Name: Lineage Labeling van de zebravis Cellen met Laser Uncagable Fluoresceïne Dextran (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Leer celafstammingslabeling in zebravisembryo's met UV-ontgrendeling van gekooide fluoresceïne. Deze methode maakt precieze tracering van celbestemmingen mogelijk via immunofluorescentiemicroscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Dan Carlin bedanken voor hun hulp bij het maken van kooien fluoresceïne. Daarnaast zouden we graag de volgende financieringsbronnen te bedanken: Vanderbilt University Medical School Programma voor Ontwikkelingsbiologie Training Grant aan JAC en NIH HD054534to JTG.

1. Synthese van Gekooide Fluoresceïne Dextran <ol><li> Meet 3,5 tot 4 mg aminodextran en toe te voegen in de Invitrogen geleverde getinte buis met 1 mg CMNB-kooien fluoresceïne SE. In onze handen Deze ratio geeft een gemiddelde belasting van ~ 2,5 kleurstofmoleculen per dextran. </li><li> Voeg 500 ul van 0,1 M Na 2 B 4 O 7 (natriumboraat) buffer aan de buis. </li><li> Cap en vortex gedurende 30 seconden om de aminodextran en gekooide fluoresceïne op te lossen. </li><li> Laat 's nachts te reageren op een vortex mixer. </li><li> Draai de onderste sluiting op een Zeba spin-kolom en draai de dop. Markeer een stip op de kolom met een viltstift. Plaats kolom in een 15-mL conische buis. </li><li> Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 2 minuten met de stip naar het midden van de rotor. Gebruik kolom onmiddellijk na het verdichten. </li><li> Plaats verdicht kolom in een nieuwe 15-mL conische buis. </li><li> Pool reactiemengsel en transfer naar het centrum van de verdichte kolom hars bed. Plaats de dop. </li><li> Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 2 minuten met de stip naar het midden van de rotor. Na de spin, zal het eluens en de top van de kolom ongeveer gelijk schaduw van geel van kleur. </li><li> Breng de gele eluens (~ 350 pi) naar een 1.5-mL microcentrifugebuis. </li><li> Lyophilize droog in een speedvac. Dek de speedvac met folie. </li><li> Resuspendeer de resulterende ~ 2-3 mg van lichtgeel schuim in het water tot een uiteindelijke concentratie van 1% w / v. </li><li> Bewaar deze oplossing bij -20 ° C in folie beklede buizen. Het is een goed idee om aliquot de dextran oplossing voor repetitieve vriesdooien te voorkomen. </li></ol> 2. Injectie van Gekooide Fluoresceine Dextraan Into zebravis embryo <ol><li> Verdun 1% w / v voorraad gekooide fluoresceïne dextran 1:05 of 1:10 in 0,2 M KCl. </li><li> Injecteer 0,5 - 1.0nL van gekooide fluoresceïne oplossing in de dooier van de ene cel stadium embryo's met behulp van een druk injector. Eenmaal geïnjecteerd, moet klauwen van de embryo's worden bewaard in het donker bij 28,5 ° C om niet-specifieke uncaging te verminderen. </li><li> Handmatig verwijderen chorions uit embryo's. </li><li> Verdoven embryo's in 4% tricaïne. </li><li> Embryo's worden gemonteerd in 0,8% agarose in 35mmx10mm petrischaal, dan bedekt met ei water. </li><li> Equilibreren gesmolten agarose in 50 ° C verwarmen blok voor tenminste 15 minuten. </li><li> Met behulp van een glazen pipet, het opstellen van een embryo in een minimale hoeveelheid water en laat het in de agarose. Opmerking: Het is belangrijk om de buis van agarose koel in uw hand voor ongeveer 30 seconden voordat op de invoering van de embryo in de buis om te voorkomen dat het doden van het embryo. </li><li> Pipetteer het embryo uit de tube, samen met ongeveer 50μL van agarose en verwijder de inhoud op het midden van de petrischaal. </li><li> Snel oriënteren het embryo met behulp van een plastic draad met de cellen te Uncaged naar boven. Opmerking: De agarose met koele snel zo haastig met het oriënteren van de embryo. Embryo's kunnen beschadigd raken als gemanipuleerd na de agarose wordt stijf. </li><li> Laat de agarose volledig stollen (dit duurt een paar minuten) en de schotel twee derde deel met ei water met 4% en 0,003% tricaïne PTU te vullen. </li></ol> 3. Laser Uncaging van fluoresceïne Dextran <ol><li> De microscoop wordt gebruikt voor uncaging moet een 40X water immersie objectief. </li><li> We maken gebruik van een Photonics Instrumenten laser met de 365 nm kleurstof cel en de 70% / 30% split dichroïsche spiegel. </li><li> Voorafgaand aan uncaging, moet de laser worden gemaakt parfocaal met de doelstelling en verzwakt aan de juiste kracht. </li><li> Te richten van de laser, plaats een spiegelend glas schuift onder de doelstelling en de focus van de doelstelling tot krassen in de dia zichtbaar zijn. </li><li> Stel de laser verzwakker totdat de laser kan een duidelijk zichtbaar kras in de spiegel met een enkele puls produceren. </li><li> Stel het doel richten op en neer. Als de laser kan een kras produceren wanneer het doel is onscherp, stel de laserfocus ¼ draai omhoog of omlaag. Herhaal dit tot de laser kan de spiegel alleen wanneer het doel is gericht krabben. </li><li> Plaats gemonteerd embryo onder de doelstelling en focus op het gebied dat moet worden Uncaged. </li><li> Om vrij maken, focus op een cel van rente en pols het 10-20 keer op 2-3 Hz. </li><li> Na uncaging, gratis het embryo met het schillen van agarose weg met pincet en brengen ze in het ei-water met 0,003% PTU. Laat embryo's ontwikkelen in een lichtdichte doos wanneer deze zijn verholpen. </li></ol> 4. Antilichaam etikettering en de opsporing van Uncaged Fluoresceïne Dextran <ol><li> Fix embryo's bij Ab fixatief (4% paraformaldehyde, 0,3 mm CaCl 2, 8% sucrose, 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,3) voor twee tot vier uur bij kamertemperatuur (RT) of 's nachts (O / N) bij 4 ° C. Houden embryo's in een lichte strakke doos of folie gewikkeld buis voor alle etiketterings stappen. </li><li> Verwijder fixatief en te vervangen door 100% MeOH, laat gedurende 10 minuten bij RT, verwijder MeOH en vervangce met verse 100% MeOH. </li><li> Bewaren in MeOH bij -20 ° C gedurende ten minste 30 minuten. Opmerking: U kunt in MeOH opslaan voor maximaal twee weken voor epitopen beginnen te degraderen. </li><li> Hydrateren embryo's met 5 minuten wassen bij RT van 75% MeOH/1X fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween 20 (1X PBSTw) en vervolgens 50% MeOH/50% 1XPBTw, dan is 25% MeOH/75% 1X PBSTw. </li><li> Was drie keer voor 5 minuten in 1XPBSTw. </li><li> Als embryo's worden&gt; 24 uur oud, permiabilize embryo's met 10 ug / ml proteinase K in 1XPBSTw. Permiabilization tijd is afhankelijk van het podium. Vijf minuten in proteinase K is voldoende als de embryo's zijn tussen 24 en 48 uur na bevruchting (HPF). Meer tijd kan nodig zijn als voor oudere larven. Re-fix in Ab fixeermiddel voor 20 minuten bij RT </li><li> Was vijf keer gedurende 5 minuten in 1XPBSTw bij RT. </li><li> Incubeer in blok-oplossing (1XPBS, 0,1% Triton X100, 10% schapen serum, 10% Bovine serum albumine, 1% dimethyl sulfoxide) gedurende 1-2 uur bij RT. </li><li> Verdunnen primaire antilichamen (anti-fluoresceïne plus antistoffen tegen cell-type-specifieke markers) in het blokkeren van oplossing. </li><li> Incubeer embryo O / N bij 4 ° C in een oplossing die primaire antilichamen. </li><li> Was vier keer voor 20 minuten in 1XPhosphate gebufferde zoutoplossing met 0,1% Triton X100 (PBSTx) bij RT. </li><li> Verdunnen fluorescent gelabelde secundaire antilichamen (meestal 1:300) in het blokkeren van oplossing. </li><li> Incubate O / N bij 4 ° C in oplossing die secundaire antilichamen. </li><li> Was vier keer voor 20 minuten in 1XPBSTx bij RT. </li><li> Duidelijke embryo's in 50% glycerol/50% 1XPBS gedurende ten minste twee uur bij RT, verwijder vervolgens glycerol / PBS mengsel en voeg 100% glycerol en laat het staan ​​O / N bij 4 ° C. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Na immunokleuring, moet er een verrijkt gebied van kleuring in de cellen die waren Uncaged (Figure.1). Het is niet ongebruikelijk om een ​​relatief hoge signaal-ruisverhouding te zien in&gt; 48 uur oud zebravis, als gevolg van spontane uncaging van de fluoresceïne. <img src="/files/ftp_upload/2672/2672fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Lineage etikettering van zebravis pijnappelklier complex. Op 24 HPF, een deel van de voorste pijnappelklier Anlage, aangegeven door foxd3:. GFP expressie, was Uncaged met behulp van UV-laserpulsen A) Door 48hpf, een linkszijdige cluster van cellen, genaamd de parapineal (rode cirkel) is ontstaan ​​uit de Uncaged domein (witte cirkel). B) Uncaged fluoresceïne signaal wordt verrijkt in de parapineal (rode cirkel) en de pijnappelklier orgel (witte cirkel).

<ol><li>Hatada, Y., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fate+map+of+the+epiblast+of+the+early+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A fate map of the epiblast of the early chick embryo.</a> Development. 120, 2879-2889 (1994).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell-stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo.</a> Dev Biol. 122, 300-319 (1987).</li>
<li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+Precursors+Can+Give+Rise+to+All+Major+Cell-Types+of+the+Frog+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multipotent Precursors Can Give Rise to All Major Cell-Types of the Frog Retina.</a> Science. 239, 1142-1145 (1988).</li>
<li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+fluorescent+tracers+to+study+neural+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microinjection of fluorescent tracers to study neural cell lineages.</a> Development. , Suppl 2. 1-8 (1991).</li>
<li>Woo, K., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+and+coherence+in+the+fate+map+of+the+zebrafish+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system.</a> Development. 121, 2595-2609 (1995).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Sato, T., Takahoko, M., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HuC%3AKaede%2C+a+useful+tool+to+label+neural+morphologies+in+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">HuC:Kaede, a useful tool to label neural morphologies in networks in vivo.</a> Genesis. 44, 136-142 (2006).</li>
<li>Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15905-15910 (2004).</li>
<li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+Fluorescent+Probes+and+Research+Chemicals%22">Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals</a>. , 9th Edition, 707-711 (2002).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+%28caged%29+fluorescein+as+a+cell+tracer+for+fate+mapping+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo.</a> Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).</li>
<li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li>
<li>Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orientation+of+first+cleavage+in+the+sea+urchin+embryo%2C+Lytechinus+variegatus%2C+does+not+specify+the+axes+of+bilateral+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry.</a> Dev Biol. 175, 177-183 (1996).</li>
</ol>

Zoals beschreven, dit protocol voorziet in een relatief snelle lijn etikettering methode in zebravis, dat is gebouwd op de algemeen gebruikte technieken van micro-injectie, microscopie, en immunofluorescentie. Wij hebben geconstateerd dat laser uncaging naar de meest efficiënte en kosteneffectieve manier om fluoresceïne vrij maken in een gelokaliseerde mode te zijn. Deze methode kan worden gebruikt om lijn label met experimentele eindpunten zo laat 4 DPF. Echter, als cellen delen, de gekooide-fluoresceïne concentratie p...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2672">Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran</a>. There was an error in the authors, Ilya A. Shestopalov and James K. Chen, names. The author's names have been corrected to: Ilya A. Shestopalov and James K. Chen instead of: Ilya Shestopalov and James Chen

A correction to the article Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran was made.

Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

<table><tbody><tr><td>CMNB-caged fluoresceïne SE</td><td>Invitrogen</td><td>C20050</td><td></td></tr><tr><td>Aminodextran, 10kDa</td><td>Invitrogen</td><td>D1860</td><td></td></tr><tr><td>Zeba desalt spin columns</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>89889</td><td></td></tr><tr><td>geit anti-fluoresceïne antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>A11095</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 ezel anti-geit antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>A21082</td><td></td></tr><tr><td>35mmx10mm petrischalen</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Rechtstaan compound microscoop met 40x waterimmersie-objectief</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM6000B</td><td></td></tr><tr><td>MicroPoint Manueel Laser Illuminatie Systeem</td><td>Photonic Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenylthiouronium (PTU)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06690</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Proteïnase K</td><td>Roche Group</td><td>03115836991</td><td></td></tr><tr><td>Plastic draad</td><td>Alle leveranciers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Savant SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>Vortexmixer</td><td>VWR international</td><td>Vortex Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>Drukinjector</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr></tbody></table>

lineage labeling van de zebravis cellen met laser uncagable fluoresceïne dextran

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Een centraal probleem in de ontwikkelingsbiologie is af te leiden van de oorsprong van de talloze soorten cellen aanwezig zijn in gewervelde dieren als ze voortvloeien uit ongedifferentieerde precursoren. Onderzoekers hebben gebruikt verschillende methoden van afkomst etiketteren, zoals DII etikettering 1 en de druk injectie van herleidbaar enzymen 2 om na te gaan lot van de cel in latere stadia van de ontwikkeling in model systemen. Het eerste lot kaarten in zebravis (Danio rerio) werden samengesteld door iontoforetische injectie van fluorescerende kleurstoffen, zoals rhodamine dextran, in enkele cellen in discrete gebieden van het embryo en het opsporen van de gelabelde cel lot na verloop van tijd 3-5. Hoewel effectief, worden deze methoden technisch veeleisend en vereist gespecialiseerde apparatuur die niet vaak gevonden in de zebravis labs. Onlangs zijn photoconvertable fluorescerende eiwitten, zoals de Eos en Kaede, die onomkeerbaar van groen naar rood fluorescentie wanneer blootgesteld aan ultraviolet licht, het zien van het toenemend gebruik in zebravis 6-8. De optische helderheid van de zebravis embryo en het relatieve gemak van transgenese hebben deze bijzonder aantrekkelijke tools voor lineage etikettering en de migratie van cellen te observeren in vivo 7. Ondanks hun nut hebben deze eiwitten ten opzichte van een aantal nadelen met dye-gemedieerde lijn labeling methoden. Het belangrijkste is dat het moeilijk we hebben gevonden in het verkrijgen van een hoge resolutie 3-D tijdens de photoconversion van deze eiwitten. In dit licht, misschien wel de beste combinatie van resolutie en het gebruiksgemak voor de lijn de etikettering in de zebravis maakt gebruik van gekooide fluoresceïne dextran, een fluorescente kleurstof die is gebonden aan een quenching groep die maskers zijn fluorescentie 9. De kleurstof kan dan &quot;Uncaged&quot; (vrij uit de quenching-groep) worden binnen een specifieke cel met behulp van UV-licht van een laser of kwiklamp, waardoor visualisatie van de fluorescentie of immunodetectie. In tegenstelling tot de iontoforetische methoden, kan gekooide fluoresceïne worden geïnjecteerd met standaard injectie apparaten en Uncaged met een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een pinhole 10. Daarnaast, antistoffen tegen fluoresceïne detecteren alleen de Uncaged vorm, en het epitoop overleeft fixatie goed 11. Ten slotte kan gekooide fluoresceïne worden geactiveerd met een zeer hoge resolutie 3-D, in het bijzonder als twee-foton microscopie is 12,13 gebruikt. Dit protocol beschrijft een methode van de lijn etikettering door gekooid fluoresceïne en laser uncaging. Subsequenctly, is Uncaged fluoresceïne tegelijk gedetecteerd met andere epitopen, zoals GFP door middel van etikettering met antilichamen.

Dit protocol schetst een manier om de label en sporen het lot van kleine groepjes cellen zebravis embryo&#39;s met behulp van UV-uncaging van gekooide fluoresceïne, gevolgd door een hele berg immunokleuring om het signaal van de Uncaged fluoresceïne versterken.

Lineage Labeling van de zebravis Cellen met Laser Uncagable Fluoresceïne Dextran

Een centraal probleem in de ontwikkelingsbiologie is het afleiden van de oorsprong van de talloze celtypen die aanwezig zijn in vertebraten naarmate deze ontstaan uit ongedifferentieerde ...

Het algemene doel van deze procedure is het labelen van de cellijn in een zebravisembryo. Dit wordt bereikt door eerst gecageerd fluoresceïne te synthetiseren en dit in de zebravisembryo's te injecteren. De embryo's worden vervolgens gemonteerd in agar zodat de te labelen cellen toegankelijk zijn.Vervolgens wordt een UV-laser gebruikt om het caged fluoresceïne in geselecteerde cellen van het embryo te activeren. Ten slotte worden de embryo's geoogst nadat ze zich hebben ontwikkeld tot het gewenste stadium en worden de gelabelde cellen gedetecteerd in relatie tot markers van specifieke lineages. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die het lot van geselecteerde cellen in de embryo's aantonen via foto-uncaging en immunofluorescentiemicroscopie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken, zoals de fotoconversie van Cade, is dat meerkleurige immunofluorescentie naast andere celtype-specifieke antilichamen ook ongecageerd fluoresceïne kan detecteren. Om gecageerd fluoresceïne-dextran in zebravissenembryo's te injecteren, moet dit eerst worden gesynthetiseerd en moet een 1% gewicht-per-volume voorraadoplossing worden bereid. Verdeel de voorraad in aliquoten volgens het bijbehorende geschreven protocol.Maak vervolgens een verdunningsaliquot, 1:5 of 1:10 in 0,2 molar kaliumchloride. Injecteer daarna 0,5 tot 1 nanoliter van de caged fluoresceïne-oplossing in de dooier van embryo's in het eencellige stadium. Gebruik hiervoor een drukinjector. Na injectie moeten de groepen embryo's in het donker worden bewaard bij 28,5 °C om aspecifieke uncaging te verminderen tot het gewenste ontwikkelingsstadium is bereikt.Verwijder handmatig de choon van de embryo's, anesthetiseer de embryo's in 4%trica om de embryo's te monteren en laat ze equilibreren in 0,8% gesmolten aros in een warmteblok van 50 °C gedurende ten minste 15 minuten. Koel de buis vervolgens ongeveer 30 seconden in uw hand voordat u de embryo's toevoegt. Zuig met een glazen pipet één embryo op in een minimale hoeveelheid water en breng dit over in de aros. Pipetteer het embryo samen met ongeveer 50 µL aros uit de buis en breng de inhoud over naar het midden van een Petri-schaal van 35 mm bij 10 mm.Oriënteer het embryo snel met een plastic draad, zodanig dat de cellen die ontmaskerd moeten worden naar boven wijzen. Laat het agar volledig stollen en vul het schaaltje. Vul het voor twee derde met eivrij water dat 4%trica en 0,003%PTU bevat en bewaar de embryo's in een lichtdichte doos tot aan de ontmaskering.Om laser-ontmaskering van fluoresceïne-dextran uit te voeren, gebruikt u een compoundmicroscoop met een 40 x water-immersie objectief. Wij maken gebruik van een laser van Photonics Instruments met een kleurstofcel van 365 nanometer en een 70%30% splitsende dichroïsche spiegel voorafgaand aan de ontmaskering. De laser moet parfoocaal worden ingesteld ten opzichte van het objectief en worden afgezwakt tot het juiste vermogen om de laser te focussen.Plaats een gespiegelde glazen objectglas onder het objectief en focus het objectief totdat krassen in het glas zichtbaar zijn. Stel de laserverzwakker zo in dat de laser met een enkele puls een duidelijk zichtbare kras in de spiegel produceert; pas de focus van het objectief naar boven en beneden aan. Als de laser een kras kan produceren terwijl het objectief niet in focus is, pas dan de laserfocus met een kwartslag aan.Draai omhoog of omlaag. Herhaal dit totdat de laser het spiegeloppervlak kan krassen. Pas wanneer het objectief is gefocust, plaatst u het gemonteerde embryo onder het objectief en focust u op het gebied dat moet worden ontmaskerd om de ontmaskering uit te voeren.Focus op een cel van belang en geef 10 tot 20 pulsen bij twee tot drie hertz. Na het uncaging. Bevrijd het embryo door de aeros met een pincet weg te pellen en ze in eiwater met 0,003% PTU te plaatsen. Fixeer de embryo's in antilichaam-fixeermiddel gedurende twee tot vier uur bij kamertemperatuur of overnacht bij vier graden Celsius.Verwijder het fixatief en vervang dit door 100% methanol. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de methanol en vervang deze door verse 100% methanol.Bewaar de embryo's in methanol bij -20 °C gedurende ten minste 30 minuten. De embryo's kunnen tot twee weken in methanol worden bewaard voordat epitopen beginnen te degraderen. Rehydrateer de embryo's door ze bij kamertemperatuur telkens vijf minuten te wassen in 75% methanol / 25% 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween 20, vervolgens in 50% methanol / 50% 1x PBS Tween 20, daarna in 25% methanol / 75% 1x PBS Tween 20, en tot slot drie keer vijf minuten in 1x PBS Tween 20.Indien de embryo's ouder zijn dan 24 uur, permeabiliseer deze dan met 10 µg/mL Proteïnase K in XPBS tween 20. De permeabilisatietijd is afhankelijk van het stadium van het embryo. Vijf minuten in proteïnase K is voldoende.Als de embryo's tussen de 24 en 48 uur na bevruchting zijn, kan er voor oudere larven meer tijd nodig zijn. Fixeer opnieuw met een antilichaamfixatief gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was de embryo's vijf keer gedurende vijf minuten in 1x PBS tween 20 bij kamertemperatuur.Incubeer vervolgens gedurende één tot twee uur bij kamertemperatuur in blokkeringsoplossing. Verdun de primaire antilichamen in de blokkeringsoplossing. Incubeer de embryo's vervolgens gedurende de nacht bij 4 °C in de oplossing met primaire antilichamen; was de volgende ochtend de embryo's vier keer in 1X PBS Triton X-100 en verdun de fluorescentie-gelabelde secundaire antilichamen in blokkeringsoplossing.Incubeer de embryo's een nacht bij vier graden Celsius in een oplossing met secundaire antilichamen. Na viermaal wassen in 1x PBS Triton X 100, worden de embryo's gedurende ten minste twee uur bij kamertemperatuur geklaard in 50% glycerol 50% 1x PBS. Verwijder vervolgens het glycerol-PBS-mengsel en voeg 100% glycerol toe; incubeer dit een nacht bij vier graden Celsius.Representatieve resultaten voor controle- en foto-ontkoppelde larven worden getoond in de vorm van confocale projecties. Controle-embryo's werden geïnjecteerd met gecageerd fluoresceïne, maar werden 48 uur na bevruchting niet onderworpen aan foto-ontkoppeling. Het controle-embryo vertoont GFP-labeling in het pineaalcomplex.Er is enige punctate achtergrondlabeling zichtbaar, maar er is geen gelokaliseerde accumulatie van gelabelde fluoresceïne detecteerbaar. Foto-ontkapselde embryo's vertonen een duidelijke accumulatie van ontkapselde fluoresceïne in sommige van de GFP-gelabelde cellen. Dit zijn de nakomelingen van de cellen die 24 uur eerder door foto-ontkapseling waren getarget, met kleine aanpassingen.Deze procedure kan worden gebruikt voor lineage-labeling van vrijwel elk weefsel in het zebravissenembryo vóór 48 uur na bevruchting.

lineage-labeling-zebrafish-cells-with-laser-uncagable-fluorescein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft beeldvorming van individuele neuronen of neurale cellen in levende zebravis embryo's. Deze methode wordt gebruikt om cellulaire gedrag en actine lokalisatie met behulp van fluorescentie confocal time-lapse microscopie bestuderen.

Live-Imaging van celbeweeglijkheid en actine cytoskelet van individuele neuronen en neurale cellen in de zebravis embryo&#39;s

De sleutel tot het begrijpen van de morfogenetische processen die de vroege embryo vorm is de mogelijkheid om beeld-cellen met een hoge resolutie. We beschrijven hier een techniek voor het etiketteren van enkele cellen of kleine clusters van cellen in zijn geheel zebravis embryo's met membraan-gerichte Green Fluorescent Protein.

Etikettering en Imaging Cellen in de zebravis achterhersenen

Stervende cellen zijn geëxtrudeerd uit epitheelweefsels door gezamenlijke contractie van naburige cellen zonder verstoring van de barrièrefunctie. De optische helderheid van ontwikkelen zebravis biedt een uitstekende systeem om extrusie visualiseren in levende epithelia. Hier beschrijven we methoden om te induceren en imago extrusie in het larvale zebravis epidermis op cellulair resolutie.

Live-Imaging van de Cel Extrusie van de opperhuid van de ontwikkelingslanden zebravis

Een methode wordt beschreven om enkele cellen met een gekooide fluorescerend eiwit met behulp van twee-foton absorptie van een Ti photoactivate: Sapphire femtoseconde laser oscillator. Het lot kaart brengen van de gefotoactiveerd cel, wordt immunohistochemie gebruikt. Deze techniek kan worden toegepast op elk celtype.

Single Cell Fate Mapping in de zebravis

Functie-Spacer-Lipid (FSL) constructies kan de oppervlakte-eigenschappen van levende cellen en virions worden gewijzigd zonder verlies van vitaliteit. De methode vereist slechts een eenvoudige aanraking van een FSL bouwen oplossing met een cel / virion en spontaan en stabiele ondergrond incorporatie optreedt.

FSL Constructen: Een eenvoudige methode voor het wijzigen van Cell / Virion Oppervlakken met een bereik van biologische merkers zonder dat hun levensvatbaarheid

De ontwikkeling van de zebravis kan over dagen met licht blad microscopie wanneer embryo's zijn ingebed in optisch heldere polymeer buizen met een lage concentratie agarose worden gevolgd.

Multilayer Montage voor langdurig licht Sheet Microscopie van zebravis

Het in beeld brengen van het dynamisch gedrag van organellen en andere subcellulaire structuren in vivo kan licht werpen op hun functie in fysiologische en ziektecondities. Hier presenteren we methoden voor het genetisch markeren van twee organellen, centrosomen en mitochondriën, en het in beeld brengen van hun dynamiek in levende zebravis-embryo's met behulp van breedveld- en confocale microscopie.

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

Gegevensmanipulaties om gerichte stress of dood in individuele cellen te veroorzaken, zijn relatief moeilijk te bereiken. Hier wordt een ablatie-aanpak met een resolutie van één cel beschreven om selectief stress te veroorzaken en individuele cellen in celkweek en levende dieren te doden, gebaseerd op een standaard confocale UV-laser.

Triggering Cell Stress en Dood met behulp van conventionele uv laser confocale microscopie

Cilia ontwikkeling is essentieel voor goede organogenese. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te etiketteren en ciliated cellen van de zebravis visualiseren.

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

Laserablatie is een breed toepasbare technologie voor het bestuderen van regeneratie in biologische systemen. Het gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van een standaard laserscanning confocale microscoop voor laserablatie en de daaropvolgende time-lapse beeldvorming van het regenereren van interneuromastcellen in de zebravis laterale lijn.

Confocale Microscoop-gebaseerde Laser Ablatie en Regeneratie Test in Zebrafish Interneuromast Cellen

Hier presenteren we een protocol om eiwitten te labelen met een fluorescentie-eiwitlabel in zebravislarven, een nieuw ontwikkeld en aangepast in vivo systeem dat vooral nuttig is voor het visualiseren van eiwitten met een lage abundantie in zebravissen.

Fluorescentielabeling om eiwitten met een lage expressie in zebravissen te visualiseren

Leer celafstammingslabeling in zebravisembryo's met UV-ontgrendeling van gekooide fluoresceïne. Deze methode maakt precieze tracering van celbestemmingen mogelijk via immunofluorescentiemicroscopie.

Lineage Labeling van de zebravis Cellen met Laser Uncagable Fluoresceïne Dextran

Meer video's verkennen