Een methode voor ovariële follikel Encapsulation en cultuur in een proteolytisch Afbreekbare 3 dimensionale systeem
March 15th, 2011
Een nieuwe methode voor ovariële follikel inkapseling in een 3D-fibrine-alginaat interpenetrerend netwerk wordt beschreven. Dit systeem combineert een structurele ondersteuning met proteolytische degradatie van de ontwikkeling van onvolgroeide follikels steun aan rijpe eicellen te produceren. Deze methode kan worden toegepast op de cultuur cel aggregaten tot cel-cel contacten, zonder beperking van de uitbreiding te behouden.
Dit protocol beschrijft een nieuwe incapsulatiemethode van ovariële follikels in een fibrine alginate interpenetrating netwerk voor in vitro cultuur. Secundaire follikels bestaan uit een centraal gelegen oöcyt omgeven door verschillende lagen van somatische cellen, die de ontwikkeling van de oöcyt, follikel incapsulatie en cultuur in een driedimensionale omgeving ondersteunen. De follikelexpansiekulttuur in een driedimensionale omgeving staat follikelexpansiem toe, terwijl de communicatie tussen meerdere cellulaire compartimenten wordt ondersteund en de bolvormige structuur van de follikel wordt gehandhaafd. In de eerste stap van dit protocol, isoleren van secundaire follikels uit 16 dagen oude muizen eierstokken voor de druppelmethode.
Spoel en breng de follikels over naar een incapsulatieoplossing. Zuig elke follikel op met een pipet met fibrinogeen alginate oplossing in trombine calciumoplossing en laat de korrels cross-linken voor de paraform methode. Breng afzonderlijke follikels over naar druppels van fibrinogeen alginate oplossing op een met paraform gecoate glazen plaat en voeg trombine oplossing toe om F-A-I-P-N cross-linking te initiëren.
Breng vervolgens de ingekapselde follikels over naar een groeimedium en beeld, de ingekapselde follikel in de FA IPN. Aangezien dit systeem structurele ondersteuning combineert met biologische responsiviteit om de groei en ontwikkeling van onrijpe follikels te ondersteunen om eieren te produceren, kan het worden toegepast voor cultuur van celaggregaten om cel-celcontacten te behouden zonder de expansie te beperken. Hallo, mijn naam is Lonnie Shea en door een samenwerking met drie wood drip hebben we een cultuursysteem ontwikkeld voor de in vitro rijping van ovariële follikels.
En deze cultuurstudie weerspiegelt echt een ware samenwerking tussen bio-engineering en reproductieve biologie. En vandaag zullen de mensen die dit cultuursysteem daadwerkelijk ontwikkelen de methoden aan u presenteren. Ten eerste, Ariel Checkoff is een postdoctoraal onderzoeker in bio-engineering die het biomateriaalsysteem ontwikkelde.
Vervolgens is Minsu, een reproductiebioloog in de afdeling Obstetrie en Gynaecologie, die de behandelingsprocedures voor het ovariële weefsel ontwikkelde. En samen zullen ze u de methoden presenteren voor het daadwerkelijk incapsularen en cultiveren van ovarieel weefsel. Het belangrijkste voordeel van de beschreven techniek van bestaande methoden, zoals de standaard cultuur op het platte oppervlak van plastic, is dat het fibrine alginate systeem driedimensionale architectuur van de follikel ondersteunt terwijl het een mechanisch dynamische omgeving presenteert voor de snel expanderende follikel.
Het dynamische mechanische micro-omgeving in de huidige man biedt extra voordelen wanneer deze technologie wordt vertaald van massamodel naar de potentiële klinische toepassing omdat in menselijke follikel veel meer uitgebreide groei nodig is om rijpe en bevruchte eieren te produceren. Voor optimale resultaten voer alle dissecties uit in L 15-gebaseerde media voor pH-controle bij 37 graden Celsius, verwarmde stadia voor temperatuurcontrole en op een schone werkbank om bacteriële besmetting te minimaliseren. Breng vers gedissekteerde eierstokken over naar een nieuwe 35 millimeter petrischaal met één tot twee milliliter onderhoudsmedium dat 0,1% collageenase en 0,1% DNA bevat en incubeer gedurende 15 minuten in een koolstofdioxide-incubator.
Was monsters in DM om collageenase te verwijderen en breng ze vervolgens over naar een 35 millimeter petrischaal met vers DM om follikels van de eierstok te isoleren. Draai voorzichtig de follikels weg van de hele eierstok met behulp van 2 28 5 8 gauge naalden die aan insulinespuiten zijn bevestigd. Verwijder zoveel mogelijk stromacellen zonder de integriteit van de follikel te beschadigen.
Snijd 20 tot 40 secundaire follikels uit met een diameter van 130 tot 150 micron per eierstok. Deze follikels hebben meestal twee tot drie lagen granulosacellen. Nu in een IVF-schaal, voeg één milliliter mm toe in de centrale put en drie milliliter mm in de buitenste ring.
Breng intacte follikels over met de pipet naar de buitenste ring van de IVF-schaal. Houd deze IVF-schaal binnen de incubator op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Nadat alle follikels zijn verzameld.
Bekijk monsters onder een dissectiemicroscoop met een vergroting van vijf tot acht keer selecteer follikels van 130 tot 150 micron grootte die gezonde morfologie vertonen inclusief twee tot drie granulosacellenlagen, geen scheiding tussen oöcyt en granulosacellen en intacte en ronde oöcyten. Breng de gezonde follikels over naar het centrum van een andere IVF-schaal voor incapsulatie. Voor de druppelmethode van follikelincapsulatie, voeg één milliliter van 50 internationale eenheden per milliliter trombine-oplossing toe aan de middelste put van een IVF-schaal, ontdooi en bewaar fibrinogeen-voorraadoplossing op ijs.
En breng het fibrinogeen net voor de incapsulatie op kamertemperatuur. Direct voor gebruik. Bereid de fibrinogeen alginate oplossing voor door eenmaal PBS 0,5% alginate en 50 milligram per milliliter te mengen.
Fibrinogeen bij een verhouding van twee tot één tot één in een 1,7 milliliter steriele microcentrifugebuis. Roer de licht troebele oplossing voorzichtig en centrifugeer om verdamping te verminderen. Zet de verwarmde fase uit op de dissectiemicroscoop in de hoek van de buitenste ring van een IVF-schaal plaats.
90 microliters fibrinogeen alginate oplossing voor incapsulatie en een tweede druppel van 10 microliters voor een wasstap. Breng 10 tot 15 follikels over naar de 10 microliterdruppel met een minimale hoeveelheid kweekmedium en meng ze snel met een minimale hoeveelheid oplossing, breng alle follikels over naar de 90 microliter druppel en meng aspiriër een follikel binnen vijf microliters fibrinogeen alginate oplossing met een 10 microliter tip en laat de fibrinogeen alginate oplossing samen met de follikel vrij in de trombineoplossing in het midden van de IVF-schaal. Herhaal deze stap totdat alle follikels zijn ingekapseld.
Laat de korrels vijf tot zeven minuten staan om het gel in de
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor het inkapselen van ovariële follikels in een 3D fibrine-alginaat interpenetrating netwerk. Deze techniek ondersteunt de ontwikkeling van onrijpe follikels naar volwassen oöcyten terwijl cel-cel interacties worden gehandhaafd.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Reproductieve biologie
- Celkweektechnieken
Achtergrond
- Ovariële follikels zijn essentieel voor de ontwikkeling van oöcyten.
- Inkapslingstechnieken kunnen de in vitro kweekcondities verbeteren.
- Het handhaven van cellulaire communicatie is cruciaal voor follikelrijping.
- Fibrine-alginaat netwerken bieden structurele ondersteuning en staan degradatie toe.
Doel van de studie
- Een methode ontwikkelen voor het inkapselen van secundaire ovariële follikels.
- De groei en rijping van oöcyten ondersteunen in een gecontroleerde omgeving.
- De integriteit van cel-cel interacties tijdens de kweek behouden.
Gebruikte methoden
- Isolatie van secundaire follikels uit muizenovaria.
- Inkapsling in fibrine-alginaat oplossing.
- Cross-linking met behulp van trombine en calcium oplossingen.
- Observatie van follikelstructuur en ontwikkeling.
Belangrijkste resultaten
- De inkapslingsmethode handhaafde met succes de follikelstructuur.
- Follikels vertoonden tekenen van groei en rijping.
- Cel-cel communicatie werd gedurende de hele kweekperiode behouden.
- Deze methode kan mogelijk worden toegepast op andere celaggregaten.
Conclusies
- De 3D inkapslingsmethode is effectief voor follikelcultuur.
- Deze aanpak kan de productie van oöcyten verbeteren voor onderzoek en klinische toepassingen.
- Toekomstige studies kunnen de toepassing ervan in andere celtypen onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method addresses a key challenge in reproductive biology and fertility preservation by enabling dynamic mechanical support for expanding ovarian follicles in vitro. The fibrin-alginate interpenetrating network provides initial structural rigidity while allowing protease-mediated degradation to reduce compressive forces as follicles grow, mimicking the natural ovarian microenvironment. This approach supports predictive modeling of follicle development and offers translational value for preclinical studies in reproductive therapeutics and fertility preservation strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of follicular growth mechanisms by maintaining 3D architecture and cell-cell interactions during expansion.
- Operational Value: Supports functional target validation through preservation of paracrine signaling and somatic cell-oocyte communication in a degradable matrix.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a reproducible, quantifiable platform for assessing follicle maturation via measurable diameter increase and progression to antrum or MII stage.
- Operational Value: Enables standardized encapsulation and culture workflows with imaging-compatible hydrogels for longitudinal monitoring.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human follicle expansion dynamics through degradation-responsive mechanics, supporting preclinical evaluation of fertility-preserving interventions.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement by enabling observation of developmental competence under controlled, tunable mechanical conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a biologically responsive 3D culture system that bridges basic follicle biology with preclinical validation of reproductive therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on follicular development by enabling real-time imaging of structural integrity and growth in a protease-degradable environment.
- Screening: Offers assay readiness through consistent follicle encapsulation, cross-linking, and culture maintenance with quantifiable growth readouts.
- Analytics: Enables quantitative dependent variable measurements such as follicle diameter, maturation stage, and cumulus expansion for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by modeling the >10^6-fold volume increase of human follicles via dynamic matrix remodeling.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform for studying cell cluster organization and tissue growth beyond follicles, applicable to other aggregating cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in follicle maturation models by reducing mechanistic ambiguity from static compressive forces.
- Operational Value: Ensures reproducibility and scalability through standardized encapsulation via drop or bead methods and defined media exchange schedules.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in fertility research by enabling observation of full developmental progression to MII oocyte under controlled conditions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates targeting follicle growth pathways through validated, translatable preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in reproductive tissue dissection and follicle isolation from murine ovaries.
- Depends on access to thrombin, calcium, fibrinogen, and alginate solutions for IPN formation and crosslinking.
- Necessitates standardized media exchange and contamination control via CO2 incubators and sterile technique.
- Involves adaptation considerations for different follicle stages or species due to size-dependent degradation kinetics.
- Limited by the need for manual follicle transfer and imaging-based validation, which may constrain throughput without automation.
