Procedure voor Lung Techniek
8 maart 2011
We hebben een gedecellulariseerde long extracellulaire matrix en nieuwe biomimetische bioreactor die kunnen worden gebruikt om functionele longweefsel te genereren. Door zaaien cellen in de matrix en het kweken in de bioreactor, genereren wij weefsel dat effectieve gasuitwisseling laat zien wanneer transplanted in vivo voor een korte periode van tijd.
Het algemene doel van deze procedure is om longweefsel in cultuur te genereren dat morfologisch en fysiologisch vergelijkbaar is met inheems longweefsel. Dit wordt bereikt door eerst het hart en de longen van een volwassen rat te verzamelen. De volgende stap is om de longslagader en de luchtpijp te canuleren en de canuleerde longen aan te sluiten op een bioreactor voor decelluarisatie.
Na decelluarisatie en spoelen, wordt de long overgebracht naar een steriele kweekbioreactor en voorbereid op het zetten. De laatste stap van de procedure is om het gewenste compartiment van de long te zaaien met een voorbereide celpopulatie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen dat het gedecellulariseerde extracellulaire matrix efficiënt herbevolkt is met cellen die regionaal specifieke longmarkers uitdrukken door middel van immunofluorescentiemicroscopie.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden om longcellen in vitro te kweken, is dat de cellen gedurende langere tijd gedifferentieerde fenotypes behouden, zodat ze gedurende enkele weken in een driedimensionaal biologisch afgeleid substraat kunnen worden bestudeerd. Voor decelluarisatie worden de longen via de vasculaire canule verbonden met de bioreactorkap, en de kap is verbonden met het decelluarisatieapparaat. De glazen fles boven de longen wordt op zijn plaats gehouden door een ringstandaard en bevestigde klem.
Op dit punt kan cellulair materiaal worden verwijderd om een extracellulair matrixscaffold te produceren, dat kan worden herbevolkt met cellulair materiaal. De assemblage van de bioreactor voor het zaaien en kweken van geëngend longweefsel wordt in dit diagram getoond. De lure lock connector van de trachea canule verbindt zich met een ademhalingslus tussen de trachea reservoir en de hoofdkamer.
De ademhalingslus omvat twee eenrichtingskleppen. Posities zodanig dat medium een andere weg volgt in en uit de long. Een kleine reservoir wordt tijdelijk in de perfusielijn opgenomen voor het zaaien van endotheelcellen.
Een pulsatiele pomp wordt gebruikt om cellen van het reservoir naar het vasculaire compartiment van de long te transporteren. Vasculaire perfusie wordt verzorgd met behulp van een rolpomp. Medium wordt geperfuseerd in de longslagader via de bevestigde canule, stroomt door de longvaten en uit de longader rechtstreeks in de hoofdbioreactor waar medium wordt opgezogen voor perfusie.
Longepitheel wordt gezet door injectie in de ademhalingslus. De hoofdkamer met de long en het trachea reservoir worden gebruikt voor langdurige longcultuur. Wanneer de longen zijn geëxtraheerd en de slagader en trachea correct zijn canuleerde, moeten de vers geëxtraheerde longen lucht vasthouden zonder te lekken.
Dit kan worden geverifieerd door ze op te blazen met lucht terwijl ze ondergedompeld zijn in vloeistof. Er mogen geen bubbels zijn die luchtlekkage aangeven. Om het protocol te beginnen, worden de longen opgeblazen met PBS dat natriumnitropress side bevat totdat de longen vol zijn, maar niet overgeblazen. Plak onmiddellijk de trachea canule af zodat de longen opgeblazen blijven.
Vervolgens perfunderen we de longen gedurende ten minste 15 minuten met PBS en SNP bij 15 millimeter kwik. Daarna verwijdert u de stopper van de trachea canule om de longen te laten ontluchten. Doorgaan met perfusie met PBS en SNP gedurende 15 tot 30 minuten indien nodig.
Vul PBS en SNP bij om ervoor te zorgen dat de profusiondruk wordt gehandhaafd op 10 tot 15 millimeter kwik. Om de procedure voor lange decelluarisatie te beginnen, wordt de bioreactorkap verbonden met het decelluarisatieapparaat. Vervolgens worden de longen aangesloten op de kap.
Met behulp van de lure lock verbindingen die zijn gekoppeld aan de YS-vormige canule, moet de longslagader canule zich aansluiten op de perfusielijn en moet de trachea canule vrij zweven. Om volledige decelluarisatie van het weefsel te garanderen, is het van cruciaal belang om lucht uit het systeem te houden. De eenrichtingskleppen in de arteriële en trachea canule helpen luchtbellen in de buizen te verwijderen door middel van omkeerbare stroming in de buizen.
Laat daarom luchtbellen verwijderen door middel van een spuit. Zorg ervoor dat alle lijnen vrij van lucht zijn. Begin met perfusie met decelluarisatie oplossing. Geperfundeerd met decelluarisatie oplossing.
Totdat 500 milliliter oplossing door de longen is geperfuseerd, is de optimale druk minder dan 15 millimeter kwik. Dit duurt meestal 2,5 uur. De stromingssnelheden zijn meestal aanvankelijk erg traag en worden snel verhoogd tijdens de tweede uur tot ongeveer één milliliter per minuut of meer.
Tijdens de perfusie verwijderen we periodiek gebruikt decelluarisatievloeistof uit de bioreactor terwijl we ervoor zorgen dat er voldoende vloeistof overblijft om de long en trachea canule te ondersteunen. Wanneer de perfusie met de decelluarisatievloeistof voltooid is, brengen we de longen en bioreactor over naar een weefselkweekkap. Om te beginnen met het spoelen van organen, verwijderen we het 500 milliliter potje dat de decelluarisatievloeistof bevat en vervangen deze door een steriele pot met maximaal één liter steriele PBS.
Gebruik vacuümzuiging of een spuit om ervoor te zorgen dat de lijnen vrij van lucht zijn. Geperfundeerd PBS door de vaten op 10 tot 15 millimeter kwik op dezelfde manier. Wat betreft decelluarisatie, verwijderen we periodiek afval PBS uit de bioreactor en vervangen of vullen we de PBS pot weer aan. Met verse, steriele PBS blijven we spoelen totdat minimaal 2,5 liter steriele PBS de longen heeft geperfuseerd.
Dit duurt meestal twee dagen vanaf het begin van het decelluarisatieproces wanneer het spoelen voltooid is. Breng de longen over naar een nieuw sterieel bioreactorsysteem dat vers PBS plus 10%FBS plus 10%Pen strep bevat en zorg ervoor dat zowel de volledige perfusie lus als de volledige luchtweglijnen gevuld zijn met vloeistof. Vanaf hier zal een pulsatiele pomp worden gebruikt om de longen te perfunderen bij vijf millimeter per minuut.
Steriliseer het long extracellulair matrixscaffold door overnachts perfusie met PBS dat 10%FBS en 10%penicilline streptomycine bevat. Na het vol
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het genereren van functioneel longweefsel met behulp van een decellulaire long extracellulaire matrix en een nieuwe biomimetische bioreactor. De benadering maakt effectieve gasuitwisseling mogelijk wanneer het geconstrueerde weefsel in vivo wordt getransplanteerd.
Belangrijke onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Regeneratieve geneeskunde
- Weefsel engineering
- Biomaterialen
Achtergrond
- Decellularisatie verwijdert cellulair materiaal uit longen om een scaffold te creëren.
- Het behoud van gedifferentieerde fenotipen van longcellen is cruciaal voor langetermijnstudies.
- Bestaande methoden falen vaak om de native weefselarchitectuur te behouden.
- Deze techniek is bedoeld om beperkingen van traditionele in vitro longcelcultuur te overwinnen.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het genereren van longweefsel dat de native longmorfologie en functie nabootst.
- Om de levensduur en functionaliteit van gekweekte longcellen te verbeteren.
- Om de studie van longbiologie in een driedimensionale omgeving te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Oogsten van longen van volwassen ratten en canuleringen van de longslagader en luchtpijp.
- Verbinden van longen aan een bioreactor voor decellularisatie en daaropvolgende celzaaien.
- Gebruik van immunofluorescentie microscopie om celrepopulatie en marker expressie te beoordelen.
- Handhaven van steriele omstandigheden gedurende de decellularisatie en kweekprocessen.
Belangrijkste resultaten
- De decellulariseerde extracellulaire matrix werd met succes herbevolkt met longcellen.
- Cellen behielden hun gedifferentieerde fenotipen voor langere perioden.
- Effectieve gasuitwisseling werd in vivo aangetoond na transplantatie.
- De bioreactor setup maakte gecontroleerde perfusie en langetermijnkweek mogelijk.
Conclusies
- Deze methode biedt een veelbelovende benadering voor het engineeren van functioneel longweefsel.
- Het heeft potentiële toepassingen in regeneratieve geneeskunde en longziekteonderzoek.
- Toekomstige studies kunnen de langetermijnlevensvatbaarheid en functionaliteit van het geëngineerde weefsel onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Engineering lung tissue using decellularized scaffolds and bioreactor-based recellularization addresses a critical bottleneck in respiratory disease research and regenerative medicine. This platform enables the creation of physiologically relevant lung models for mechanistic studies, target validation, and preclinical evaluation. The approach supports predictive confidence in translational workflows by providing a more accurate in vitro microenvironment for respiratory cell biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of respiratory disease mechanisms in a three-dimensional, biomimetic context.
- Supports functional target validation by maintaining differentiated lung cell phenotypes over extended culture periods.
- Facilitates biological de-risking by allowing direct assessment of cell-matrix and cell-cell interactions.
Screening & Assay Development
- Provides a validated lung extracellular matrix scaffold for reproducible cell seeding and culture.
- Enables quantitative assessment of region-specific lung marker expression via immunofluorescence microscopy.
- Supports assay standardization and scalability for compound evaluation in disease-relevant lung tissue models.
Translational & Preclinical Research
- Offers a platform for studying gas exchange and lung function in engineered tissues, bridging discovery and preclinical validation.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling in vitro modeling of native lung physiology.
- Reduces risk in advancing respiratory therapeutics by providing predictive, human-relevant data.
Pipeline & Workflow Integration
This lung engineering procedure integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting both mechanistic studies and translational research in respiratory disease.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification in a physiologically relevant lung scaffold.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for evaluating cell repopulation and marker expression.
- Analytics: Provides immunofluorescence and histological readouts for comparative analysis of engineered versus native lung tissue.
- Translational Research: Facilitates continuity from in vitro modeling to preclinical assessment of lung function and gas exchange.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for respiratory disease modeling and therapeutic evaluation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in respiratory target validation.
- Operational Value: Standardizes lung tissue engineering workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust preclinical modeling.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of respiratory disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue engineering, decellularization, and bioreactor operation.
- Demands specialized instrumentation for perfusion, ventilation, and sterile culture.
- Necessitates cross-team standardization of cell sourcing, seeding, and analytical protocols.
- Adaptation may be needed for different species or disease models.
- Limitations include short-term functional assessment and technical complexity of scaffold preparation.
