overwinnen. We hebben vastgesteld dat conventionele kleuringsbenaderingen bij een breed scala aan cellijnen en primaire cellen leiden tot tot wel 40% fout-positieve gebeurtenissen. Deze fout-positieve gebeurtenissen worden veroorzaakt door de kleuring van cytoplasmatisch RNA.Omgekeerd vermindert ons protocol het aantal fout-positieve incidenties drastisch door fixatie- en RNA-degradatiestappen in specifieke fasen te introduceren. In de kleurprocedure worden de cellen eerst gekleurd met X in vijf en propidiumjodide om celdood te detecteren volgens conventionele procedures. Vervolgens worden de cellen gefixeerd met 1% formaldehyde, wat de permeabiliteit van het plasmamembraan verhoogt. Ten slotte worden de gefixeerde cellen behandeld met RNase A om cytoplasmatisch RNA af te breken, waardoor propidiumjodide-kleuring die fout-positieven veroorzaakt, wordt geëlimineerd.Net als veel celbiologen hebben wij conventionele flowcytometrie-methoden met annexine V en propidiumjodide gebruikt voor het detecteren van apoptotische en necrotische celdood. Helaas hebben we onlangs vastgesteld dat deze methode leidt tot een aanzienlijk aantal fout-positieve gebeurtenissen, tot wel 40%, in diverse cellijnen en primaire cellen. Deze bijgewerkte methode overwint deze beperkingen.Onze aanpak maakt gebruik van celfixatie en RNA-digestie in specifieke stappen gedurende de procedure om cytoplasmatisch RNA selectief te verwijderen, een kleuring die direct leidt tot deze fout-positieve gebeurtenissen. Oogst de cellen die voor het experiment geanalyseerd moeten worden. In deze video gebruiken we rauwe macrofagen. Centrifugeer ter illustratie de monsters bij 335 Gs gedurende 10 minuten bij 4 °C, schenk het supernatant af en resuspendeer de cellen in 2 mL 1X PBS.Was de cellen vervolgens opnieuw onder dezelfde omstandigheden. Resuspendeer de cellen ditmaal in één milliliter van de 1X NX en five binding buffer. Na het centrifugeren van de monsters en het decanteren van het supernatant, resuspendeer je de cellen in een eindvolume van 100 microliters van de 1X NX Xin five binding buffer.Voeg een Xin five toe aan elk celmonster volgens de aanbevelingen van de fabrikant. In deze video worden bijvoorbeeld 2,5 microliters van een Xin five zi toegevoegd aan elke polystyreen buis met ronde bodem. Incubeer de buizen gedurende 15 minuten in het donker bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens 100 µL van 1X NX-in-5 bindingsbuffer toe aan elke reactiebuis. Er moet nu ongeveer 200 µL oplossing in elke buis zitten. Bereid vervolgens een 1:10 verdunning van propidiumjodide (PI) in 1X NX-in-5 bindingsbuffer. Voeg vier µL van de verdunde PI toe aan elke buis, wat resulteert in een eindconcentratie van 2 µg/mL PI in elk monster.Incubeer de buizen opnieuw 15 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Was na deze incubatieperiode de cellen met 500 µL 1X NX and five bindingsbuffer, centrifugeer de monsters 10 minuten bij 335 Gs bij 4 °C en giet het supernatant af. Resuspendeer de cellen in nog eens 500 µL 1X NX and five bindingsbuffer met 500 µL 2% formaldehyde.Om een 1% formaldehydeloplossing te maken, mengt u de buisjes door er voorzichtig tegenaan te tikken. Fixeer de monsters op ijs gedurende 10 minuten na de fixatie. Voeg één milliliter 1x PBS toe aan elk monster en meng voorzichtig door te tikken; centrifugeer de cellen bij 425 Gs gedurende acht minuten bij vier graden Celsius, drie keer tijdens het wassen.Bereid een 1:100 verdunning van RNA A in 1x PBS, resuspendeer het pellet door aan de buisjes te tikken en voeg 16 µL van de verdunde RNA A-oplossing toe om een uiteindelijke concentratie van 50 µg/mL te verkrijgen. Incubeer de monsters vervolgens gedurende 15 minuten bij 37 °C. Was daarna de cellen in 1 mL 1x PBS en meng voorzichtig door aan de buisjes te tikken, waarna de buisjes 8 minuten bij 4 °C worden gecentrifugeerd bij 425 ×g.De monsters zijn nu klaar voor analyse. Alternatief kunnen de monsters worden gebruikt voor daaropvolgende kleuringsstappen indien de N-X-M-P-I-kleuring parallel aan andere procedures wordt uitgevoerd. Representatieve beelden van de stream flowcytometer laten de mate van fout-positieve kleuring zien in drie unieke celpopulaties.Eén veelgebruikte cellijn van rauwe macrofagen en twee primaire cellijnen die beenmergmacrofagen en primaire niermacrofagen van goudvissen nabootsen. Het gebruik van primaire macrofagen van goudvissen benadrukt de toepasbaarheid van deze techniek op diverse cellulaire platforms. True positive events vertonen de verwachte colocalisatie binnen het nucleaire compartiment tussen PI en drac.Five, een sterk membraanpermeabele kleurstof die het kerncompartiment van levende en dode cellen nauwkeurig kleurt, zoals blijkt uit de gele kleuring. Hier werd de nauwkeurigheid van de PI-kernkleuring beoordeeld op basis van de mate van gelijkenis met D dr five BRDU seven A.A D DPI, en DRAC five vertoonden een gelijkenis van meer dan 99% in hun vermogen om de kern nauwkeurig te kleuren in de raw 2 64 0.7 macrofaag-cellijn. In tegenstelling hiermee leidde de cytoplasmatische PI-kleuring die optreedt bij het gebruik van conventionele protocollen tot een aanzienlijke afname in het percentage gelijkenis van de kernkleuring ten opzichte van d dr five.In deze figuur is te zien dat de toevoeging van 50 µg/mL RNase A niet-nucleaire PI-kleuring verwijdert en de mate van overeenkomst met ddr5-kleuring in murn, beenmergmacrofagen en primaire niermacrofagen van goudvissen significant verhoogt. Representatieve beelden van primaire niermacrofagen in deze figuur tonen het verlies van RNA-kleuring in het cytoplasmatische compartiment na behandeling met RNase A. Deze scatterplots van primaire niermacrofagen van goudvissen tonen een significante reductie van foutieve apoptotische necrotische gebeurtenissen in cellen die zijn geprepareerd met het gemodificeerde nexin PI-protocol.Het nieuwe protocol laat zien dat 84,9% van de cellen levensvatbaar is. De gates werden getrokken op basis van parallelle imagestroommonsters die fluorescentie- en morfologische kenmerken beoordelen. In één voorbeeld werden vroege progenitor-monocyten en mature macrofagen gekleurd met het in deze video beschreven gemodificeerde NX in five PI-protocol, of met de conventionele methode voor deze figuur; cellen die met het gemodificeerde protocol waren gekleurd, vertoonden een visuele afname in het aantal positieve PI-events door de verwijdering van fout-positieve events door de RNAse-behandeling.Verder was dit effect uitgesprokener in grote, mature macrofaagcellen dan in kleinere, vroege progenitorcellen. Conclusies op basis van conventionele protocollen zouden ten onrechte hebben gesuggereerd dat er een positieve correlatie was in celsterfte voor de meer mature macrofaagsubsets. Na deze kleuringsprocedure kunnen verdere stappen, zoals intracellulaire of oppervlaktekleuring, worden uitgevoerd om specifieke vragen te beantwoorden over de subpopulaties binnen uw celisolaat. De relevantie van deze techniek gaat verder dan vragen op het gebied van immuniteit; zo is deze bijvoorbeeld ook relevant voor experimentele systemen die gebruikmaken van cellen die genotoxische stress ondergaan, cellen behandeld met cellcyclusremmers, geneesmiddelen zoals thymidine of hydroxyurea, en studies naar embryonale cellen waarbij de ontwikkelingsprogressie wordt gekenmerkt door discrete veranderingen in de cellulaire RNA-synthese.

modified-annexin-vpropidium-iodide-apoptosis-assay-for-accurate

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De effecten van activering van eiwit kinase C (PKC) isozymen op mitochondriële functies geassocieerd met ademhaling en oxidatieve fosforylering en cellevensvatbaarheid beschreven. De aanpak past adenovirale techniek om selectief PKC overexpressie isozymen in primaire celkweek en verschillende assays voor mitochondriële functies en energie status van de cel te bepalen.

Beoordeling van Mitochondriale functies en levensvatbaarheid van de cellen in de nier overexpressie Proteïne kinase C-isozymen

In this video, we demonstrate the Annexin V binding assay to measure the degree of eryptosis, erythrocyte programmed cell death, using fluorescent Annexin V staining. Apoptotic erythrocytes demonstrate phosphatidylserine translocation from the inner to the outer leaflet of the cell membrane, causing the fluorophore-tagged Annexin V to bind to the translocated phosphatidylserine, thereby emitting a fluorescent signal.

Annexin V Binding Assay: A Fluorescence-Based Technique to Identify Apoptotic Erythrocytes via Phosphatidylserine Labeling

Therapeutische verbindingen worden vaak eerst in vitro, waarbij de levensvatbaarheid assays onderzocht. Blind celtellingen door een menselijke waarnemer kan zeer gevoelig zijn voor kleine veranderingen in het aantal cellen maar functioneren niet beoordelen. Computergestuurde levensvatbaarheid assays, zoals hier beschreven, kan zowel de structuur en functie op een objectieve manier te beoordelen.

Levensvatbaarheid Testen voor Cellen in Cultuur

Multiplex testen kunnen nuttige informatie verschaffen voor basis cellulaire mechanismen en elimineren van verspilling van reagentia en onnodige herhaalde experimenten. We beschrijven hier een multiplex caspase-3/7 activiteit test, met fluorescerende-en-luminescente gebaseerde methoden, levensvatbaarheid van de cellen bepaald in een in vitro model hypothalamus na oxidatieve uitdaging palmitinezuur.

Gebruik van een caspase Multiplexing Test van apoptose bepalen in een Hypothalamus Cell Model

Het begrip anastasis verwijst naar het fenomeen waarbij stervende cellen in een laat stadium een celdoodproces omkeren, zichzelf repareren en uiteindelijk overleven. Hier demonstreren we protocollen voor het detecteren en volgen van cellen die anastasis ondergaan.

Strategieën voor Tracking Anastasis, A Cell Survival verschijnsel dat apoptose Keert

Een workflow met behulp van stroom cytometry of differentieel centrifugeren is ontwikkeld om te detecteren, te kwantificeren en te isoleren van apoptotic instanties uit een monster apoptotic hoge zuiverheid.

Detectie en isolatie van Apoptotic instanties hoge zuiverheid

Het protocol beschrijft een snelle, hoge doorvoer, betrouwbare, goedkope en onpartijdige test voor het efficiënt bepalen van cellulaire levensvatbaarheid. Deze test is vooral handig wanneer de mitochondriën van cellen zijn beschadigd, wat interfereert met andere tests. De test maakt gebruik van geautomatiseerd tellen van cellen bevlekt met twee nucleaire kleurstoffen - Hoechst 33342 en propidium jodide.

Een geautomatiseerde differentiële nucleaire kleuringtest voor nauwkeurige bepaling van Mitocan Cytotoxicity

Apoptose kan worden gekenmerkt door flowcytometrische analyse van vroege en late apoptotische biomarkers. De cervicale kankercellijn, SiHa, werd geanalyseerd op apoptosebiomarkers na behandeling met Actinomycine D met behulp van een benchtop flowcytometer.

Flowcytometrische analyse van apoptotische biomarkers in actinomycine D-behandelde SiHa baarmoederhalskankercellen

Dit protocol is gebaseerd op LPS- en ATP-geïnduceerde dood van PMA-gedifferentieerde THP-1-macrofagen. We gebruiken flowcytometrie om Annexine V en 7-AAD dubbele kleuring te analyseren om celdood te detecteren, waarbij we de hele cel gebruiken en scanning-elektronenmicroscopie gebruiken om de morfologie van het celmembraan te observeren.

LPS- en ATP-geïnduceerde dood van PMA-gedifferentieerde THP-1-macrofagen en de validatie ervan

Pyrosequencing (R) is een van de meest grondige toch eenvoudige methoden tot op heden gebruikt om de polymorfismen te analyseren. Deze methode heeft geleid tot een snelle en efficiënte single-nucleotide polymorfisme evaluatie met inbegrip van vele klinisch relevante polymorfismen. De techniek en de methodologie van Pyrosequencing wordt uitgelegd.

Pyrosequencing: een eenvoudige methode voor Nauwkeurige Genotyping

Leer een verbeterde Annexine V/propidiumjodide methode voor nauwkeurige evaluatie van celdood door apoptose en necrose. Dit protocol vermindert valse positieven door fixatie en RNA-afbraak.

Modified Annexine V / propidiumjodide Apoptosis Assay Voor een nauwkeurige beoordeling van Dood van de Cel

Meer video's verkennen