Name: Bioluminescentie Imaging voor beoordeling van immuunreacties na implantatie van Engineered hartweefsel (EHT) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Leer bioluminescentie-imaging voor niet-invasieve monitoring van immuunreacties na implantatie van engineered heart tissue (EHT) in ratten. Deze methode maakt longitudinale beoordeling van weefseloverleving en afstoting mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Sonja Schrepfer, Lenard Conradi en Arne Hansen kreeg financiële steun van de Forschungsgemeinschaft (DFG, SCHR992/3-1, SCHR992/4-1, CO 858/1-1, HA 3423/3-1) Deutsche. Het werk werd ook ondersteund door subsidies van de Europese Unie om Thomas Eschenhagen (EUGeneHeart en Angioscaff).

1. EHT Generation en Cultuur voorwaarden De vervaardiging van fibrine-based EHT werd uitgevoerd zoals beschreven elders 4. Kortom, in fibrine-based EHT voor implantatie doeleinden te genereren, was een master mix bereid die cellen geïsoleerd uit neonatale ROSA / luciferase-LEW transgene rat harten, runderen fibrinogeen en Matrigel. Agarose gietvormen werden opgesteld op basis van Teflon spacers geplaatst in 6-well cultuur gerechten. Na het stollen van agarose, waren spacers verwijderd en siliconen post racks werden geplaatst op de cultuur gerechten met berichten tot in de mallen. Voor het genereren van EHT, was de mastermix kort gemengd met een berekende hoeveelheid trombine en gepipetteerd in de mal. Na de polymerisatie van fibrinogeen, waren siliconen rekken met EHTs zich te houden aan de posten voorzichtig verwijderd uit de agarose gietmallen, overgebracht naar nieuwe 6-well celkweek gerechten en onderhouden in een 37 ° C, 7% CO 2 celkweek incubator met behulp van op maat gemaakt celkweekmedium. EHT werden gehouden onder celcultuur condities tot dag tien. Gedurende deze periode, neonatale rat hartcellen begon te langwerpig, interconnect en uit te lijnen langs de krachtlijnen in tussen siliconen berichten. Op het moment van implantatie, waren spontane coherent samentrekkingen waargenomen, afbuigen van siliconen berichten. 2. EHT Implantatie EHT implantatie werd uitgevoerd in een van beide immunocompetente Brown Noorwegen (BN) ratten, of immunodeficiëntie naakt ratten aan de allogene immuunrespons te onderzoeken. BN en naakt ratten een gewicht van 100 - 150 g werden gekocht van Charles River Duitsland (Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld) en gehuisvest onder gangbare condities, gevoed standaard rat chow en water ad libidum. Immunodeficiënte ratten zijn gehuisvest in een steriele beddengoed, kooien, en gesteriliseerd water wordt gebruikt. De Duitse ethische toetsingscommissie beoordeeld en goedgekeurd het dier procedures. Alle chirurgische instrumenten zijn gesteriliseerd. De implantatie procedure worden uitgevoerd als volgt: Rat zijn anesthesized met isofluraan (2,5-3%) met behulp van een inductie kamer. Menselijke blootstelling aan isofluraan kan worden verminderd door te werken in een afzuigtafel of niet-recirculerende kap. Lichaamstemperatuur wordt gehandhaafd tijdens de chirurgische ingreep. <ol><li> Scheren buikstreek en gelden oogzalf om de ogen te voorkomen dat het drogen tijdens anesthesie. </li><li> Leg de rat op zijn rug en zet een masker over zijn neus en mond te houden van de anesthesie. </li><li> Ontsmet de buikstreek met Betadine en daarna 80% ethanol. Wattenstaafje van schoon naar vies, van het centrum van geschoren gebied verplaatsen naar buiten de richting van de haren gebied. </li><li> Controleer reflexen knijpen de achterpoten voeten om er zeker van dat de rat voldoende verdoofd. </li><li> Drapeer het dier en het uitvoeren van een middellijn incisie in de buik het scheiden van de huid en de spieren in twee stappen om de buik te openen. Hete kraal sterilisatie wordt gebruikt tussen de huid en spieren opening. </li><li> Plaats de darmen in een verwarmde zoutoplossing gehydrateerd poeder handschoen. Vouw de handschoen rond de darmen om verlies van vocht te voorkomen. </li><li> Verwijderen vetweefsel en bloot de milt. </li><li> Visualiseer en verspreiden een grotere omentum met een pincet. </li><li> Snijd EHT van opschorting van siliconen berichten en transfer naar het grotere omentum. </li><li> Wikkel de grotere omentus rond de EHT en lossen met behulp van twee eenpersoons 7-0 prolene hechtingen (Ethicon, Norderstedt, Duitsland) </li><li> Volgende terug naar de darmen in de buik. </li><li> Spoel de buik met een voorverwarmde steriele zoutoplossing. </li><li> Sluit de spierlaag van de buikwand met 6-0 prolene lopen hechtingen (Ethicon, Norderstedt, Duitsland). </li><li> Gebruik 5-0 prolene (Ethicon, Norderstedt, Duitsland) loopt hechtingen op de huid te sluiten. </li><li> Terwijl de rat is nog steeds in anesthesie, subcutaan injecteren 5 mg / kg Carprofen. </li><li> Om voldoende analgesie voor dit soort procedure, een pijnstiller (zoals Metamizol) wordt toegevoegd aan het drinkwater (50 mg Metamizol per 100 ml) voor pijnstillers voor 3 dagen na de transplantatie. </li></ol> 3. Bioluminescentie beeldvorming van EHT na de implantatie De IVIS BioImaging platform (Xenogen, Alameda, CA, USA) wordt gebruikt voor niet-invasieve bioluminescentie beeldvorming in-vivo en de resultaten worden geanalyseerd met behulp van de IVIS Living Image (Xenogen) software pakket. Beeldvorming wordt uitgevoerd per dag vanaf twee uur na de operatie. Verdoven rat met isofluraan (2,5 - 3%) met behulp van een inductie kamer. <ol><li> Ontsmet de buik-en borstkas gebied op grote schaal gebruik van Provo-Jodium, naast het gebruik 80% ethanol, herhaalt u deze stap drie keer. </li><li> Injecteren d-Luciferine (Xenogen; 375 mg / kg lichaamsgewicht) ip </li><li> Plaats verdoofde ratten in de IVIS beeldvorming kamer (maximaal 4 ratten kunnen worden geanalyseerd op hetzelfde moment). </li><li> Beoordeel signaal intensiteit van de luc + cellen binnen EHT in eenheden van fotonen / sec / cm 2 / steridianin de regio van belang (ROI) bij aanvang (120 minuten na implantatie) en op dag 1, 2, 3, 5, 7, 10, en in week 2, 3 en 4. Let op de piek-signaal (verschijnt ongeveer 20 minuten na D-Luciferine injectie). </li></ol> Maak een grafiek (Excel) met de signaal intensiteit in de tijd. 4. Correlatie van BLI Resultaten en ELISPOT De cellulaire in-vivo immuunresponsen bij immunocompetente BN en immunodeficiënte naakt ratten werden onderzocht na EHT transplantatie. De milt van de ontvanger dieren werd geoogst 5 dagen na de transplantatie EHT aan ontvanger splenocyten isoleren. ELISPOT-tests met behulp van mitomycine-remde EHTs (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) als stimulator en 5 x10 6 ontvanger splenocyten als responder cellen werden uitgevoerd volgens protocol van de fabrikant (BD Biosciences) met behulp van IFN-γ en IL-4 gecoat platen te onderzoeken TH1-, en TH2 respons van respectievelijk. IFN-γ-en IL-4 plekken waren significant hoger in de immunocompetente, model in vergelijking met het immuundeficiënte model (IFN-γ: p = 0,001; IL-4: p = 0,023; Student&#39;s t-test). 5. Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/2605/2605fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Correlatie van BLI resultaten en ELISPOT a) De in vivo cellulaire immuunresponsen bij immunocompetente Brown Noorwegen en immunodeficiënte naakt ratten werden onderzocht na EHT implantatie. Ontvanger splenocyten werden geoogst 5 dagen na EHT implantatie. IFN? en IL-4 expressie werd geëvalueerd door ELISPOT-tests met mitomycine-geremd EHT als stimulatoren en 5x106 ontvanger splenocyten als responder cellen. Th1 en Th2 reacties waren significant hoger in de immunocompetente model ten opzichte van de immunodeficiëntie model zoals blijkt uit IFNy-en IL-4 productie van respectievelijk. b) Luc + EHTs werden getransplanteerd in het grotere omentus van een van beide immuuncompetente BN ratten of immunodeficiënte naakt ratten. Overleving van de cel werd longitudinaal gevolgd door BLI. Het tarief van dieren die de getransplanteerde EHTs afgewezen wordt gepresenteerd. Alle BN ratten snel verwierpen de EHT transplantatie, terwijl de cellen overleefden in de T-cel deficiënte ratten.

<ol><li>Eschenhagen, T., Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+myocardial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering myocardial tissue.</a> Circ Res. 97, 1220-1231 (2005).</li>
<li>van der Bogt, K. E., Schrepfer, S., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+transplantation+of+adipose+tissue-+and+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+the+infarcted+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of transplantation of adipose tissue- and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the infarcted heart.</a> Transplantation. 87, 642-652 (2009).</li>
<li>Hakamata, Y., Murakami, T., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Firefly+rats%22+as+an+organ%2Fcellular+source+for+long-term+in+vivo+bioluminescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">"Firefly rats" as an organ/cellular source for long-term in vivo bioluminescent imaging.</a> Transplantation. 81, 1179-1184 (2006).</li>
<li>Hansen, A., Eder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Drug+Screening+Platform+Based+on+Engineered+Heart+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a Drug Screening Platform Based on Engineered Heart Tissue.</a> Circ Res. , (2010).</li>
</ol>

Voor klinische implementatie van EHT technologie voor cardiale reparatie, fundamentele vragen zoals de immunogeniciteit van zowel cellulaire en matrix componenten of transplantaat overleving na implantatie moeten worden beoordeeld in experimentele modellen. In-vivo bioluminescentie beeldvorming vormt een nuttige nieuwe techniek voor het toezicht op overleving van de cel na transplantatie . Wij hebben met succes gegenereerd fibrine-based EHT met luciferase positieve (luc +) hart cellen door aanpassing van een va...

<ul><li> LEW-Tg (Gt (ROSA) 26Sor-luc) 11Jmsk ratten (NBPR rat nummer 0299, http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/) </li><li> Runderen fibrinogeen (voorraad-oplossing: 200 mg / ml aprotinine plus 5 ug / ml fibrinogeen in NaCl 0,9%, Sigma F4753) </li><li> Matrigel (BD Bioscience 356235) </li><li> DMEM (Biochrome F0415) </li><li> Paard serum (Gibco 26050) </li><li> Penicilline / streptomycine (Gibco 15140) </li><li> Insuline (Sigma-Aldrich I9278) </li><li> Aprotinine (Sigma Aldrich A1153) </li><li> d-Luciferine (Biosynth L-8220) </li><li> Enzyme-linked immunosorbent spot (ELISPOT) assay platen (Hassa Laborbedarf, S2EM004M99) </li></ul>

bioluminescentie imaging voor beoordeling van immuunreacties na implantatie van engineered hartweefsel (eht)

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Verschillende technieken van cardiale tissue engineering zijn gevoerd in de afgelopen decennia ook steigers strategieën door middel van een native of bioartificial scaffold materialen, entrapment van cardiale myocyten in hydrogels, zoals fibrine en collageen en stapelen van myocyte monolagen 1. Deze concepten zijn gericht op herstel van gecompromitteerde cardiale functie (bijvoorbeeld na een myocardinfarct) of als experimentele modellen (zoals voorspellende toxicologie en stof screening of ziekte modellering). Nauwkeurige controle van overleving van de cel na implantatie van technisch hartweefsel (EHT) is nu mogelijk met behulp van in-vivo bioluminescentie imaging (BLI) technieken 2. Hier beschrijven we de generatie van fibrine-gebaseerde EHT van een transgene rat stam met alomtegenwoordige uitdrukking van vuurvlieg luciferase (ROSA / luciferase-LEW Tg, 3). Implantatie wordt uitgevoerd in de grotere omentum van de verschillende stammen tot rat immuunrespons van het recipiënte organisme volgende EHT implantatie te beoordelen. Vergelijking van de resultaten gegenereerd door BLI en de Enzyme Linked Immuno Spot Techniek (ELISPOT) bevestigen de bruikbaarheid van BLI voor de beoordeling van immuunreacties.

Deze video toont het gebruik van<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescentie beeldvorming om de immuunrespons studie na implantatie van Engineered hartweefsel (EHT) bij ratten.

Bioluminescentie Imaging voor beoordeling van immuunreacties na implantatie van Engineered hartweefsel (EHT)

In de afgelopen decennia zijn verschillende technieken voor cardiac tissue engineering onderzocht, waaronder scaffolding-strategieën met gebruik van zowel natuurlijke als ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om in vivo bioluminescentie-imaging te gebruiken om immuunresponsen te bestuderen na implantatie van engineered hartweefsel (EHT) in ratten. Dit wordt bereikt door eerst luciferase-positieve EHT's te genereren. Vervolgens worden EHT's die stabiel luciferase tot expressie brengen, getransplanteerd in het omentum majus van ontvangende ratten.Vervolgens kan in vivo bioluminescentie-imaging worden uitgevoerd bij recipientdieren om de niet-invasieve longitudinale overleving en afstoting van de EHT te monitoren. Met dit model kunnen bijvoorbeeld de intensiteit en kinetiek van acute afstoting worden gecorreleerd aan de afname van de waargenomen bioluminescentiesignaalintensiteit in de loop van de tijd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals histologie is dat dagelijkse metingen een niet-invasieve longitudinale beoordeling van de graftoverleving mogelijk maken.Deze methode kan inzicht bieden in het overleven en de afstoting van engineered hartweefsels, maar kan ook worden toegepast op andere vragen. Bijvoorbeeld het metabolisme van ehs. De bili-techniek zal worden gedemonstreerd door Christiana

bioluminescence-imaging-for-assessment-immune-responses-following

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Met de groeiende belangstelling voor stamceltherapieën, moleculaire imaging technieken zijn ideaal voor de bewaking stamceltransplantatie gedrag na transplantatie. Luciferase reporter genen hebben ingeschakeld non-invasieve, repetitieve evaluatie van de overleving van de cel, de locatie en de proliferatie in vivo. Deze video zal laten zien hoe je hESC proliferatie track in een levende muis.

In vitro en in vivo bioluminescente reportergen-beeldvorming van menselijke embryonale stamcellen

De chirurgische procedure voor de levering van embryonale stamcel-afgeleide endotheelcellen van de ischemische achterbeen is aangetoond, met niet-invasieve tracking door bioluminescentie imaging.

Embryonale stamcellen afgeleide endotheelcellen voor de behandeling van ischemie achterbeen

Intracraniële implantatie van GL261 cellen in C57BL / 6 muizen produceert kwaadaardige gliomen dat veel van de kenmerken van de menselijke glioblastoma multiforme samenvatten. We gebruikten GL261 cellen die stabiel uitdrukken luciferase om ons in staat om te...

Intracraniële Implantatie met Latere 3D In Vivo Bioluminescent Imaging van Murine Gliomen

Een methode om celfusie track in levende organismen na verloop van tijd wordt beschreven. De aanpak maakt gebruik van...

Een Cre-Lox P Recombinatie Aanpak voor de detectie van celfusie In Vivo</em

Dit artikel beschrijft een optimale volgorde van de gebeurtenissen voor de multimodale beeldvorming van cellulaire grafts in knaagdier hersenen met behulp van: (i) in vivo bioluminescentie en magnetische resonantie beeldvorming, en (ii) post mortem histologische analyse. De combinatie van deze beeldvorming op een enkel dier laat cellulaire graft evaluatie met een hoge resolutie en gevoeligheid en specificiteit.

Multimodal Imaging van Stem Cell implantatie in het centrale zenuwstelsel van Muizen

Bioluminescent Bacteriële Imaging<em&gt; In Vivo</em

Zoogdierlijke cellen die het bacteriële bioluminescentie gencassette...

Autonoom Bioluminescente zoogdiercellen voor continue en real-time monitoring van de cytotoxiciteit

Implantatie van een biograft myocardiaal infarct geïnduceerd door LAD ligatie in een knaagdier model behandelen conventioneel vereist twee open-hartoperaties. Om terug te dringen en de optimale omstandigheden voor fixatie van vaste en gelatineachtige biomatrices geassocieerd met cellen, hebben minimaal invasieve procedures ontwikkeld.

Cel-gebaseerde therapie voor hartfalen bij Rat: Dubbele Thoracotomie voor myocardinfarct en Epicardiale Implantatie van Cellen en Biomatrix

Hier introduceren we een methode voor het gebruik van een intra-ventrikel optische katheter in geperfundeerd harten om Absorptie spectroscopie uit te voeren over de hart muur. De verkregen gegevens bieden robuuste informatie over de zuurstofspanning van het weefsel, evenals substraat gebruik en membraanpotentiaal gelijktijdig met cardiale prestatie maatregelen in deze alomtegenwoordige voorbereiding.

Intra-cardiale side-afvuren licht katheter voor het monitoren van cellulaire metabolisme met behulp van Transmural extinctie spectroscopie van Geperfectiongebruikt zoogdieren harten

Het gebruik van licht om hartcellen en -weefsel te controleren, maakt contactloze stimulatie mogelijk, waardoor de natuurlijke staat en functie van de cellen behouden blijven, waardoor het een waardevolle benadering is voor zowel fundamenteel onderzoek als therapeutische toepassingen.

Een cardiaal microfysiologisch systeem voor het bestuderen van Ca2+ propagatie via niet-genetische optische stimulatie

Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor echocardiografie-geleide intramyocardiale injecties in rattenmodellen van een myocardinfarct met behulp van een naald van 29 G x 88 mm. Deze techniek zorgt voor een robuuste, nauwkeurige en reproduceerbare toediening van therapeutische middelen rechtstreeks in de peri-infarctzone.

Echocardiografiegeleide injectie voor gerichte en betrouwbare intramyocardiale stamcelafgifte in een rattenmodel van een myocardinfarct

Leer bioluminescentie-imaging voor niet-invasieve monitoring van immuunreacties na implantatie van engineered heart tissue (EHT) in ratten. Deze methode maakt longitudinale beoordeling van weefseloverleving en afstoting mogelijk.

Bioluminescentie Imaging voor beoordeling van immuunreacties na implantatie van Engineered hartweefsel (EHT)

Meer video's verkennen