Solid Plate-based dieetbeperking in Caenorhabditis elegans

De procedure voert dieetrestrictie uit op de standaard abased plaat in zee-elegance om het effect ervan op levensduur, reproductie en metabolisme te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst nauwkeurig de concentratie van de bacteriën die als voedselbron zullen worden gebruikt, te meten. De tweede stap van de procedure is om de bacteriecultuur goed te verdunnen tot geschikte concentraties.

Bereid vervolgens abased SDR-platen voor met gedode bacteriën. Stel ten slotte SDR-experimenten op met een leeftijdsgesynchroniseerde populatie wormen. Resultaten van nakomelingenproductie en levensduurmetingen kunnen vertraagde en verminderde nakomelingenproductie evenals een verhoogde gemiddelde levensduur laten zien.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van 60 methoden zoals Dian in AZA-medium, is dat alle experimenten worden uitgevoerd op een standaard vaste AGA-gebaseerde plaat die door de meeste warme laboratoria wordt gebruikt. Voor dieetrestrictie-experimenten en zee-elegance stel aparte kalibratiecurves op voor elke bacteriestam die als voedselbron wordt gebruikt. Neem een enkele kolonie van e coli OP 50-bacteriën van een verse streek op lb-agar en inoculeer drie milliliter vloeibaar lb-bouilloncultuur in een 37 graden Celsius shaker 's nachts. Bereid een tweevoudige seriële verdunning van de overnachtcultuur voor.

Meet vervolgens de absorptie van elke verdunning bij 600 nanometer door spectrofotometer in triplicaat. Duits elke bacteriesuspensie verder, zaai 1 miljoen keer gelijkmatig 0,4 milliliter bacteriesuspensie van elke verdunning op een 100 millimeter lb-agri-plaat en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 18 tot 24 uur. Tel het aantal bacteriekolonies dat op elke plaat is gegroeid om de kolonievormingseenheden per milliliter voor elk monster te berekenen.

Plot nu OD 600 als functie van bacterieconcentratie en voer een lineaire regressieanalyse uit om de relatie tussen gemeten OD 600-waarden en OP 50-bacterieconcentraties vast te stellen. Voor deze methode wordt een bacterieconcentratie van een keer 10 tot de 11e CFU per milliliter gebruikt in de ad lido-voedingsconditie en een keer 10 tot de achtste CFU per milliliter als de optimale DR-voedingsconditie. Echter, vier tot zes verschillende bacterieconcentraties kunnen nodig zijn om een complete dosisafhankelijke relatie vast te stellen.

Voor SDR en zijn antwoorden. Bereid een inoculum voor met een enkele kolonie van e coli OP 50-bacteriën in drie milliliter vloeibare LB-bouillon, gekweekt in een 37 graden Celsius shaker gedurende zes tot acht uur. Breng de OP 50-cultuur over naar een nieuwe kolf met 500 milliliter LB-bouillon en laat de bacteriën overnacht groeien tot ze verzadiging bereiken indien nodig.

Bereid een geschikte verdunning van de OP 50-cultuur voor voor de meting van absorptie bij OD 600. Om de bacterieconcentratie te bepalen, pel de bacteriën door centrifugatie bij 1500 Gs gedurende 20 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de bacteriën tot een concentratie van een keer 10 aan van de 12e CFU per milliliter.

Bereid nu 10 milliliter bacterieculturen voor in zes verschillende concentraties, variërend van een keer 10 van de 12e tot een keer 10 van de zevende CFU per milliliter pipette. Pipet twee milliliter bacteriecultuur in het midden van een 60 millimeter gesolideerde N GM-plaat. Vermijd contact van de pipettip met het oppervlak van de plaat, aangezien deuken op het oppervlak wormen in staat stellen om in de aerates te graven.

Plaats de platen in een 37 graden Celsius incubator gedurende een uur. Breng vervolgens 10 microliters van 100 milligram per milliliter koolzure soin en 10 microliters van 50 milligram per milliliter can mycine aan op elke plaat om de groei van de bacteriën te remmen. Bewaar platen met verschillende concentraties van antibiotica gedode bacteriën bij vier graden Celsius voor toekomstig gebruik gedurende maximaal een maand.

Het is belangrijk om voldoende platen te bereiden en op te slaan, bij voorkeur dezelfde batch voor de hele plant. Experimenteer ten minste een tot twee dagen van tevoren om de levensvatbaarheid van de bacteriën te verifiëren. Schraap wat bacteriën uit de SDR-platen en spreid deze uit op een lege N GM-plaat met carbonic, sein en antimycine.

Plaats de plaat in een 37 graden Celsius incubator gedurende zes tot acht uur en bevestig de afwezigheid van bacteriegroei. Voor de meeste SDR-gerelateerde studies, zoals levensduuranalyse en nakomelingenproductieprofilering, is de voorbereiding van een leeftijdsgesynchroniseerde populatie wormen essentieel. Gebruik een platina wormpicker om 20 tot 30 reproductief actieve volwassenen over te brengen naar verschillende reguliere NGM-platen.

Met OP 50. Afhankelijk van het aantal eieren dat voor de experimenten nodig is, kunnen meer volwassenen nodig zijn. Laat de platen vier uur staan bij 20 graden Celsius om eierleggen mogelijk te maken.

Verwijder de volwassenen van de plaat en inspecteer de platen visueel op eieren. Blijf de platen bij 20 graden Celsius incuberen om de nakomelingen te laten ontwikkelen tot de late L vier dagen één volwassen stadium. Gewoonlijk duurt dit drie dagen voor N twee wildtype wormen bij 20 graden Celsius.

Voor levensduuranalyse. Breng 10 tot 12 één dagen oude volwassen wormen over naar een SDR-plaat om de dieetrestrictie te initiëren. Om voldoende statistische kracht te verkrijgen, gebruik in totaal 60 tot 100 wormen voor elke SDR-conditie.

Score de levensvatbaarheid van elke worm elke twee tot drie dagen totdat alle wormen dood zijn. Belangrijk is dat de wormen om de dag naar verse SDR-platen worden overgebracht om honger te voorkomen. Deze kalibratiecurve plot OP 50-concentratie in relatie tot OD 600.

De vergelijking gegenereerd door lineaire regressieanalyse kan worden gebruikt voor alle toekomstige berekeningen van OP 50-bacterieconcentraties. Deze studie onderzoekt het effect van chronische SDR-behandelingen op de gemiddelde levensduur van verschill