Techniek Biologisch-Based vaattransplantaten Met behulp van een Pulsatiele Bioreactor

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van biologische vasculaire grafts met behulp van een pulsatiel bioreactorsysteem. Dit wordt bereikt door een biologisch afbreekbaar steunstructuur (scaffold) voor te bereiden van PGA-gaas waarin de cellen zullen groeien en deze vervolgens te monteren in een bioreactorchamber. De scaffolds worden vervolgens beplant met gladde spiercellen en een deksel met lucht- en voedingsslangen sluit de bioreactorchamber af.

De bioreactor wordt vervolgens aangesloten op een flowsysteem om een pulserende stroming te voorzien aan de vaten in de bioreactor. In de reactor groeien de cellen uit tot vaten die immunochemische, biochemische en mechanische tests doorstaan. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van coronaire hartziekten, aangezien deze techniek een veelbelovende benadering is voor het regenereren van implanteerbare vaatprothesen met een kleine diameter voor arteriële bypass.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in vasculaire engineering, kan deze ook worden toegepast op andere orgaansystemen die worden blootgesteld aan cyclische fysiologische krachten. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben. Er is veel oefening nodig om de vaardigheden volledig onder de knie te krijgen.

We kregen voor het eerst het idee voor deze aanpak toen we ons realiseerden hoe belangrijk het is om fysiologische mechanische stimulatie toe te passen voor het regenereren van engineered constructen. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de processen in de bioreactor moeilijk aan te leren zijn vanwege de vele stappen en alleen via een gedetailleerde demonstratie kunnen worden aangeleerd. Begin met het reinigen van secties van 30 centimeter lange siliconen slang met een binnendiameter van drie millimeter met gedestilleerd water en laat deze aan de lucht drogen.

Gebruik een schaar om voor elk stuk buisjes een sectie PGA-gaas van 1,1 centimeter bij acht centimeter uit te snijden. Bevestig met behulp van een hemostat het PGA-gaas aan de buisjes met Dexon 6.0 hechtdraad door drie chirurgische knopen te leggen, gevolgd door enkele steken met de hemostat; het vastgezette gaas vormt een PGA-steiger. Was de steigers door ze eerst één tot twee minuten in één molar natriumhydroxide te dopen, gevolgd door drie dips in gedestilleerd water gedurende twee minuten per dip. Dep ze droog tussen de wasbeurten door en laat ze na de derde wasbeurt 15 minuten aan de lucht drogen in een zuurkast.

Zodra deze droog zijn, hecht u aan beide uiteinden van het gaas Dacron-manchetten van één centimeter met drie hechtingen. Laat een overlap van twee tot drie millimeter van de buis over en prik niet door de buis heen. Zorg ervoor dat u ongeveer 15 centimeter vrije hechtdraad overlaat voor later gebruik in dit protocol.

Alle bioreactorcomponenten en instrumenten worden vooraf geautoclaveerd. De dag voordat de bioreactorcultuur wordt gestart, moet de bioreactor gedeeltelijk worden geassembleerd. Dompel de bioreactorcomponenten, de scaffolds, de mesh, de siliconenslangen, de chirurgische instrumenten en een dunne draad die langer is dan de lengte van de bioreactor gedurende ten minste 30 minuten onder in een bad met 70% ethanol. Gebruik de draad om de siliconenslangen door de zijarmen van de reactor te trekken.

Haal nu de bioreactor naar buiten en bevestig de PGA-scaffolds binnenin door de Dacron-manchetten over de uitlopende glazen randen vast te zetten. Gebruik de overtollige hechtdraad om elke manchet vast te knopen. Bevestig vervolgens, met behulp van connectoren, de siliconenslang aan één zijde van de scaffold aan één paar bioreactorarmen en bevestig de slang aan de andere zijde van de scaffold aan de andere twee armen.

Wanneer de connectoren zijn geïnstalleerd, trekt u deze uit de zijarmen en spoelt u de bioreactor uit met ethanol. Laat de reactor aan weerszijden 10 minuten weken. Plaats de bioreactor op enkele Petrischalen en spoel deze uit met weefselkweekmedium.

Spoel het water door. Zorg er met een pipet voor dat ook het gaas en de slang worden doorgespoeld. Plaats nu een steriele roerstang in de reactor voor toekomstig gebruik en droog de apparatuur gedurende de nacht in de zuurkast met de blower aan en de UV-lamp vanaf dit moment uit.

Leun niet over de reactor, omdat dit kan leiden tot contaminatie. Tijdens de installatie moeten alle connectoren met alcohol worden schoongeveegd. Voordat de verbindingen worden gemaakt, worden veel van de koppelingen versterkt met parafilm, die voor gebruik in 70% ethanol moet worden geweekt. Zorg er dus voor dat er voldoende van beide aanwezig is.

Plaats ter preventie een steriele Petrischaal over elke opening van de bioreactor om het PGA-steunstructuur binnenin te beschermen tegen contaminanten. Begin nu met de opstelling door de injectiepoort aan de derde ongebruikte arm van de bioreactor te bevestigen. Sluit vervolgens de IV-zak aan op het flowsysteem.

Knoop bij de walrus-slangset het blauwe uiteinde zo dicht mogelijk bij de Y-verbinding af en klem de slang. Bevestig de rode slang aan het verre uiteinde van de infuuszak. Bevestig vervolgens de witte slang aan één zijde van het stroomsysteem.

Plaats een driewegkraan in het stroomsysteem. Bevestig het ene uiteinde van de slang van de druktransducer aan de kraan en het andere uiteinde aan de middelste opening van de infuuszak. Voeg nu 350 milliliters PBS en 1% fungi zone toe aan de infuuszak om het stroomsysteem gedeeltelijk te vullen en op lekken te controleren.

Gebruik een spuit van 60 milliliter vóór of na het aansluiten op het flowsysteem, stel de stopkraan in om de stroomrichting van PBS te regelen en knijp in de zak om het systeem door te spoelen. Deze stap kan zowel vóór als na het positioneren van de cellen worden uitgevoerd. Nu kunnen de cellen in de bioreactor worden geplaatst.

Resuspendeer in dit voorbeeld 8 miljoen SM-cellen, wat ongeveer gelijkstaat aan één confluente T 75, in 1,25 milliliter medium en druppel deze gelijkmatig op het PGA-steunstructuur van Dacron-verbinding naar Dacron-verbinding. Veeg na het toevoegen van de cellen de rand van de bioreactor schoon met alcohol. Vermijd het vooroverleunen boven de reactor.

Assemble vervolgens voorzichtig het siliconen stopdeksel. Zorg ervoor dat de onderkant van het deksel niet wordt blootgesteld bij het verwijderen uit de autoclaafzak of tijdens de volgende bevestigingsstappen. Bevestig eerst de injectiepoort aan de voedingsslang bij de mannelijke connector.

Ten tweede, bevestig PTFE 0,20 micron filters aan elk van de drie aansluitingen. Ten derde, verzegel de injectiepoort met folie. Plaats het gemonteerde siliconen stopdeksel in de glazen bioreactor.

Zorg ervoor dat de voedingsslang de geplaatste PGA-scaffolds niet raakt. Seal vervolgens met parafilm. Sluit nu de bioreactor aan op het flowsysteem en plaats de bioreactor en het flowsysteem in een incubator van 37 °C.

Gedurende 25 tot 30 minuten moet de reactor op zijn zijkant worden geplaatst en elke vijf minuten worden gedraaid. Vul vervolgens, terwijl deze nog in de incubator staat, de bioreactorkamer met 400 milliliters van de four to 10 kweekmedia met behulp van een pomp via een toevoerslang. Incubeer nu de gezaaide scaffolds gedurende zes tot zeven dagen bij 37 °C met 5% carbon dioxide, zonder pulserende pomping.

Het is niet nodig om het medium te vervangen of vitamine C toe te voegen; controleer gedurende deze tijd, voordat de pomp wordt ingeschakeld, de slang op lekken of knikken. Pas vervolgens de pumpsnelheid aan om een drukbereik tussen -30 en 270 millimeter kwik te handhaven. Controleer en handhaaf deze druk dagelijks gedurende de gehele kweekperiode.

Mediumverversingen en supplementatie van ascorbinezuur moeten twee keer per week worden uitgevoerd terwijl het scaffold groeit met pulserende pomping om eerst vers medium toe te dienen; bevestig hiervoor de injectiepoort en het PTFE-filter op de voedingsdeksels voor zowel de mediumverversing als de afvoer van het afvalmedium. Plaats vervolgens de voedingsslang stevig in de bidirectionele pomp en steek het ene uiteinde in de voedingspoort van de bioreactor en het andere uiteinde in het voedingsdeksel. Begin nu langzaam met het wegpompen van 200 milliliters medium.

De pompsnelheid kan geleidelijk worden verhoogd. Bevestig vervolgens een nieuwe toevoerslang en begin langzaam met het pompen van 200 milliliters vers medium. Om ascorbinezuur aan de reactor toe te voegen, verwijdert u 25 milliliters medium met een steriele spuit van 30 milliliters.

Voeg vijf milliliter steriele ascorbinezuuroplossing toe en vul vervolgens de 25 milliliter aan. De gekweekte vaten zullen ondoorzichtig worden en na acht weken cultuur een wanddikte van ongeveer 250 microns bereiken. Onder pulserende omstandigheden laat hematoxyline- en eosinekleuring van de gekweekte vaten zien dat de weefselmorfologie verandert over tijd en door de pulsatie.

De luminale zijde van de vaten is aangegeven met een L bij een Masson's trichroomkleuring. Voor collageen blijkt dat het vier weken gepulseerde vat meer collageen heeft dan het niet-gepulseerde tegenhanger; witte pijlen wijzen op resterende PGA-fragmenten in de vaten na 12 weken. Immunochemische analyse toont de expressie van de vroege gladdespiemarker alpha-actine, de intermediaire gladdespiemarker calponine 1 en de late gladdespiemarker myosin heavy chain. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in zeven tot acht uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken alles zo schoon en steriel mogelijk uit te voeren volgens dit protocol. Andere methoden, zoals modificatie van het lumen van de gemanipuleerde vaten, kunnen worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het belang van luminale oppervlaktemodificatie bij het behoud van gemanipuleerde vaten tijdens in vivo studies na de ontwikkeling ervan.

Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van tissue engineering, en met name vasculaire engineering, om potentiële methoden te verkennen voor de behandeling van coronaire hartziekten in diermodellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe implanteerbare engineered vasculaire grafts kunnen worden gerealiseerd via een dynamische post-culture. Vergeet niet dat het werken met natriumhydroxide gevaarlijk kan zijn; voorzorgsmaatregelen zoals oogbescherming en een laboratoriumjas moeten altijd worden gebruikt bij het uitvoeren van deze procedure.