Inductie van allogeen-specifieke anergie in humane perifere bloed mononucleaire cellen door allogeen stimulatie met Co-stimulerende signaal blokkade

Het algemene doel van het volgende experiment is om recipiënt-allo-specifieke donor T-cellen te energiseren door ex vivo stimulatie met recipiënt-allo-antigenen in aanwezigheid van antilichamen die de co-stimulatie van T-cellen door antigeenpresenterende cellen via hun CD 28-receptor blokkeren. Dit wordt bereikt door eerst PBMC's te isoleren van twee verschillende gezonde donoren. Vervolgens wordt een bulk-allo-energiserende cocultuur opgezet door de HLA-mismatched PBMC-populaties te incuberen in aanwezigheid van monoklonale antilichamen tegen de liganden B 7.1 en B 7.2 om CD 28-stimulatie te blokkeren.

Vervolgens wordt de effectiviteit van de allo-energisatie gemeten door middel van primaire en secundaire gemengde lymfocytenreacties of MLR. Ten slotte wordt de allo-specificiteit van de allo-energisatie gemeten door derde-partij en CMV-specifieke responsen te bepalen. De resultaten laten zien dat donor-T-cellen hypo-responsief worden gemaakt voor daaropvolgende allo-antigene stimulatie, maar dat niet-allo-reactieve donor-T-cellen intact en functioneel blijven.

We hebben deze strategie met succes toegepast in eerdere en lopende klinische pilotstudies naar de infusie van allo-geenergiseerde donor-T-cellen tijdens en na HLA-mismatched stamceltransplantatie en observeerden een verbeterde immuunreconstitutie, minder infecties en een minder ernstige acute en chronische graft-versus-hostziekte dan waargenomen bij historische controles van ontvangers van ongemanipuleerde HLA-mismatched transplantaties. Een groot voordeel van de allo-anodisatiestrategie is dat off-target effecten worden geminimaliseerd, aangezien de techniek pathogeen-specifieke of tumor-geassocieerde antigeen-specifieke T-celresponsen niet vermindert en CD4-regulerende T-cellen uit de donor-T-celpool niet elimineert, wat aantoont dat de procedure zal worden uitgevoerd door Christine Vin, een staff scientist in ons laboratorium. De eerste stap is het afnemen van bloed van twee gezonde vrijwillige donoren.

Cellen van één donor dienen als responder en de cellen van een andere donor dienen als stimulator. Isoleer vervolgens PBMC uit het bloed via dichtheidsgradiëntcentrifugatie met behulp van fial pac. Kleur een kleine hoeveelheid cellen met trypaanblauw en tel de levensvatbare PBMC met behulp van de hemo cytometer reus.

Breng PBMC van elke donor in 10 milliliter compleet kweekmedium aan met een concentratie van 1 miljoen levensvatbare cellen per milliliter in aparte conische buizen van 15 milliliter. Wijs één buis met donor-PBMC aan als stimulatoren en de andere als responders om de bulk allo-energetiserende co-cultuur op te zetten.

Voeg 100 micrograms anti B 7.1 en anti B 7.2 antilichamen toe aan de 15 milliliter buis die als stimulator is aangewezen. Agiteer de buis voorzichtig en incubeer gedurende 30 minuten. Bestraal de stimulator PBMC en voeg deze toe aan een T 25 50 cubic centimeter celkweekfles met een gasdoorlatende dop.

Label de kolf als "bulk allo coal culture". Voeg vervolgens 10 milliliters responder PBMC van de andere donor toe aan de kolf in een concentratie van 1 miljoen per milliliter in comple medium. Voeg daarna nog 100 micrograms van elk van de antilichamen antib 7.1 en Antib 7.2 toe aan de kolf en meng dit voorzichtig voordat de kolf rechtopstaand gedurende 72 hours in een incubator wordt geplaatst.

Bestraal vervolgens nog eens 10 miljoen van de stimulerende PBMC's voor een bulkcontrole-cocultuur zonder blokkerende antilichamen en voeg deze vervolgens toe aan een T 25 50 kubieke centimeter kweekfles. Label de fles als bulkcontrole-cocultuur. Voeg 10 milliliter van dezelfde responder PBMC's toe als gebruikt voor de bulk allo-energiserende cocultuur, in een concentratie van 1 miljoen per milliliter in compleet medium, aan de fles en meng voorzichtig voordat u de fles rechtopstaand gedurende 72 uur in een incubator plaatst.

De volgende stap is het meten van de functie van de allogestimuleerde donor T-celpool op dezelfde dag als de bulk co-culturen. Label één bodemplaat van een 96-wells plaat voor de primaire MLR voor elk van de drie te meten tijdstippen. Schenk vervolgens 5 mL van elk van de bulkcontrole- en allogestimuleerde co-culturen af in buisjes van 15 mL.

Pipette vervolgens 200 µL cel-suspensie uit elke buis in triplaatjes putjes op elk van de drie platen. Label deze putjes als 'geen co-stimulerende blokkade' of 'geen CSB' voor de cellen uit de bulk-controle-koude culturen en 'CSB' voor de cellen uit de bulk-allo-energiserende koude culturen. Voeg daarna 200 µL compleet medium toe aan zes putjes op elke plaat als negatieve controles.

Voeg tot slot 200 µL PBS toe aan alle lege putjes om verdamping te verminderen en plaats de platen in de incubator. 72 uur na het opzetten van de bulk-coculturen labelt u één U-bottom 96-wells plaat als 'secundaire MLR' voor elk van de drie meetmomenten. Om de respondercellen voor de secundaire MLR voor te bereiden, brengt u 5 mL van elk van de bulk-controle- en allo-energiserende coculturen over in 15 mL buisjes en centrifugeert u de buisjes gedurende 5 tot 10 minuten bij 2000 RPM bij kamertemperatuur. Was de cellen vervolgens nog twee keer door de supernatants voorzichtig af te zuigen, de pellets te resuspenderen, 10 mL compleet medium aan elk buisje toe te voegen en de cellen daarna opnieuw te centrifugeren na de tweede wasbeurt.

Resuspendeer de cellen in één milliliter compleet medium. Gebruik tryanblauwkleuring om de levensvatbare cellen te tellen en pas de celconcentratie aan naar 1 miljoen levensvatbare respondercellen per milliliter. Pipetteer 100 µL cel-suspensie uit elke buis in triplaatjes putjes van elke plaat.

Label deze wells eerst als first party of FP-alloy-stimulatie. Pipetteer vervolgens 100 µL cel-suspensie uit elke buis in drie andere wells op elke plaat en label deze wells als CD 3/28-stimulatie PBMC van dezelfde donor die is gebruikt om de first party-stimulator PBMC voor de allo te leveren. Geactiveerde en controle co-culturen worden gebruikt als stimulatorcellen voor de secundaire MLR; suspendeer 10 miljoen PBMC van de first party-donor bij een concentratie van 1 miljoen per milliliter en bestraal deze.

Voeg 100 µL bestraalde stimulatorcellen toe aan de wells met het label fp allo restimulation op elke secundaire MLR-plaat. Voeg voor de positieve controles één µL van elk CD3- en CD28-monoklonaal antilichaam en 98 µL compleet medium toe aan de wells met het label CD 3 28 stimulation op elke secundaire MLR-plaat. Voeg daarnaast 200 µL compleet medium toe aan zes lege wells op elke plaat om als negatieve controles te dienen, en voeg 200 µL PBS toe aan alle overige lege wells om verdamping te verminderen.

Plaats de platen in de incubator. De volgende stap is het meten van de specificiteit; hiervoor worden allo PBMC's geïsoleerd van een nieuwe gezonde donor, aangeduid als de derde-partij-donor, om de specificiteit van het allo-proces in een secundaire MLR te testen. Suspendeer de derde-partij PBMC's op 1 miljoen cellen per milliliter en bestraal deze. Label drie 96-wells platen als "secondary MLR specificity day three, five and seven".

Om de respondercellen voor te bereiden op de secundaire MLR om de specificiteit te meten, brengt u vijf milliliter van zowel de bulkcontrole- als de allo-energiserende coculturen over in 15 milliliter buizen en centrifugeert u de buizen gedurende vijf tot 10 minuten bij 2000 RPM. Was vervolgens de cellen twee keer door de supernatanten voorzichtig af te zuigen, de pellets te resuspenderen, 10 milliliter compleet medium aan elke buis toe te voegen en de cellen na de tweede wasbeurt opnieuw te centrifugeren. Resuspendeer de cellen in één milliliter compleet medium.

Gebruik trypanblauw-kleuring om de cellen te tellen en pas de celconcentratie aan naar 1 miljoen levensvatbare responder-cellen per milliliter, en pipetteer vervolgens 100 µL van de celsuspensie uit elke buis in triplaatjes op elke plaat. Label deze putjes als TP of third party allo-stimulatie. Voeg vervolgens 100 µL bestraalde TP-stimulatorcellen toe aan de putjes die zijn gelabeld als TP allo-stimulatie.

Om de specificiteit van allo-responsen verder te testen, worden pathogenen-responsen gemeten na energisatie van PBMC van donoren met eerder vastgestelde proliferatieve responsen op CMV label 3 96. Label wellplaten als secundaire M-L-R-C-M-V dag drie, vijf en zeven, en breng 5 ml van elk van de bulkcontrole- en allo-energiserende co-culturen over in 15 ml buizen. Was vervolgens de cellen, tel deze en resuspendeer ze in compleet medium op een concentratie van 1 miljoen per milliliter. Pipetteer 100 µL cel-suspensie uit elke buis in drie wells op elke plaat, en label deze wells als CMV-stimulatie.

Voeg vervolgens 0,1 µL CMV-lysaat in 100 µL compleet medium toe aan de putjes die zijn gelabeld als CMV-stimulatie. Voeg daarna 200 µL compleet medium toe aan zes putjes op elke plaat als negatieve controles. Voeg tot slot 200 µL PBS toe aan alle lege putjes om verdamping te verminderen en plaats de platen in de incubator om de proliferatie in de primaire en secundaire MLR te meten.

Voeg één microcurie tritiumgelabelde thymidine toe aan de negatieve controle en de cellinhoudende putjes 16 uur voordat de platen worden geoogst. Verzamel de thymidine op één filtermat per plaat met behulp van een TomTec-oogster of een soortgelijk apparaat. Laat de filtermatten één uur drogen.

Plaats ze vervolgens in individuele monsterzakjes. Voeg vijf milliliter scintillatievloeistof aan elk zakje toe en sluit deze af. Meet de inbouw van tri-thymidine gedurende de laatste 16 uur van het experiment door de filtermatjes af te lezen met een Wallach micro bèta-scintillatieteller, of een vergelijkbaar apparaat, gebruikmakend van HLA-mismatch stimulator- en responder-PBMC's.

In deze figuur is te zien dat de aanwezigheid van co-stimulatorische blokkade in de primaire MLR de gemiddelde allo-proliferatie van responder PBMC op dag vijf reduceert tot ongeveer 30% van wat wordt waargenomen in de controle primaire MLR zonder co-stimulatorische blokkade. Dit komt overeen met een gemiddelde remming van de primaire allo-proliferatie van ongeveer 70% op dag vijf. Zoals te zien is in deze figuur.

In deze figuur is te zien dat in de secundaire MLR de eerste-partij allo-proliferatie van allo-geënergiseerde PBMC op dag vijf doorgaans 10 tot 15% bedraagt van wat er bij controle-PBMC wordt waargenomen. Dit komt overeen met een gemiddelde proliferatieremming van 85 tot 90%, wat aantoont dat allo-geënergiseerde PBMC hypo-responsief zijn voor eerste-partij allo-stimulatoren. Zoals in deze figuur te zien is, kunnen bulk-coculturen van allo-geënergiseerde donor-perifere bloedmononucleaire cellen in twee tot drie uur worden opgezet.

De aanpak kan eenvoudig worden gestandaardiseerd voor klinisch gebruik om donor T-cellen te genereren met een verminderde allo-reactiviteit, maar behouden pathogeen-specifieke immuniteit. Dergelijke cellen kunnen adoptief worden overgebracht in de context van allogene hematopoëtische stamceltransplantatie om de immuunreconstitutie te verbeteren zonder overmatige graft-versus-hostziekte. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om er rekening mee te houden dat er snel gewerkt moet worden.

Dit helpt de levensvatbaarheid van cellen te behouden en voorkomt aspecifieke activatie of verlies van antigeenpresenterende cellen. Indien er gebruik wordt gemaakt van cryopreserveerde PBMC voor stimulatoren of responders, dient een gevalideerd protocol voor de resuscitatie van bevroren cellen te worden gebruikt dat consistent hoge opbrengsten van levensvatbare cellen geeft. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u menselijke donor, perifere mononucleaire bloedcellen kunt allo-aniseren en hoe u assays uitvoert om de effectiviteit en specificiteit van deze procedure te beoordelen; deze strategie kan worden gebruikt om menselijke donor T-cellen met verminderde allo-responsen te genereren, die klinisch kunnen worden ingezet om de immuunreconstitutie na allogene hematopoëtische stamceltransplantatie te verbeteren.