Name: Dissection en 2-Photon Imaging van perifere lymfeklieren in Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 48 s
Description: Leer de dissectie en 2-foton imaging van perifere lymfeklieren bij muizen. Deze methode toont adoptieve overdracht van T-cellen en visualiseert CD4+ T-celmotiliteit voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Rebecca Paquette bedanken voor hulp bij het reagens voorbereiding. MPM wordt ondersteund door een Ruth L. Kirchstein predoctorale beurs van de National Institutes of Health en de ondersteuning uit subsidies GM-41514 (MDC), NS-48252 (KGC), GM-48.071 (IP) ook van de National Institutes of Health.

1. Adoptieve overdracht van cellen: Staartader of intra-oculaire injectie zijn beide geschikte methoden voor de invoering van de cel tracker-gemerkte of fluorescerend eiwit tot expressie lymfocyten. In deze video. laten we zien adoptieve overdracht van cellen door staartader injectie. a. Materialen CD4 + T-cellen zijn voorzien van de 1,4 uM CFSE gedurende 30 minuten bij 37 º C, twee keer gewassen, en opnieuw gesuspendeerd in 100 ul RPMI-1640. Cellen worden geladen in een steriele 28 meter insuline spuit voor injectie. Het aantal gebruikte cellen hangt af van het experiment wordt gedaan. Typisch, 5 miljoen T-cellen zijn voldoende voor een eenvoudige T-cel visualisatie. Een knaagdier weerhouder voor de muis is nodig om letsel te voorkomen om het dier en voor jezelf. b. Beveiliging van het dier De muis is beveiligd voor adoptieve overdracht door het langzaam steun van de dieren in de knaagdier restrainer (zie video) en sluiten van het open uiteinde van de buis door zachtjes indrukken van de zuiger. Niet loslaten van de muis staart tijdens dit proces, aangezien sommige kleinere dieren kunnen omdraaien in de restrainer. Deze methode voorkomt dat het dier verwonden zichzelf en van bewegen tijdens de injectie. Bij het opstellen van het knaagdier restrainer, niet duw de zuiger verder dan nodig is om het dier te houden van het springen naar voren. Ook moet je niet duwen de zuiger tegen het dier, en niet achter het dier in de weerhouder voor een langere periode van tijd. c. Het visualiseren van de staartader Trek de staart naar je toe, zodat het licht is gewikkeld over je wijsvinger en hield tegen de binnenkant van de vinger door je duim. Identificeer de staart aderen zich aan weerszijden van de rechtopstaande staart. Visualisatie wordt vergemakkelijkt door opwarming van de staart met warm water, vervolgens af te vegen naar beneden met ethanol. d. Injectie van cellen Als de ader is gevonden, plaatst u de spuit met schuine zijde naar boven in een ondiepe hoek parallel aan de ader. Eenmaal in de ader, zachtjes op de zuiger, als je in de ader mag er geen weerstand tegen de injectie. Als u weerstand, verwijder de spuit en probeer het opnieuw op een andere locatie. Als je in de ader, langzaam op de zuiger totdat de injectie is voltooid. De staart mag niet uitgezet worden tijdens de injectie. Als dat zo is, zou dit betekenen dat de naald niet in de ader. Het is mogelijk om &quot;verliezen&quot; de ader tijdens de injectie. Als dit gebeurt, verwijder de naald en probeer uw injectie op een andere plek. Als u meer dan een injectie proberen, is het het beste om de staart omhoog naar het lichaam van de muis van de oorspronkelijke plaats van de injectie. Plan vooruit voor deze mogelijkheid door te beginnen distaal op de staart te geven uzelf de ruimte voor een andere poging om de adoptieve overdracht. e. Post-injectie overwegingen Na de injectie is voltooid, wordt een kleine back-stroom van bloed uit de ader optreden. Druk de injectieplaats met een schone vegen totdat het bloeden stopt. Verwijder de zuiger en laat het dier naar voren lopen, uit de restrainer, terwijl het zachtjes vasthouden aan het staart. Controleer altijd met uw dier zorg commissie en het gebruik van dieren protocollen om ervoor te zorgen je bent in overeenstemming zijn. Het is belangrijk om deze techniek oefenen een paar keer voordat je probeert de echte experiment. 2. Lymfeklier Isolatie Isolatie van de lymfeklieren voor twee photon imaging vereist een zorgvuldige verwijdering van de juiste lymfeklier van het omringende weefsel. a. Selectie en locatie van perifere lymfeklieren Selectie van de lymfeklieren voor de beeldvorming zal afhangen van de experimentele doelen. Wees je bewust van lokale infectie of een injectie-drainerende lymfeklieren, en selecteer de juiste knooppunt voor de beeldvorming. Het artikel van Van den Broeck et al.., Beschrijft de locatie en de morfologie van muizen lymfeklieren in detail 3. In deze video, tonen we de excisie van de zes grote perifere lymfeklieren die geschikt zijn voor cel-isolatie of imaging. b. Lymfeklier verwijdering: Houd rekening met de integriteit van het weefsel tijdens het verwijderen van de lymfeklieren. Wees niet te scheuren van de capsule of op enigerlei wijze schade aan de lymfeklier structuur. Verlies van lymfeklier structurele integriteit zal afbreuk doen aan de experiment. Verwijder indien nodig vet van de lymfeklier oppervlak met fijne ontleden (# 5 Dumont) pincet onder een dissectie microscoop. Lymfeklieren mag geen achtergebleven vet op het oppervlak van het knooppunt, want dit zal beeldvorming verduisteren door verstrooiing het licht. Een goede excisie van de lymfeklieren is ook een belangrijke techniek om te oefenen voordat de eerste echte experiment. 3. Lymfe Node Imaging Setup en overwegingen De lymfeklier moet worden bevestigd aan de beeldvorming fase, die in dit geval bestaat uit een verzonken kamer. Opgewarmd, zuurstof-doorbloed media is gepompt in de kamer van de ene kant met behulp van een peristaltische pomp en inline verwarming, en het wordt uitgevoerd via een neerwaartse-gegradeerde kanaal in een kamer met het verzamelen van een vacuüm buis om een ​​inzameling van afval kolf. In ons systeem wordt de lymfeklier ondergedompeld in 37 ° C media en super-geperfuseerd met medische kwaliteit carbogen (5% CO 2, 95% O 2). De temperatuur van de perfusie media moeten worden geregistreerd als dicht bij de lymfeklier als mogelijk is. Uw specifieke systeem kan verlangen variaties in de media debiet en scenografie aan de microscoop podium en het doel tegemoet te komen. a. Lymfeklier beeldvorming setup: Zoals te zien in de video, we veilig de lymfeklier door eerst vastmaken, medullaire-kant naar beneden (om de afbeelding T-of B-cel zones met behulp van een microscoop rechtop) op een plastic dekglaasje, gesneden om de juiste grootte. Het is belangrijk dat het gebruik van een niet-giftige lijm weefsel (we gebruiken VetBond ™ van 3M Corporation). Het dekglaasje wordt vastgezet in de stromende media door het plaatsen van een klein beetje siliconenvet op de onderkant van het deksel slip, dan is het naleven dit om de glazen voet van de imaging kamer. b. 2-Photon beeldvorming overwegingen: Verschillende factoren kunnen leiden tot lymfocyten om te stoppen met bewegen: temperatuur te hoog of te laag is, dan laservermogen, compressie of andere schade aan de lymfeklieren, en gebrek aan zuurstof. Schade als gevolg van overmatige laservermogen of temperaturen&gt; ~ 39 ° C is onomkeerbaar. Als cellen worden gedimd, is het meestal beter om verhoging van de detector te krijgen of de cel-labeling-protocol in plaats van een hoger laservermogen aan cellen te visualiseren. Optimalisatie van de etikettering of de expressie van fluorescerende eiwitten kan nodig zijn om de fluorescentie boven het niveau van achtergrond autofluorescentie te brengen. Met een redelijke winst en laser energie-instellingen, over een twee-log verschuiving van de fluorescentie boven de uitgangswaarde (gemeten met flowcytometrie) is redelijk voor cel-visualisatie. Met afstelbare twee-foton lasers, moet de golflengte wordt gebruikt voor excitatie worden iets minder dan het dubbele van de single-foton excitatie maximum van het fluorofoor in beeld wordt gebracht. In twee-foton experimenten met behulp van meer dan een etiket of fluorescerend eiwit kan het nodig zijn om te experimenteren met de excitatie golflengte gebruikt om de optimale instellingen voor beide labels te vinden. Twee-foton excitatie kan ook worden gebruikt om de afbeelding endogene collageen structuren door gebruik te maken van de intrinsieke blauwe tweede harmonische generatie. Tweede harmonische generatie (SHG) vindt plaats wanneer twee fotonen worden gecombineerd in een materiaal en stralen een enkel foton van tweemaal de frequentie van de oorspronkelijke fotonen. In weefsel, twee-foton excitatie treedt op wanneer de invallende laserlicht loodrecht staat op een sterk geordende eiwitstructuur zoals collageen. Praktische aspecten met betrekking tot twee-foton imaging werden besproken in de preview reviews 4, 5.

<ol><li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+Cell+Motility+and+Interaction+Dynamics+Imaged+by+Two-Photon+Microscopy+in+Lymphoid+Organs.+Annu+Rev+Immunol%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol.</a> Annu Rev Immunol. , (2008).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes%3A+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB%2FcAnNCrl+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+tissue+imaging%3A+seeing+the+immune+system+in+a+fresh+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light.</a> Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).</li>
<li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+the+immune+system%3A+progress%2C+pitfalls+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li>
</ol>

In deze video protocol laten we de procedures voor de adoptieve cel overdracht en lymfeklier isolatie en de voorbereiding die nodig zijn voor beeldvorming lymfocyten motiliteit in een perifere lymfeklier. Twee-foton beeldvorming heeft een aantal voordelen ten opzichte van confocale beeldvorming in beide geëxplanteerd weefsels (hier afgebeeld) en in intravitale preparaten. Met name het gebruik van infra-rood excitatie minimaliseert lichtverstrooiing en maakt voor het afbeelden van ~ 300 micrometer onder het kapsel van de lymfeklier en dieper in sommige weefsels 4. Bovendien is multi-foton excitatie beperkt tot het brandpunt van de doelstelling, het minimaliseren van foto&#39;s bleken en weefselbeschadiging buiten kant van het brandvlak. Zoals met elke nieuwe techniek, echter twee-foton imaging is geen wondermiddel en de beperkingen en mogelijke valkuilen moet in gedachten worden gehouden 5. Daarvan is de eis dat - met uitzondering van intrinsieke signalen zoals tweede-harmonische generatie door collageen-cellen van belang moet worden fluorescent gelabelde door extrinsieke probes of door expressie van fluorescerende eiwitten. De indruk wordt dus gewekt dat deze gelabelde cellen zwemmen in een zwarte leegte, en dat in werkelijkheid zijn ze ondergedompeld in, en de interactie met een complexe omgeving van structurele elementen en talloze andere niet-gemerkt, onzichtbaar cellen. In de zes jaar sinds de invoering van twee-foton beeldvorming te immunologie, is deze techniek mogelijk onderzoekers om al lang bestaande vraagstukken aan te pakken door rechtstreeks visualiseren in intacte levende weefsels processen, zoals cel-cel interacties, celbeweeglijkheid en lokalisatie, cellulaire signaalwegen en cytotoxische cel het doden van evenementen. Het veld heeft zich snel ontwikkeld dan de eerste fenomenologische beschrijvingen, en kwantitatieve analyses, samen met de computer modellering en simulatie beginnen nu te voelen hoe de schijnbaar chaotische bewegingen en cellulaire interacties binnen lymfeklieren leiden tot een efficiënte immuunrespons te maken. Deze vooruitgang is uitgebreid besproken in een recente publicatie 1, die bevat meer dan 100 papers beschrijven van de toepassing van twee-foton microscopie voor immunoimaging.

dissection en 2-photon imaging van perifere lymfeklieren in muizen

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Twee-foton beeldvorming is gebleken dat een elegante choreografie van beweeglijkheid en cellulaire interacties binnen de lymfeklier onder basale omstandigheden en aan het begin van een immuunrespons 1. Hier presenteren we methoden voor adoptieve overdracht van gelabelde T-cellen, isolatie van de lymfeklieren, en beeldvorming beweeglijkheid van de CD4 + T-cellen in de lymfeklier geëxplanteerd zoals eerst beschreven in 2002 2. Twee-foton beeldvorming van immuuncellen vereist dat de cellen fluorescent zijn gelabeld, hetzij door kleuring met een cel tracker kleurstof of met het uitspreken van een fluorescerend eiwit. We tonen de adoptieve overdracht procedure van het injecteren van cellen afkomstig van donor muizen in de staartader van een ontvanger dier, waar ze thuis van lymfoïde organen binnen ongeveer 15-30 minuten. Illustreren we de isolatie van een lymfeklier en beschrijven methoden om een ​​goede montage van de weggesneden lymfeklier te verzekeren. Andere overwegingen, zoals een goede oxygenatie van geperfuseerde media, temperatuur, en de laser power worden besproken. Tot slot presenteren we 3D-videobeelden van naïeve CD4 + T-cellen vertonen een steady state motiliteit bij 37 ° C.

Twee-foton beeldvorming heeft blootgelegd lymfocyten beweeglijkheid en cellulaire interacties binnen de lymfeklier onder basale omstandigheden en gedurende een immuunrespons 1. Hier laten we zien adoptieve overdracht van T-cellen, isolatie van de lymfeklieren, en beeldvorming beweeglijkheid van de CD4 + T-cellen in de geëxplanteerd lymfeklier.

Dissection en 2-Photon Imaging van perifere lymfeklieren in Muizen

Twee-fotonbeeldvorming heeft een elegante choreografie van motiliteit en cellulaire interacties binnen de lymfeknoop onthuld onder basale omstandigheden en bij de ...

Hallo, mijn naam is Melanie Matthew. Ik kom uit het lab van Micah Helen aan de University of California Irvine. Vandaag gaan we lymfeklieren verwijderen uit een muis voor in situ twee-foton-imaging.Dit omvat het verwijderen van de inguinale lymfeklieren, de axillaire lymfeklieren en de cervicale lymfeklieren. De zes perifere lymfeklieren die in een muis gemakkelijk toegankelijk zijn, om fluorescente cellen in onze muislymfeklieren te krijgen. Om beeldvorming via two-photon imaging uit te voeren, moeten we eerst een adoptieve transfer van fluorescent gelabelde cellen doen.Voor dit experiment laat ik u eerst de adoptieve transfer zien. Hier is onze insulinespuit van 28 gauge. Ik ga deze vullen met wat cellen of cellen.Eerst wil ik de spuit vrijmaken zodat hij gemakkelijk glijdt. Vervolgens ga ik voorzichtig de cellen laden. Ik zal mijn best doen om met de insulinespuit de wanden van de buis niet te raken, omdat dit de naald kan stompen, wat de injectie in de staartvin van de muis bemoeilijkt.Als er luchtbellen aanwezig zijn, moet u deze wegtikken om ze te verwijderen. Tik ze hier weg. Zo zijn we klaar.Nu zijn we klaar om deze cellen in de staartvene injecteren. Oké, hier is onze C 57 black six muis. We gaan haar langzaam en voorzichtig in de staartvene-injector plaatsen.Veel muizen vinden dit niet prettig, maar het voorkomt dat ze springen tijdens de eigenlijke injectie, waardoor ze zichzelf minder snel verwonden en u minder kans heeft op een prikincident. Plaats de muis daarom heel langzaam en voorzichtig in de fixatie. Zoek vervolgens naar de staartвена langs de zijkanten van de staart van de muis.Er loopt dus een grote slagader langs de bovenkant. Aan weerszijden van de staart van de muis bevinden zich twee mooie lange aders. Ga helemaal door tot aan de punt.U neemt de naald en begint laag op de staart om een ader te zoeken. Ik zie daar een ader. Ik bevochtig deze eerst een beetje met ethanol, wat het zichtbaarder kan maken.Oké, we gaan nu de staartвена injecteren en het is belangrijk om de naald met de schuine zijde naar boven te houden. Dat is het open uiteinde van de naald naar boven. Beweeg vervolgens bijna parallel aan de staart.U wilt de naald niet onder een hoek invoeren omdat de aders zich direct bovenaan bevinden. U wilt de naald heel langzaam in de staartader laten glijden. Met wat meer ervaring zult u dit kunnen voelen terwijl de naald naar binnen gaat.Maar de eerste paar keer wilt u de vloeistof naar binnen duwen om te zien of er weerstand is. Als er geen weerstand is, bevindt u zich in de staartvene en kunt u een snelle, eenvoudige injectie uitvoeren, zoals ik zojuist heb gedaan. Vervolgens kunt u de naald langzaam terugtrekken.Een andere bevestiging dat u in de ader zit, is dat er een klein druppeltje bloed bij de terugstroom zal verschijnen. Een lichte terugstroom van bloed bij de injectieplaats bevestigt dus dat u zich zeker in de staartader bevond. Het bloeden bij de muis zou kort na de injectie moeten stoppen.Hier is onze C57BL/6-muis. We gaan de lymfeklieren verwijderen uit de inguinale flanken, die zich hier bevinden, en hier onder de oksel, waar de axillaire klieren liggen. En ook aan de andere kant hier. Daarnaast verwijderen we de oppervlakkige cervicale klieren, die zich hier in de keel bevinden, één aan elke zijde.Hallo. We zijn nu klaar om de muis te dissekeren. Ik begin met het vastpinnen van de muis op het dissectiebord. En dan ga ik de muis vastpinnen. Ja.Zorg ervoor dat de fixatie veilig is. Dit stelt ons in staat om de perifere lymfeklieren beter bloot te leggen. Daarom pin ik gewoon alle vier de poten vast.Ik maak me geen zorgen over de staart. Sommige mensen pinnen de staart ook vast. Om vervolgens te voorkomen dat er vacht in het dissectiegebied terechtkomt en over onze lymfeklieren en instrumenten verspreid raakt, bespuiten we de muis met 70% ethanol.Nu de muis is verdoofd met ethanol, zal ik een incisie maken in de middellijn. Dit doe ik door de vacht van het lichaam weg te trekken. De huid kunt u zien; ik kan deze optillen en een klein tentje vormen.En dat voorkomt dat u het peritoneum doorsnijdt, wat u in dit geval wilt vermijden. Oké, ik begin nu met mijn middenlijnincisie hierboven. Ik maak een kleine snede en zorg ervoor dat ik het peritoneum niet raak.U kunt zien dat het peritoneum eronder ligt. Ik schuif mijn schaar onder de snede en scheid langzaam de huid van het peritoneum, waarbij ik gaandeweg kleine sneetjes maak omdat we de cervicale lymfeklieren gaan wegnemen. Ik zal heel voorzichtig en langzaam helemaal tot aan de kaaklijn van de muis snijden, waarbij ik ervoor zorg dat ik geen grote bloedvaten raak.En omdat we de inguinale lymfeklieren wegnemen, die zich in het onderste gedeelte van de huidlap bevinden, maak ik een midline-incisie helemaal naar beneden tot ongeveer de staart, daar bij de basis van de staart. Zo, dat is goed. Deze midline-incisie is geschikt.Nu ga ik de huid scheiden van het peritoneum. Ik doe dit voorzichtig met een pincet door de huidten tijdens het proces van het peritoneum weg te trekken. Hiermee leg ik de eerste lymfeklier bloot die we gaan dissecteren.Dit is de inguinale lymfeknoop hier beneden in de onderste huidflap. Nu ik een huidflap van het hoofdlichaam van de muis heb weggetrokken, ga ik deze vastpinnen om de inguinale lymfeknoop bloot te leggen. Zo is de inguinale lymfeknoop beter zichtbaar, waardoor we deze zorgvuldig kunnen dissecteren.Hier zien we de inguinale lymfeklier die na het vastzetten is blootgelegd. Deze bevindt zich doorgaans in de huidlap, vlak boven het been. Je kunt de klier vinden door te zoeken naar de Y-vormige splitsing van de bloedvaten die er overheen lopen.En daar is hij. Hij ligt ingebed in een klein beetje vet met de bloedvaten die eroverheen lopen. Oké, nu ga ik de inguinale lymfeknoop verwijderen.Ik schraap met mijn pincet langs beide zijden van de lymfeklier om deze van het vet te scheiden. We willen geen vet hebben. Bij onze twee-fotonen-beeldvorming zou dit de laserpenetratie van het weefsel belemmeren.Laten we kijken. Het is belangrijk om al het vet rondom de lymfeklier te verwijderen en om de cortex van de lymfeklier intact te houden. Goed, zo gebeurd.Hier is onze iena-lymfeklier. Ik ga deze in ons medium plaatsen; een goede manier om te bepalen of al het vet is verwijderd, is door te kijken of de lymfeklier zinkt. Zodra u deze in het medium plaatst, zal deze direct naar de bodem zakken.Als er vet aanwezig is, zal dit drijven. Oké, nu ga ik de auxiliary lymfeklier verwijderen. Deze bevindt zich in de oksel van de muis, direct langs een groot bloedvat.Soms kan dit lastig zijn, omdat er veel bloedingen kunnen optreden die de lymfeklier maskeren. Ik laat zien hoe ik dit aanpak en hopelijk hebben we deze keer geen last van bloedingen. Allereerst maak ik de huidflap los, en ik maak specifiek dit deel van de onderarm naast de lymfeklier die ik wil verwijderen los.Hierdoor kan ik de huid met meer behendigheid met mijn vingers wegtrekken, maar ik houd deze spier vast die over de oksel loopt; met een beetje voorzichtig trekken zou een axillaire lymfeknoop naar buiten moeten komen. Ik ga er nu naar zoeken. En daar is hij.Het bevindt zich daar in de oksel, langs een groot bloedvat. Ik ga nu de axillaire lymfeknoop vrijleggen; u kunt de huid opnieuw vastpinnen of deze met uw vingers vasthouden, wat u prettiger vindt. Ik werk hier echter bij voorkeur zeer zorgvuldig te werk.Er is zeer weinig vet rond deze lymfeknoop, wat gunstig is voor beeldvorming, maar deze ligt naast een groot bloedvat, waardoor u ze soms kunt verliezen als u niet voorzichtig bent. Voor de axillaire lymfeknoop pak ik het bindweefsel eromheen vast en scheid ik dit langzaam van de bloedvaten. En oké, zo is het.Daar is onze axillaire lymfeklier. Hij bevindt zich precies daar. Het is een mooie, lange, platte lymfeklier.En ik pak een klein beetje van het overgebleven bindweefsel aan de zijkant van de lymfeklier vast, zodat we de klier zelf niet beschadigen. We gaan beelden maken om de lymfeklieren gehydrateerd te houden. Voordat we onze institutionele beeldvorming uitvoeren, plaatsen we ze in CO2-onafhankelijke media in individuele kamers, zodat we de inguinale, axillaire en cervicale lymfeklieren kunnen volgen.U kunt vaststellen of de preparatie van de lymfeklier correct is uitgevoerd als deze naar de bodem zinkt nadat u deze heeft gedissekeerd. Dat betekent dat er zeer weinig vet in de lymfeklier zit. Oké, nu ga ik de cervicale lymfeklier verwijderen, de oppervlakkige cervicale.En dit is hoe ik te werk ga: ik begin met het opnieuw vastzetten van de huid vanaf het moment dat ik de axillaire lymfeklier heb verwijderd, om het cervicale weefsel iets beter bloot te leggen. De cervicale lymfeklieren bevinden zich vlakbij de kaakspieren van de muis, feitelijk langs de zijkant.Dit zijn dezelfde lymfeklieren die u kunt voelen wanneer u ziek bent. Het zijn de klieren hier waar uw arts naar zal voelen als u een verkoudheid heeft. Om dit te doen, steek ik mijn vinger gewoonlijk onder het weefsel om het naar voren te trekken terwijl ik met mijn pincet langs de zijkant strijk.Ik zou een lymfeklier moeten zien die naar buiten komt. Oh, daar is hij. Hij bevindt zich daar in het weefsel.Daar is hij. Er is dus een oppervlakkige cervicale lymfeklier. Wees voorzichtig dat je geen speekselklieren meeneemt.U zult geen T-cellen vinden in uw speekselklieren. En deze specifieke lymfeklieren bevatten CD4-positieve T-cellen die zijn gelabeld met CFSE. We gaan u daarom enkele in situ-video's laten zien van die T-cellen die zich door het weefsel bewegen.Oké, nu ga ik de lymfeklier vastlijmen aan een onbreekbaar plastic dekglas, zodat we deze kunnen bevestigen aan de bodem van onze in situ imaging-opstelling. Op die manier voorkomen we dat het weefsel beweegt of verschuift terwijl we de T-cellen in beeld brengen. Ik heb hier mijn onbreekbare plastic dekglazen.Het eerste wat ik ga doen is er één op de juiste maat snijden voor onze lymfeknoop. Dus ik pak mijn schaar en knip hier een klein vierkantje uit. Oké, nu ga ik er lijm op aanbrengen.Het is een klein beetje lijm. Smeer het uit over het stukje objectglas dat we hebben afgesneden. Vervolgens gebruik ik een kimwipe om wat van de lijm weg te trekken.Dit is lijm die de lymfeklier zal bedekken. We willen slechts een zeer dunne laag, zodat de beeldvorming niet wordt belemmerd. Ik zal vervolgens een lymfeklier uit de oplossing halen.We beginnen met onze eerste lymfeklier hier uit het medium. Wees voorzichtig hiermee; de cortex van de klier mag niet beschadigd raken.Ik pak alleen de hoek vast en plak deze op het objectglas door eerst de hoek van de lymfeklier voorzichtig op het glas te laten raken en de lymfeklier vervolgens over het glas te trekken om deze te fixeren. Hiervoor gebruik ik het kleine beetje vet dat aan de rand van de lymfeklier achterbleef. Zo voorkom ik dat de cortex van de klier wordt beschadigd.Ik neem vervolgens de lymfeknoop en om de lijm te uitharden, dompel ik deze in hetzelfde putje waar hij uit is gehaald. Ik draai hem dus om en dompel hem voorzichtig in het medium dat de lijm bevat. Verwijder een klein beetje van de exo-lijm die daarmee is uitgehard.Zo gedaan. Nu hebben we een lymfeknoop voorbereid voor tweefoton-imaging. Dit is hoe u lymfeklieren voorbereidt voor in situ tweefoton-imaging.Nu gaan we ze naar onze microscoop brengen, deze instellen en enkele mooie beelden maken van de adoptief overgedragen T-cellen. Hier zien we CFSE-gelabelde T-cellen die zich bewegen binnen een inguïnale lymfeknoop. Deze video is ongeveer 500 keer versneld en u kunt zien dat de cellen zeer beweeglijk zijn.Ze zijn ongeveer 20 x vergroot met ons 20 x water-immersieobjectief. Dit is enkel een voorbeeld van T-celbeweging. We hebben de omringende cellen niet gekleurd.In meer geavanceerde experimenten met twee fotografen kun je doorgaans gekleurde dendritische cellen, gekleurde B-cellen en T-cellen hebben die interageren met gekleurde NK-cellen. Je kunt vrijwel elk celtype labelen dat je in de lymfeknoop verwacht aan te treffen en dit vervolgens afbeelden. Hiermee is ons protocol voor lymfeknooptbeeldvorming van het instituut voltooid.

dissection-and-2-photon-imaging-of-peripheral-lymph-nodes-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We presenteren stap-voor-stap instructies voor het genereren van neonatale hersenschimmen, alsmede de dissectie en voorbereiding van de thymus voor ex vivo beeldvorming door 2-Photon Microscopie.

In situ beeldvorming van de muis Thymus Met behulp van 2-Photon Microscopie

Dit protocol beschrijft een methode om de afbeelding fluorescerende T-cellen geïntroduceerd in lymfeklier plakjes. De techniek maakt real-time analyses van T-cel migratie met traditionele groothoek fluorescentie of confocale microscopen.

Ex vivo beeldvorming van T-cellen in muizen lymfkliertest Plakjes met Widefield en confocale microscopen

We hebben nieuwe laboratorium instrumenten en protocollen voor intravitale imaging verkrijging van thymus. Onze techniek zou moeten helpen bij de identificatie van 'niches' in de thymus, waar T-cel ontwikkeling optreedt.

Intravitale Beeldvorming van de Muis Thymus met behulp van 2-Photon Microscopy

Recente ontwikkelingen in de 2-foton microscopie hebben real-time...

Intravitale Imaging van de muis knieholte lymfkliertest

Recent ontwikkelde beeldvormende technieken met behulp van nabij-infrarood fluorescentie (NIRF) kan helpen verduidelijken van de rol het lymfestelsel speelt in kanker metastase, immuunrespons, wondheling, en andere lymfatische-geassocieerde ziekten.

Niet-invasieve optische beeldvorming van de lymfatische vasculatuur van een muis

This video demonstrates a dissection technique to harvest popliteal draining lymph nodes from the mouse hind legs. Lymph nodes play a critical role in bridging innate and adaptive immunity, and harvesting intact lymph nodes — with a preserved tissue structure and cellular viability — can help study local and systemic immune responses.

A Dissection Method to Harvest Murine Popliteal Draining Lymph Nodes for Ex Vivo Imaging

Hoge-resolutie intravitale beeldvorming met verbeterd contrast tot 120 urn diepte lymfklieren van volwassen muizen wordt bereikt door ruimtelijk moduleren van de excitatie patroon van een multi-focale twee-foton microscoop. In 100 micrometer diepte gemeten we resoluties van 487 nm (lateraal) en 551 nm (axiaal), waardoor verstrooiing en diffractie grenzen omzeilen.

Hoogst vastbesloten Intravitale Striped-verlichting Microscopie van Germinal Centers

Dit protocol beschrijft een techniek om verschillende celpopulaties in aftappen van lymfeklieren zonder veranderingen in de orgaan structuur te beeld.

Visualisering van lymfeklieren structuur en cellulaire lokalisatie met behulp van ex-vivo confocale microscopie

Een protocol wordt gepresenteerd combineren weefsel clearing met licht blad fluorescentie microscopie (LSFM) om driedimensionale en cellulaire resolutie beelden van de lymfevaten en lymfeklieren (LN' s) het verzamelen van de cerebrospinale vloeistof (CSF) en spinale epidurale vloeistof te verkrijgen.

Driedimensionale beeldvorming van de wervellymfefelietische vasculatuur en drainage met behulp van iDISCO+ en Light Sheet Fluorescentie Microscopie

Het manuscript demonstreert een innovatieve methode voor in vivo studie van de contractiliteit van cervicale lymfevaten en lymfestroom bij muizen, voor het testen van verschillende fysiologische functies van cervicale lymfevaten (cLV's) en de therapeutische strategieën voor het moduleren van de lymfatische regulatiemechanismen van hersendrainage en -clearance.

Reproduceerbare opstelling voor in vivo tweefotonbeeldvorming van de contractiliteit van cervicale lymfatische vaten en lymfestroom bij muizen

Hier wordt een protocol gepresenteerd om muis meningeale lymfevaten (MLV's) te beoordelen, die een belangrijke rol spelen bij meerdere neurologische aandoeningen. Het doel van dit protocol is het bieden van een geïntegreerde methode die zowel functionele evaluatie van tracerdrainage als gedetailleerde morfologische karakterisering van het dorsale MLV-netwerk mogelijk maakt.

Geïntegreerd protocol voor het beoordelen van meningeale lymfekatica: Cisterna magna-injectie, lymfeklierbeeldvorming, meningeale dissectie en whole-mount kleuring

Leer de dissectie en 2-foton imaging van perifere lymfeklieren bij muizen. Deze methode toont adoptieve overdracht van T-cellen en visualiseert CD4+ T-celmotiliteit voor immunologisch onderzoek.

Dissection en 2-Photon Imaging van perifere lymfeklieren in Muizen

Meer video's verkennen