Name: Techniek Biologisch-Based vaattransplantaten Met behulp van een Pulsatiele Bioreactor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Leer biologische vaattransplantaten ontwikkelen met een pulsatiele bioreactor voor cardiovasculaire toepassingen. Deze methode gebruikt PGA-scaffolds en gladde spiercellen om implantaten te creëren voor arteriële bypasschirurgie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt gefinancierd door National Institutes of Health Grant R01 EB-008836 en R01 HL083895 (zowel voor LEN). We zouden graag Daryl Smith, de Universiteit Glassblower, bedanken voor het maken van de bioreactoren voor ons onderzoek.

Autoclaaf Monteer en autoclaaf de buizen voor de stroom-systeem en bioreactor componenten (bioreactor zelf en de silicone stop deksel) zoals aangegeven in figuur 1 en figuur 2. Sonde heeft een mannelijke connector aan het ene uiteinde en een open eind aan de andere kant. Drie korte slang segmenten worden ingebracht via een silicone cap voor gasuitwisseling. 1. Naaien PGA Mesh <ol><li> Gesneden PGA gaas 1,1 cm x ~ 8cm vel (afhankelijk van de bioreactor formaat). </li><li> Schoon silicone (3mm inwendige diameter) met gedestilleerd water (dH20) en de lucht drogen voor gebruik. </li><li> Gebruik Dexon 6,0 hechtdraad tot PGA mesh naaien rond de schone silicone slangen te beginnen met drie chirurgische knopen, gevolgd door enkele steken. </li></ol> 2. PGA Steigers Surface Treatment <ol><li> Dip PGA steigers in 1M NaOH voor 1-2min en registreren van de behandeling de tijd en gebruik dezelfde tijd voor alle PGA steigers. </li><li> Spoel PGA steigers in dH2O baden voor 2 minuten 3 keer. </li><li> Pat PGA steigers droog met Kimwipes tussen elke duik in dH 2 O baden. </li><li> Droge PGA steigers onder weefselkweek motorkap te droge lucht gedurende 15 minuten met een blower op. </li></ol> 3. Naaien Dacron armen <ol><li> Gebruik Prolene 4,0 hechtdraad tot kleine stukjes van Dacron manchetten (1cm) naaien op elk uiteinde van de PGA gaas met een overlap van 2-3mm. Let op: wees niet te doorboren silicone (figuur 3). </li><li> Gebruik dezelfde hechtdraad tot drie steken naaien rond het vrije uiteinde van Dacron manchetten. Zorg ervoor dat u voldoende hechtingen vertrekken op de vrije uiteinden van Prolene hechtdraad voor stap 5.1 (figuur 3). </li></ol> 4. Vergadering van Bioreactor (Dag voor het begin van bioreactor cultuur) <ol><li> Soak genaaid mesh en siliconen slangen, chirurgische instrumenten, en een dunne draad in een 70% ethanol bad voor 20-30 minuten. </li><li> Open de autoclaaf zakjes met daarin de bioreactor en dompel het in 70% ethanol bad gedurende tenminste 30 minuten voor de montage. Zorg ervoor dat de bioreactor grondig te spoelen met ethanol. Blootstelling van alle bioreactor componenten tot 70% ethanol is een aanvulling sterilisatie stap. Deze stap verwijdert ook endotoxine, die niet wordt verwijderd door autoclaveren en is schadelijk voor de vasculaire cellen. </li><li> Trek de silicone slang door zij-armen met behulp van dunne draad te trekken door. </li><li> Neem de bioreactor van ethanol bad (houden mesh ondergedompeld in ethanol). Bevestig de PGA schavot in de bioreactor door het aandraaien van Dacron manchetten over de uitlopende glazen lippen door aanscherping en het vastbinden van de Prolene hechtingen (figuur 3). </li><li> Sluit een kant van de bioreactor zijarmen aan op de connectoren via silicone. </li><li> Trek andere kant van siliconen buis met voldoende spanning en voeg de resterende twee connectors in silicone. Houd vast aan silicone goed bij het plaatsen van connectoren! </li><li> Plaats bioreactor in ethanol bad en spoelen met ethanol door het voorzichtig connectors uit de zijarmen. </li><li> Flip bioreactor op en laat een weken gedurende 10 minuten. </li><li> Flip bioreactor op de kop te genieten en voor een extra 10 minuten. </li><li> Giet alle ethanol. </li><li> Opzetten van drie grote petrischalen (10 cm) in serie en plaats bioreactor in het centrum schotel te houden van de overtollige ethanol droop van de uiteinden van de buizen. </li><li> Flush bioreactor en PGA mesh met weefselkweek water met behulp van een 5 ml of 10 ml pipet. Ook spoelen weefselkweek water in silicone. </li><li> Goed uitlekken alle overtollige water in petrischaaltjes aan beide zijden van de bioreactor. </li><li> Droge bioreactor overnachting in kap met blower aan en UV-OFF. </li><li> Aanvullende opmerkingen: zorg ervoor dat steriele roer bar is in de bioreactor. Zorg ervoor dat niet te "zweven" over de bioreactor vanaf dit punt naar voren, om besmetting te voorkomen. Cut-up veel parafilm strips en week ze in een kleine 70% ethanol bad (grote petrischaal werkt goed). </li></ol> 5. Dag 1: Bioreactor Setup <ol><li> Plaats een steriele petrischaal meer dan opening van elk bioreactor op de PGA steiger binnenkant te beschermen tegen verontreinigingen. </li><li> Monteer flow systeem om bioreactor zoals aangegeven in figuur 4 en parafilm de verbinding gewrichten. <ol><li> Veeg connectors eerst met alcohol doekjes. </li><li> Bevestig de injectiepoort aan derden, niet-gebruikte arm van bioreactor. </li><li> Verwijder de walrus slangen en stropdas af blauwe eind van zoutoplossing verwatering te stellen zo dicht mogelijk bij Y-splitsing mogelijk te maken. Trek slangklem op zijn plaats geen vloeistof dragen ervoor te zorgen dat dit deel van de buis </li><li> Verwijderen IV tas, en hechten walrus slang (rood) tot einde van IV tas. Zorg ervoor dat het inbrengen poort vegen met alcohol eerste vegen. </li><li> Bevestig walrus aan de ene kant van de stroom-systeem (via witte uiteinde buis). </li><li> Plaats 3-weg kraan in stromen systeem. </li><li> Verwijder de drukopnemer en verbinding te maken met drie-weg kraan. </li><li> Bevestig andere uiteinde van de drukopnemer tot midden opening in de tas. </li></ol></li><li> Aansluitende bioreactor om de stroom systeem via de Y-splitsing. Gebruik een 60ml spuit 350 ml van 1% fungizone (mix 5 ml fungizone met 495ml van PBS) aan IV zak. </li><li> Knijp IV zak aan de vloeiende systeem spoelen door het aanpassen van de afsluitkranen om stroom van PBS mogelijk te maken. Let op: Controleer de binnenkant van bioreactor om te verzekeren dat er geen lekken. </li><li> Re-schorten 8 x10 6 SMC (ongeveer een confluent T75) in 1,25 ml van middelgrote en zaad op elke PGA scafffold. Zorg ervoor dat celsuspensie is gelijkmatig is gedruppeld op de PGA mesh-Dacron kruising evenals op de onderkant van PGA mesh. </li><li> Veeg rand van bioreactor met een alcoholdoekje via het draaien van de bioreactor zijwaarts te voorkomen zweven. </li><li> Siliconen stop deksel montage (figuur 2) <ol><li> Peel autoclaaf tas voorzichtig terug en zorg ervoor niet naar onderkant bloot van het deksel. </li><li> Bevestig injectie poort voedingssonde bij de mannelijke connector. </li><li> Bevestig PTFE 0,20 micrometer filters aan elk van de drie luchthavens. </li><li> Wees niet te bloot / touch onderkant van het deksel tijdens dit proces. </li><li> Parafilm de injectiepoort. </li></ol></li><li> Plaats de siliconen stop deksel in glas bioreactor en zorg ervoor dat de sonde in de bioreactor niet de geplaatste PGA steigers aan te raken. Parafilm rond het deksel. </li><li> Plaats bioreactor met de stroom-systeem in de incubator (op de zijkant) en draai de bioreactor elke 5 minuten voor 25-30 minuten. </li><li> Vul de bioreactor kamer met 400 ml van onze cultuur 4-10 media, zoals beschreven in (tabel 1). Deze cultuur medium is "geoptimaliseerd" voor varkens ontworpen slagaders. </li></ol> 6. Dag 6-7: Draaien op de pomp, en de eerste voeding <ol><li> Statisch groeien de geplaatste steigers zonder enige pulserende pompen door de silicone pompslang voor 6-7 dagen. Er is geen noodzaak voor middelgrote wijzigen of vitamine C suppletie gedurende deze tijd. </li><li> Zorg ervoor dat er geen lekken zijn van PBS of knikken van flow systeem buizen voor het inschakelen van de pomp. </li><li> Zet de pomp van de stroom-systeem en zorg ervoor dat de pomp instellen, zodat aan te passen, dat de druk leest ongeveer 270/-30mmHg. </li><li> Record druk dagelijks in heel de cultuur en onderhouden van de druk op 270/-30mmHg. Drukopnemer kan worden aangesloten op een computer te lezen en bewaken van de druk. </li></ol> Eerste voeding <ol start="5"><li> Monteer injectiepoort &amp; PTFE-filter op het voeden deksels voor zowel de middellange verandering en middelgrote afval deposal doeleinden. </li><li> Plaats de sonde stevig op de pomp en steek het ene uiteinde het voeden van de haven van de bioreactor en het andere uiteinde op de voeding deksel. Zorg ervoor dat u de injectie poorten af ​​met ethanol doekjes. </li><li> Gebruik een dual-directionele Masterflex pomp naar pomp uit 200 ml medium. Maak dan gebruik van een nieuwe sonde terug te pompen 200 ml vers medium in de bioreactor. Begin altijd met een zeer lage snelheid, in het bijzonder bij het verpompen medium terug naar de bioreactor. </li><li> Verandering medium en aan te vullen ascorbinezuur 2x/week. Toe te voegen ascorbinezuur, gebruik dan een 30ml spuit tot het afsluiten van 25 ml van middelgrote en plaats gereserveerd in het weefsel kap. Los 25 mg ascorbinezuur in 5 ml PBS en filter het door een 0,22 urn filter. Eerste injecteren de steriele ascorbinezuur in de sonde en voeg de rug van de 25 ml medium genomen eerder. Het medium recept is weergegeven in tabel 1. </li></ol> 7. Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. De slangen en aansluitingen voor de stroom-systeem montage is hierboven weergegeven. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. De siliconen stop deksel montage is hierboven weergegeven. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Schema's van de bioreactor vergadering worden hierboven getoond. In de bioreactor Dacron manchetten zijn bevestigd op het glas armen met de blauwe hechtdraad knopen. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Flow systeem is aangesloten op buizen en bioreactor is hierboven weergegeven. L/S18 buis wordt gepompt door een Masterflex pomp en daarmee het besturen van de stroom. De druk transducer meet de druk voor het invoeren van de bioreactor op de bovenste stroom. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Afbeelding van geoogst ontworpen schip. Engineered schepen zullen blijken te zijn ondoorzichtig en het bereiken van een wanddikte van ongeveer 250μm na 8-week cultuur onder pulsatiele omstandigheden. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. Hematoxyline en eosine gekleurde doorsneden van gemanipuleerde schepen. A en B zijn 8-weekse niet-gepulste en gepulste schepen, respectievelijk.C en D zijn 4-week niet-gepulste en gepulste schepen, respectievelijk. L geeft aan de luminale zijde van de schepen. De schalen bar is 100 urn. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig7.jpg" alt="Figuur 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 7"> Figuur 7. Trichroom vlekken Masson voor collageen (blauw) voor de doorsneden van gemanipuleerde schepen. A en B zijn 8-weekse niet-gepulste en gepulste schepen, respectievelijk. C en D zijn 4-week niet-gepulste en gepulste schepen, respectievelijk. Merk op dat de 4-week gepulste schip meer collageen dan de niet-gepulste tegenhanger shows. Witte pijlen wijzen om de resterende PGA fragmenten in de schepen. De schalen bar is 100 urn. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig8.jpg" alt="Figuur 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 8"> Figuur 8. Immunochemie kleuring van SMC markers bij runderen ontworpen slagaders. Gladde spier α-actine, calponin-1, en ​​het gladde spierweefsel myosine zware keten (SMMHC) zijn vroege, intermediaire en late SMC contractiele markers, respectievelijk. Tegen het einde van de 12-week cultuur, de cellen in de vaatwand Express SM α-actine en matige hoeveelheden Calponin-1 en SMMHC. De schalen bar is 20μm. <table border="1"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> Aantal </td></tr><tr><td> DMEM (DME / laag gemodificeerd) </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> FBS (foetaal runderserum) warmte geïnactiveerd </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> HEPES 1,0 M </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> Vitamine C (opgelost in PBS of DMEM) </td><td> 25 mg </td></tr><tr><td> Proline / Glycine / Alanine 25 mg/25 mg/10 mg (opgelost in 5 ml PBS) </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> CuSO 4 1,5 microgram (opgelost in 1 ml PBS) </td><td> 1ml </td></tr><tr><td> Penicilline G bij 10.000 eenheden / ml </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> PDGF-BB (platelet-derived growth factor-BB) op 10ng/ml </td><td> 5μg </td></tr><tr><td> bFGF (basic fibroblast growth factor) bij 10ng/ml </td><td> 5μg </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Componenten van "4-10" medium worden weergegeven in de bovenstaande tabel. Met uitzondering van de PDGF-BB en bFGF, alle andere componenten moeten worden gefilterd door een 0.2μm filter voorafgaand aan gebruik.

<ol><li>Risau, W., Flamme, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Vasculogenesis.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 73-91 (1995).</li>
<li>Fankhauser, F., Bebie, H., Kwasniewska, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influcence+of+mechanical+Forices+and+Flow+Mechanisms+on+Vessel+Occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Influcence of mechanical Forices and Flow Mechanisms on Vessel Occlusion.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 6, 530-532 (1987).</li>
<li>Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+arteries+grown+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional arteries grown in vitro.</a> Science. 284, 489-493 (1999).</li>
<li>Prabhakar, V., Grinstaff, M. W., Alarcon, J., Knors, C., Solan, A. K., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+porcine+arteries%3A+Effects+of+scaffold+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Engineering porcine arteries: Effects of scaffold modification.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67A, 303-311 (2003).</li>
<li>Mitchell, S. L., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+growing+tissue-engineered+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Requirements for growing tissue-engineered vascular grafts.</a> Cardiovascular Pathology. 12, 59-64 (2003).</li>
<li>Dahl, S. L. M., Rhim, C., Song, Y. C., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+and+compositions+of+tissue+engineered+and+native+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties and compositions of tissue engineered and native arteries.</a> Annals of Biomedical Engineering. 35, 348-355 (2007).</li>
<li>Quint, C., Kondo, Y., Manson, R. J., Lawson, J. H., Dardik, A., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9214-9219 (2011).</li>
<li>Niklason, L. E., Yeh, A. T., Calle, E. A., Bai, Y., Valentín, A., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+Tools+for+Engineering+Collagenous+Tissues+Integrating+Bioreactors%2C+Intravital+Imaging%2C+and+Biomechanical+Modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Enabling Tools for Engineering Collagenous Tissues Integrating Bioreactors, Intravital Imaging, and Biomechanical Modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 3335-3339 (2010).</li>
<li>Gong, Z., Calkins, G., Cheng, E. -c, Krause, D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Culture+Medium+on+Smooth+Muscle+Cell+Differentiation+from+Human+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Influence of Culture Medium on Smooth Muscle Cell Differentiation from Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 15, 319-330 (2009).</li>
<li>Gong, Z. D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-diameter+human+vessel+wall+engineered+from+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+%28hMSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+Journal%22%5BJournal%5D)">Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs.</a> Faseb Journal. 22, 1635-1648 (2008).</li>
<li>Poh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+engineered+from+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Blood vessels engineered from human cells.</a> Lancet. 365, 2122-2124 (2005).</li>
<li>American Heart Association. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biostatistical+fact+sheet%3A+cardiovascular+procedures%22">Biostatistical fact sheet: cardiovascular procedures</a>. , American Heart Association. (2002).</li>
</ol>

De kwaliteit van de schepen is ontworpen voor een groot deel bepaald door de kwaliteit van de SMC&#39;s gebruikt in de weefselkweek. De kritische aspecten van het SMC fenotype zijn contractiele morfologie, lage passage nummer, en de mogelijkheid om woekeren in de bioreactor. Wij bevelen aan dat de passage aantal niet groter is dan P3 op het moment van de cel zaaien op het polymeer schavot. Bovendien is het cruciaal om te bevestigen dat de SMC bronnen voor mycoplasma gratis te gebruiken. We hebben geconstateerd dat mycop...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van de Reagens / Materiaal </th><th> Leverancier </th><th> Catalogus Nummer </th></tr><tr><td> FBS (Foetaal Bovine Serum) hitte-geïnactiveerd </td><td> Hyclone </td><td> SH30071 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> rhFGF-basic </td><td> R &amp; B </td><td> 234-FSE </td></tr><tr><td> rrPDGF-BB </td><td> R &amp; B </td><td> 520-BB </td></tr><tr><td> Penicilin G </td><td> Sigma </td><td> PENNA </td></tr><tr><td> Koper (II) sulfaat </td><td> Sigma </td><td> C8027 </td></tr><tr><td> Gylcine </td><td> Sigma </td><td> C8790 </td></tr><tr><td> L-Alanine </td><td> Sigma </td><td> A7469-25G </td></tr><tr><td> L-Proline </td><td> Sigma </td><td> P5607-25G </td></tr><tr><td> Ascorbinezuur </td><td> Sigma </td><td> A4544-25G </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375-100G </td></tr><tr><td> Silicone Stopper </td><td> Cole-Parmer </td><td> 06298-24 </td></tr><tr><td> Masterflex buizen L / S </td><td> Cole-Parmer </td><td> 06508-16, 06508-18 </td></tr><tr><td> Masterflex pomp </td><td> Cole-Parmer </td><td> 7553-80 </td></tr><tr><td> Dacron manchet </td><td> Maquet </td><td> 174406 </td></tr><tr><td> PGA voelde </td><td> Concordia </td><td> MO000877-01 </td></tr><tr><td> 4-0 1.5 metrische Surgipro II hechtdraad </td><td> Syneture </td><td> VP-557-X </td></tr><tr><td> 6-0 0.7 metrische Dexon hechtdraad </td><td> Syneture </td><td> 7538-11 </td></tr><tr><td> 0.22μm PTFE filters </td><td> Whatman papier </td><td> 6780-2502 </td></tr><tr><td> Three Way Stop-haan </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> 593WSC </td></tr><tr><td> Drukopnemer </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> PX212 </td></tr><tr><td> IV tassen </td><td> Baxter </td><td> R4R2110 </td></tr><tr><td> Saline verdunning set </td><td> Pijl </td><td> W20030 </td></tr><tr><td> Silicone </td><td> Saint-Gobain </td><td> F05027 </td></tr></tbody></table>

techniek biologisch-based vaattransplantaten met behulp van een pulsatiele bioreactor

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Veel aandacht is besteed aan de ontwikkeling en vooruitgang van de methodologie te regenereren functionele kleine diameter arteriële omzeilt. In de fysiologische omgeving, zijn zowel mechanische en chemische prikkeling noodzakelijk om de goede ontwikkeling en functionaliteit van de arteriële vaten 1,2 te houden. Bioreactor cultuur systemen ontwikkeld door onze groep zijn ontworpen om schepen regeneratie te ondersteunen binnen een nauwkeurig gecontroleerde chemo-mechanische omgeving nabootsen die van autochtone schepen. Onze bioreactor montage en onderhoud van de procedures zijn vrij eenvoudig en zeer herhaalbare 3,4. Gladde spiercellen (SMC) zijn gezaaid op een buisvormige polyglycolzuur (PGA), mesh, dat is voorzien van schroefdraad meer dan voldoet silicone en gekweekt in de bioreactor, met of zonder pulserende stimulatie voor maximaal 12 weken. Er zijn vier belangrijke attributen die onze bioreactor onderscheiden van een aantal voorgangers. 1) In tegenstelling tot andere cultuur systemen die alleen simuleren de biochemische omgeving van inheemse bloedvaten, onze bioreactor creëert ook een fysiologische pulserende omgeving door het toepassen van cyclische radiale belasting om de schepen in de cultuur. 2) Meerdere ontworpen schepen tegelijk worden gekweekt onder verschillende mechanische voorwaarden binnen een gecontroleerde chemische omgeving. 3) De bioreactor kan een mono-laag van endotheelcellen (EC) om eenvoudig worden bekleed op de luminale kant van de ontworpen schepen voor dierlijke implantatie modellen. 4) Onze bioreactor kan ook de cultuur ontworpen schepen met verschillende diameter grootte varieerden van 1 mm tot 3 mm, het opslaan van de inspanning om op maat elk individu bioreactor naar een specifieke diameter past. De kunstmatige schepen gekweekt in onze bioreactor lijken inheemse bloedvaten histologisch tot op zekere hoogte. Cellen in de vaatwanden uitdrukkelijke volwassen SMC contractiele merkers zoals het gladde spierweefsel myosine zware keten (SMMHC) 3. Een aanzienlijke hoeveelheid collageen wordt afgezet binnen de extracellulaire matrix, die verantwoordelijk is voor de ultieme mechanische sterkte van de kunstmatige schepen 5. Biochemische analyse geeft ook aan dat collageen van gemanipuleerde schepen is vergelijkbaar met die van autochtone slagaders 6. Belangrijk is de pulserende bioreactor consequent geregenereerd schepen dat de mechanische eigenschappen die succesvolle implantatie experimenten mogelijk te maken in diermodellen 3,7 vertonen. Bovendien kan deze bioreactor verder worden aangepast om real-time de beoordeling en het bijhouden van collageen remodeling na verloop van tijd, niet-invasieve manier, met behulp van een niet-lineaire optische microscopie (NLOM) 8 mogelijk te maken. Tot slot moet dit bioreactor dienen als een uitstekend platform om de fundamentele mechanismen die de regeneratie van functionele kleine diameter vaattransplantaten reguleren te bestuderen.

Onze groep heeft een bioreactor cultuur systeem dat bootst de fysiologische pulserende stress van het cardiovasculaire systeem te regenereren implanteerbare kleine diameter vaattransplantaten.

Techniek Biologisch-Based vaattransplantaten Met behulp van een Pulsatiele Bioreactor

Er is veel inspanning geleverd om de methodologie voor het regenereren van functionele arteriele bypasses met een kleine diameter te ontwikkelen en te verbeteren. In de fysiologische ...

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van biologisch gebaseerde vasculaire grafts met behulp van een pulserend bioreactorsysteem. Dit wordt bereikt door een biologisch afbreekbare scaffold te vervaardigen van een PGA-gaas waarop de cellen zullen groeien, en deze vervolgens te plaatsen in een bioreactorchamber. De scaffolds worden daarna bezaaid met gladde spiercellen, waarna de bioreactorchamber wordt afgesloten met een deksel voorzien van lucht- en voedingsbuissegels.De bioreactor wordt vervolgens aangesloten op een flowsysteem om een pulserende stroom te leveren aan de vaten in de bioreactor. In de reactor groeien de cellen uit tot vaten die immunochemische, biochemische en mechanische tests doorstaan. De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie van coronaire hartziekten, omdat deze techniek een veelbelovende benadering is voor het regenereren van implanteerbare vasculaire grafts met een kleine diameter voor arteriële bypass.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in vasculaire engineering, kan ze worden toegepast op andere organsystemen die onderhevig zijn aan cyclische fysiologische krachten. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn aan deze methode er moeite mee hebben. Er is veel oefening nodig om de vaardigheden volledig onder de knie te krijgen.We kregen voor het eerst het idee voor deze aanpak toen we ons realiseerden hoe belangrijk het is om fysiologische mechanische stimulatie toe te passen bij het regenereren van engineered constructen. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de processen in de bioreactor moeilijk aan te leren zijn vanwege de vele stappen en alleen via een gedetailleerde demonstratie kunnen worden aangeleerd. Begin met het reinigen van secties van 30 centimeter lange siliconen slang met een binnendiameter van drie millimeter met gedestilleerd water en laat deze aan de lucht drogen.Gebruik een schaar om voor elk stuk buisje een sectie PGA-gaas van 1,1 centimeter bij acht centimeter uit te knippen. Gebruik een hemostat om het PGA-gaas met Dexon 6.0 hechtdraad aan het buisje te bevestigen door drie chirurgische knopen te leggen, gevolgd door enkele steken met de hemostat; het vastgezette gaas vormt een PGA-steiger. Was de steigers door ze eerst één tot twee minuten in één molar natriumhydroxide te dopen, gevolgd door drie spoelingen in gedestilleerd water van twee minuten per spoeling. Dep ze tussen de wasbeurten droog en laat ze na de derde wasbeurt 15 minuten aan de lucht drogen in een zuurkast.Zodra deze droog zijn, hecht u met drie steken Dacron-manchetten van één centimeter op elk uiteinde van het gaas. Laat een overlap van twee tot drie millimeter van de buis over en prik niet door de buis heen. Zorg ervoor dat u ongeveer 15 centimeter vrije hechtdraad overlaat voor later gebruik in dit protocol.Alle bioreactorcomponenten en instrumenten worden vooraf geautoclaveerd. De dag voordat de bioreactorkweek wordt gestart, moet de bioreactor gedeeltelijk worden geassembleerd; dompel de bioreactorcomponenten, de scaffolds, het gaas, de siliconen slang, de chirurgische instrumenten en een dunne draad die langer is dan de lengte van de bioreactor gedurende ten minste 30 minuten onder in een bad met 70% ethanol. Gebruik de draad om de siliconen slang door de zijarmen van de reactor te trekken.Haal nu de bioreactor naar buiten en bevestig de PGA-steigers binnenin door de Dacron-manchetten over de uitlopende glazen randen vast te zetten. Gebruik het overtollige hechtmateriaal om elke manchet vast te knopen. Sluit vervolgens, met behulp van connectoren, de siliconen slang aan één zijde van de steiger aan op één paar bioreactorarmen en sluit de slang aan de andere zijde van de steiger aan op de andere twee armen.Wanneer de connectoren zijn geïnstalleerd, trekt u deze uit de zijarmen en spoelt u de bioreactor uit met ethanol. Laat de reactor aan elke zijde 10 minuten weken. Plaats de bioreactor op enkele Petrischalen en spoel deze uit met weefselkweekmedium.Spoel het water af. Gebruik een pipet en zorg ervoor dat ook het gaas en de slang worden doorgespoeld. Plaats nu een steriele roerstaf in de reactor voor toekomstig gebruik en droog de apparatus gedurende de nacht in de zuurkast met de ventilator aan en de UV-lamp vanaf dit punt uitgeschakeld.Leun niet over de reactor, omdat dit tot contaminatie kan leiden. Tijdens de installatie moeten alle connectoren met alcohol worden schoongemaakt. Voordat de koppelingen worden gemaakt, worden veel van de verbindingen versterkt met paraform, dat voor gebruik in 70% ethanol moet worden geweekt. Zorg dus voor voldoende voorraden van beide middelen.Plaats ter preventie een steriele Petrischaal over elke opening van de bioreactor om het PGA-steunstructuur binnenin te beschermen tegen contaminanten. Begin nu met de installatie door de injectiepoort aan de derde ongebruikte arm van de bioreactor te bevestigen. Sluit vervolgens de IV-zak aan op het flowsysteem.Knoop bij de walrus-slangenkit het blauwe uiteinde zo dicht mogelijk bij de Y-splitsing af en klem de slang. Bevestig de rode slang aan het verre uiteinde van de IV-zak. Bevestig vervolgens de witte slang aan één zijde van het flowsysteem.Plaats een driewegkraan in het stroomsysteem. Bevestig één uiteinde van de slang van de druktransducer aan de driewegkraan en bevestig het andere uiteinde aan de middelste opening van de infuuszak. Voeg nu 350 milliliters PBS en 1% fungi zone toe aan de infuuszak om het stroomsysteem gedeeltelijk te vullen en te controleren op lekken.Gebruik een spuit van 60 milliliter vóór of na het aansluiten van de zak op het stroomsysteem; stel de stopkraan in om de stroomrichting van de PBS te regelen en knijp in de zak om het systeem door te spoelen. Deze stap kan zowel vóór als na het plaatsen van de cellen worden uitgevoerd. De cellen kunnen nu in de bioreactor worden geplaatst.Resuspendeer in dit voorbeeld 8 miljoen SM-cellen, wat overeenkomt met ongeveer één confluente T 75, in 1,25 milliliter medium en druppel deze gelijkmatig op het PGA-steigerwerk, van Dacron-verbinding tot Dacron-verbinding. Maak na toevoeging van de cellen de rand van de bioreactor schoon met alcohol. Vermijd het vooroverbuigen boven de reactor.Zet vervolgens het siliconen stopdeksel zorgvuldig in elkaar. Zorg ervoor dat de onderkant van het deksel niet wordt blootgesteld bij het uitnemen uit de autoclaafzak of tijdens de volgende bevestigingsstappen. Bevestig eerst de injectiepoort aan de voedingsslang bij de mannelijke connector.Ten tweede, bevestig PTFE 0,20 micron filters aan elk van de drie luchtopeningen. Ten derde, sluit de injectiepoort af met folie. Plaats het geassembleerde siliconen stop-deksel in de glazen bioreactor.Zorg ervoor dat de voedingsbuis de geplaatste PGA-scaffolds niet raakt. Seal vervolgens met parafilm. Sluit nu de bioreactor aan op het flowsysteem en plaats de bioreactor en het flowsysteem in een incubator van 37 °C.Gedurende 25 tot 30 minuten moet de reactor op zijn zijkant worden geplaatst en elke vijf minuten worden gedraaid. Vul vervolgens, terwijl de reactor nog in de incubator staat, de bioreactorkamer met 400 milliliters vier tot 10 cultuurmedium met behulp van een pomp via een toevoerslang. Incubeer de gezaaide scaffolds nu zonder pulserende pomping gedurende zes tot zeven dagen bij 37 °C met 5% koolstofdioxide.Er is geen mediumverversing of vitamine C-suppletie nodig gedurende deze tijd. Controleer vóór het inschakelen van de pomp de slang op lekken of knikken. Stel vervolgens de snelheid van de pomp zo in dat een drukbereik tussen -30 en 270 mmHg wordt gehandhaafd. Controleer en handhaaf deze druk dagelijks gedurende de gehele kweekperiode.Mediumverversingen en suppletie van ascorbinezuur moeten tweemaal per week worden uitgevoerd terwijl het steigerwerk groeit met pulserende pomping om eerst vers medium toe te dienen; bevestig hiervoor de injectiepoort en het PTFE-filter op de voedingsdeksels voor zowel de mediumverversing als de afvoer van afvalmedium. Plaats vervolgens de voedingsslang stevig in de bidirectionele pomp en steek het ene uiteinde in de voedingspoort van de bioreactor en het andere uiteinde in het voedingsdeksel. Begin nu langzaam met het uitpompen van 200 milliliters medium.De pompsnelheid kan geleidelijk worden verhoogd. Bevestig vervolgens een nieuwe toevoerbuis en begin langzaam met het pompen van 200 milliliters vers medium. Om ascorbinezuur aan de reactor toe te voegen, verwijdert u 25 milliliters medium met een steriele 30 milliliters spuit.Voeg vijf milliliter steriele ascorbinezuuroplossing toe en vul vervolgens de 25 milliliter aan. De gekweekte vaten zullen opaak lijken en een wanddikte van ongeveer 250 microns bereiken na acht weken cultuur. Onder pulserende omstandigheden laat hematoxyline, eosine-kleuring van de gekweekte vaten weefselmorfologische veranderingen zien over de tijd en door het pulseren.De luminale zijde van de vaten is aangegeven met een L; een Masson's trichroomkleuring. Voor collageen laat dit zien dat het vier weken gepulseerde vat meer collageen heeft dan het niet-gepulseerde tegenhangertje; witte pijlen wijzen naar resterende PGA-fragmenten in de vaten na 12 weken. Immunochemische analyse toont de expressie van de vroege gladde spier marker alfa-actine, de intermediaire gladde spier marker calponine 1 en de late gladde spier marker myosin heavy chain. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in zeven tot acht uur worden uitgevoerd indien deze correct wordt uitgevoerd.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alles zo schoon en steriel mogelijk uit te voeren volgens dit protocol. Andere methoden, zoals modificatie van het lumen van de gekweekte vaten, kunnen worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het belang van luminale oppervlaktemodificatie voor het behoud van gekweekte vaten tijdens in vivo studies na hun ontwikkeling.Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van tissue engineering, in het bijzonder vasculaire engineering, om potentiële methoden te onderzoeken voor de behandeling van coronaire arterieziekten in diermodellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe implanteerbare engineered vasculaire grafts kunnen worden gerealiseerd via een dynamische post-cultuur. Vergeet niet dat het werken met natriumhydroxide gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals oogbescherming en een laboratoriumjas, altijd moeten worden betracht bij het uitvoeren van deze procedure.

engineering-biological-based-vascular-grafts-using-pulsatile

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Elastomeer PGS steigers met vasculaire gladde spiercellen gekweekt in een pulsatiele flow bioreactor kan leiden tot veelbelovende kleine diameter arteriële constructen met inheemse ECM productie in een relatief korte periode van cultuur.

Elastomeer PGS Steigers in Arterial Tissue Engineering

Een stap-voor-stap protocol voor de inter-positionele plaatsing van weefselengineering Vessels (Tevs) in de halsslagader van een schaap met end-to-end anastomose en real-time digitale evaluatie in vivo tot dierenoffers.

Chirurgische techniek voor de inplanting van Tissue Engineered vaattransplantaten en de daaropvolgende<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoring

Hier presenteren we een protocol om tissue engineered vaartuig enten die functioneel zijn voor het enten in muizen door dubbel zaaien gedeeltelijk geïnduceerde pluripotente stamcellen genereren (PiPSC) - afgeleide gladde spiercellen en PiPSC - afgeleide endotheelcellen op een gedecellulariseerde schip steiger bioreactor.

Generatie en enten van-Weefselmanipulatieproducten Schepen in een muismodel

In dit werk presenteren we een techniek voor de snelle fabricage van levend vasculair weefsel door directe cultivatie van collageen, gladde spiercellen en endotheelcellen. Daarnaast wordt een nieuw protocol beschreven voor de mechanische karakterisering van gefabriceerd vasculair weefsel.

Engineering 3D Cellularized Collageen Gel voor Vasculaire Tissue Regeneration

Dit is een richtlijn voor het construeren van in vivo vasculair weefsel met behulp van een microchirurgische arterioveneuze lus of een doorstromende pedikkelconfiguratie binnen een weefselengineeringkamer. De gegenereerde vasculaire weefsels kunnen worden gebruikt voor orgaanregeneratie en vervanging van weefselderven, evenals voor medicijntesten en ziektemodellering.

Tissue Engineering door Intrinsic Vascularisatie in een<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Engineering Chamber

Schaalbare engineered bloedvaten zou de klinische toepasbaarheid te verbeteren. Gebruik gemakkelijk aanzienlijke 3D gedrukte geleiders, ringen van vasculaire gladde spieren zijn gemaakt en gestapeld in een buisvormige vorm, die een vasculair transplantaat. Enten kan worden aangepast aan de reeks van menselijke kransslagader afmetingen voldoen door eenvoudig de 3D gedrukte handleiding te wijzigen.

Het schalen van Engineered Vascular Enten Met behulp van 3D-Gedrukt Gidsen en de Ring Stapelen Method

Wij bieden een veralgemeende protocol gebaseerd op een strategie van de bioprinting microfluidic voor een vezelige vasculaire bed, waar een secundaire celtype verder zou kunnen worden uitgezaaid in de interstitiële ruimte van deze vezelige structuur voor het genereren van gevacuoliseerd weefsels en organoids engineering.

Microfluidic Bioprinting voor Engineering gevacuoliseerd weefsels en Organoids

We beschrijven een in-house ontworpen in vitro flow kamer model, waardoor het onderzoek naar bacteriële aanhankelijkheid aan het enten van de weefsels.

Een In Vitro Model van een Parallel-plaat perfusie-systeem te bestuderen van de naleving van de bacteriële om te enten van weefsels

Het doel van dit protocol is om een dynamische co-cultuur van menselijke macrofagen en myofibroblasten in buisvormige elektrospunsteigers uit te voeren om materiaalgestuurde weefselregeneratie te onderzoeken, met behulp van een bioreactor die het ontkoppelen van schuifspanning en cyclische rek mogelijk maakt.

Een multi-cue bioreactor om de inflammatoire en regeneratieve capaciteit van biomaterialen onder flow en stretch te evalueren

Dit protocol presenteert de opzet en werking van een nieuw ontwikkelde, 3D-geprinte bioreactor voor de ex vivo kweek van bloedvaten in perfusie. Het systeem is ontworpen om gemakkelijk door andere gebruikers te worden overgenomen, praktisch, betaalbaar en aanpasbaar aan verschillende experimentele toepassingen, zoals basisbiologie en farmacologische studies.

Ex Vivo Perfusiecultuur van grote bloedvaten in een 3D-geprinte bioreactor

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implantatie van een weefselgemanipuleerd vasculair transplantaat in de halsslagader van de muis met behulp van de manchettechniek, waardoor een geschikt diermodel wordt geboden voor het onderzoeken van mechanismen voor de regeneratie van vasculair weefsel.

Implantatie van weefselgemanipuleerd vasculair transplantaat in de halsslagader van muizen via manchettechniek

Leer biologische vaattransplantaten ontwikkelen met een pulsatiele bioreactor voor cardiovasculaire toepassingen. Deze methode gebruikt PGA-scaffolds en gladde spiercellen om implantaten te creëren voor arteriële bypasschirurgie.

Techniek Biologisch-Based vaattransplantaten Met behulp van een Pulsatiele Bioreactor

Meer video's verkennen