Name: Solid Plate-based dieetbeperking in Caenorhabditis elegans /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Leer een protocol voor dieetbeperking op vaste plaat bij Caenorhabditis elegans met gedode bacteriën. Deze methode onderzoekt effecten op levensduur, voortplanting en metabolisme.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een piloot prijs van de Nathan Shock Center (P30 AG13283) en een R01-subsidie ​​(R01 AG028516) van het National Institute on Aging (NIA) naar A.-LH

1. Tot vaststelling van een ijklijn voor de raming van bacteriën concentraties Dit hoofdstuk beschrijft een methode voor de schatting van de concentratie bacteriën voor een bepaalde bacteriën stam (bijv. OP50, HT115), die zal worden gebruikt als een voedselbron voor Dieetbeperking experimenten in C. elegans. Aparte kalibratiecurves moeten worden vastgesteld voor elke bacteriën stam gebruikt. <ol><li> Inoculeren een enkele kolonie van E. coli-bacteriën OP50 geplukt van een verse streep van bacteriën op LB-agar in 3 ml vloeibare LB bouillon. </li><li> Plaats OP50 cultuur in 37 ° C mogelijk maakt shaker en bacteriën om te groeien 's nachts. </li><li> Bereid seriële 2-voudige verdunningen van de bacteriële schorsing van het 's nachts cultuur (2x, 4x, 8x, 16x, 32x). </li><li> Meet de extinctie (optische dichtheid) van elke verdunning bij 600 nm door de spectrofotometer in drievoud. </li><li> Verder vul telkens bacteriesuspensie miljoen-voudige (1000-voudige verdunning tweemaal). </li><li> Spreiding 0,4 ml bacteriële suspensie van elke verdunning gelijkmatig op een 100 mm LB agar plaat. </li><li> Plaats LB-platen met OP50 in een 37 ° C incubator voor 18-24 uur. </li><li> Tel het aantal bacteriële kolonies gegroeid op elk bord. De kolonie telt worden gebruikt om kve (kolonievormende eenheid) per mL te berekenen voor elk monster. </li><li> De relatie tussen de gemeten OD 600-waarden en OP50 bacteriën concentraties kunnen worden vastgesteld door het plotten van OD 600 als een functie van bacteriële concentratie (cfu / ml) en het uitvoeren van een lineaire regressie analyse (figuur 1). </li></ol> Oplossingen: <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Luria Broth (LB), 1L: </td></tr><tr><td> 10 g </td><td> Bacto-trypton </td></tr><tr><td> 5 g </td><td> Gist Extract </td></tr><tr><td> 10 g </td><td> NaCl </td></tr></tbody></table> Voeg gedeïoniseerd water aan 1L. Autoclaaf en bewaren bij kamertemperatuur. 2. Bereiding van vaste plaat op basis van calorische restrictie (SDR) platen Dit gedeelte beschrijft de bereiding van platen voor gebruik in vaste-plaat op basis van calorische restrictie (SDR) experimenten. Normaal gesproken, vinden we een bacterie concentratie van 1 x 10 11 cfu / ml als de ad libitum voeren conditie en 1 x 10 8 CFU / ml als de optimale DR voeden voorwaarde voor deze methode. Echter, 4-6 mei verschillende bacteriën concentraties nodig zijn om een ​​volledige dosis-afhankelijke relatie voor SDR en de reacties vast te stellen. <ol><li> Inoculeren een enkele kolonie van E. Coli-bacteriën in OP50 3 ml vloeibare LB bouillon. </li><li> Plaats de OP50 cultuur in 37 ° C shaker en laat de bacteriën om te groeien voor 6-8 uur. </li><li> Breng de OP50 cultuur tot een nieuwe kolf met 500 ml LB-bouillon, en terug plaatsen van de OP50 cultuur in 37 ° C shaker 's nachts. </li><li> Meet de OD 600 van de OP50 cultuur om de bacteriën concentratie (de concentratie wordt berekend met behulp van de ijkcurve gegenereerd in deel 1) te bepalen. Van geschikte verdunningen kan nodig zijn voor een nauwkeurige meting van absorptie. </li><li> Pellet OP50 bacteriën door centrifugeren bij 1500 g gedurende 20 minuten. </li><li> Resuspendeer bacteriën om een concentratie van 1 x 10 12 cfu / ml. </li><li> Bereid 10 ml bacteriecultuur in zes verschillende concentraties: 1 x 10 12, 10 11, 10 10, 10 9, 10 8, 10 7 cfu / ml. </li><li> Pipetteer 0,2 ml van bacteriën cultuur in het midden van een 60 mm gestold NGM plaat. Vermijd het aanraken van het oppervlak van de plaat met pipetpunt, zoals inkepingen op het oppervlak wormen laten ingraven in de agar platen. </li><li> Plaats platen in 37 ° C incubator gedurende 1 uur. </li><li> Van toepassing zijn 10μL van 100mg/ml carbenicilline en 10 pi van 50mg/mL kanamycine om elke plaat om de groei van de bacteriën te arresteren. </li><li> Store platen met verschillende concentraties van antibiotica-gedode bacteriën bij 4 ° C voor toekomstig gebruik (tot een maand). Het is belangrijk om voor te bereiden en genoeg platen op te slaan voor de gehele geplande experiment ten minste 1-2 dagen vooruit. Met behulp van de dezelfde partij platen voor de gehele experimenten is de voorkeur. </li><li> Te controleren of de levensvatbaarheid van de bacteriën, schraap sommige bacteriën uit de SDR borden en verdeel het op een lege NGM plaat met carbenicilline en kanamycine. Plaats de plaat in 37 ° C incubator gedurende 6-8 uur en controleer vervolgens voor de groei van de bacteriën (geen groei van bacteriën moeten in acht worden genomen). </li></ol> Oplossingen <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Nematoden Groei Media (NGM), 1L: </td></tr><tr><td> 3 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 2,5 g </td><td> Bacto-Pepton </td></tr><tr><td> 20g </td><td> Agar-agar </td></tr></tbody></table>ove_content "&gt; autoclaaf gedurende 40 minuten en laat afkoelen tot 65 ° C te laten, dan toe te voegen: <table border="1"><tbody><tr><td> 1 mL </td><td> 1 M MgSO 4 </td></tr><tr><td> 1 mL </td><td> 1 M CaCl 2 </td></tr><tr><td> 1 mL </td><td> 5 mg / ml Cholesterol </td></tr><tr><td> 25 ml </td><td> 1M kaliumfosfaat, pH 6,0 </td></tr></tbody></table> Onmiddellijk Giet vloeibaar NGM op 60 mm x 15 mm petrischalen in 10 ml aliquots 3. Het opzetten van experimenten SDR Voor de meeste van de SDR-gerelateerde studies, zoals de levensduur analyse en vruchtbaarheid profilering, de voorbereiding van een leeftijd-gesynchroniseerde bevolking van wormen is essentieel. Voor andere studies, alleen de overdracht van wormen uit een reguliere OP50 plaat om een ​​SDR plaat om de calorische restrictie te starten. In dit gedeelte is een protocol om het opzetten van een levensduur analyse voor SDR dieren omschreven als een voorbeeld. <ol><li> Gebruik een platina worm picker tot 20-30 Reproductief actieve volwassenen op een aantal reguliere NGM platen overdracht met OP50. Afhankelijk van het aantal eieren die nodig zijn voor de experimenten, kan meer volwassenen nodig zijn. </li><li> Laat de platen bij 20 ° C gedurende 4 uur om eieren leggen. </li><li> Haal de volwassenen uit de plaat. De platen moeten visueel worden geïnspecteerd op eieren. </li><li> Laat de platen bij 20 ° C en laat het nageslacht te ontwikkelen in de Late-L4/day een volwassen stadium. Meestal is dit duurt 3 dagen voor N2 wilde soorten wormen bij 20 ° C. </li><li> Overdracht van een geschikt aantal dagen een volwassenen op SDR plaat om de calorische restrictie te starten. </li><li> Voor een levensduur analyse, het opzetten van een totaal van 6-8 platen met 10-20 wormen per plaat voor elke SDR conditie. </li><li> Score de levensvatbaarheid van elke worm om de 2 dagen totdat alle wormen zijn gestorven. Het is cruciaal dat de wormen worden overgedragen aan verse SDR platen om 12-48 uur in beslag onthouding van voedsel te voorkomen. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Weergegeven in figuur 1 is een plot van een representatieve ijklijn voor de schatting van de OP50-concentratie in verhouding tot OD 600. De vergelijking die door liner regressie-analyse kan worden gebruikt voor alle toekomstige berekeningen van OP50 bacteriën concentraties. Weergegeven in figuur 2 is een voorbeeld van het testen van het effect van chronische BTR behandelingen op de gemiddelde levensduur van de verschillende stammen worm. De blauwe lijn vertegenwoordigt een normale dosis-afhankelijke respons van de wild-type wormen naar SDR. De rode lijn geeft aan dat de levensduur effect van SDR gedeeltelijk wordt onderdrukt door DRR-2 oe, terwijl de daf-16 (mu86) heeft geen effect op de SDR-geïnduceerde levensduur extensie. Detail methode voor het uitvoeren levensduur analyse in C. elegans is beschreven in de voorgaande literatuur 1-3. <img src="/files/ftp_upload/2701/2701fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Vertegenwoordiger resultaat van een kalibratie-curve voor de raming van E. Coli OP50 concentratie. OP50 concentratie is uitgezet als functie van de gemeten OD 600 waarden. Foutbalken = SD Overnight bacteriële cultuur werd verdund 1.5x, 2x, 4x, 8x, 16x, 32x voor absorptie meting, en verder verdund 1000 x twee keer eerder cfu meting. <img src="/files/ftp_upload/2701/2701fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Vertegenwoordiger gevolg van een C. elegans levensduur experiment vergelijken van wild-type N2 dieren (blauw) met twee verschillende mutanten (groen en rood) in reactie op de SDR (figuur uit Ching et al.. 4). Foutbalken = SEM

<ol><li>Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aging+and+age-related+disease+by+DAF-16+and+heat-shock+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor.</a> Science. 300, 1142-1145 (2003).</li>
<li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li>
<li>Apfeld, J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lifespan+by+sensory+perception+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of lifespan by sensory perception in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 402, 804-809 (1999).</li>
<li>Ching, T. T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((drr-2+encodes+an+eIF4H+that+acts+downstream+of+TOR+in+diet-restriction-induced+longevity+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">drr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans.</a> Aging Cell. 9, 545-557 (2010).</li>
<li>Weindruch, R., Walford, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeindruch%2C+R+%22The+Retardation+of+Aging+and+Disease+by+Dietary+Restriction%22">The Retardation of Aging and Disease by Dietary Restriction</a>. , Thomas. (1988).</li>
<li>Masoro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subfield+history%3A+caloric+restriction%2C+slowing+aging%2C+and+extending+life%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Aging+Knowledge+Environ%22%5BJournal%5D)">Subfield history: caloric restriction, slowing aging, and extending life.</a> Sci Aging Knowledge Environ. , RE2-RE2 (2003).</li>
<li>Masoro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+caloric+restriction+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Overview of caloric restriction and ageing.</a> Mech Ageing Dev. 126, 913-922 (2005).</li>
<li>Houthoofd, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axenic+growth+up-regulates+mass-specific+metabolic+rate%2C+stress+resistance%2C+and+extends+life+span+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Axenic growth up-regulates mass-specific metabolic rate, stress resistance, and extends life span in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 37, 1371-1378 (2002).</li>
<li>Houthoofd, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+reduction+of+metabolic+rate+in+food+restricted+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">No reduction of metabolic rate in food restricted Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 37, 1359-1369 (2002).</li>
<li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li>
<li>Bishop, N. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+neurons+mediate+diet-restriction-induced+longevity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Two neurons mediate diet-restriction-induced longevity in C. elegans.</a> Nature. 447, 545-549 (2007).</li>
<li>Panowski, S. H., Wolff, S., Aguilaniu, H., Durieux, J., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHA-4%2FFoxa+mediates+diet-restriction-induced+longevity+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PHA-4/Foxa mediates diet-restriction-induced longevity of C. elegans.</a> Nature. 447, 550-555 (2007).</li>
<li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+caloric+restriction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13091-13096 (1998).</li>
<li>Kaeberlein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans+by+complete+removal+of+food%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food.</a> Aging Cell. 5, 487-494 (2006).</li>
<li>Greer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+AMPK-FOXO+pathway+mediates+longevity+induced+by+a+novel+method+of+dietary+restriction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in C. elegans.</a> Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).</li>
</ol>

Dieetbeperking (DR) is bekend dat de levensduur te verhogen en het begin van verschillende leeftijd gerelateerde ziekten vertraging in een breed scala aan soorten, waaronder zoogdieren 5-7. Zowel de milieu-en genetische manipulaties zijn gebruikt om het model DR in C. elegans, waaronder het kweken van wormen in een semi-gedefinieerde vloeibaar medium 8,9, verdunning van de bacteriële voedselbron in vloeibaar medium 10-12, en het gebruik van het gedrag van mutanten die zich voede...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Carbenicilline </td><td> Duchefa Biochemie </td><td> C0109.25 </td><td> Opgelost in water. </td></tr><tr><td> Kanamycine </td><td> Roche </td><td> 10106801001 </td><td> Opgelost in water. </td></tr><tr><td> Bacto-pepton </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> DF0118072 </td><td></td></tr><tr><td> Bacto-trypton </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> DF0123075 </td><td></td></tr><tr><td> Bacto-gistextract </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> DF0127071 </td><td></td></tr><tr><td> Agar-agar </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> DF00145170 </td><td></td></tr><tr><td> Steriel cultuur buis </td><td> USA Wetenschappelijke </td><td> 1485-0810 </td><td></td></tr><tr><td> Spectrofotometer </td><td> Amersham Biosciences </td><td> Gene Quant pro </td><td> Amersham is nu onderdeel van GE Healthcare. </td></tr><tr><td> Ontleden Microscoop </td><td> Zeiss </td><td> STEMI 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> Accuspin FR </td><td></td></tr></tbody></table>

solid plate-based dieetbeperking in caenorhabditis elegans</em

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Vermindering van de voedselinname, zonder ondervoeding of honger is bekend dat de levensduur te verhogen en het begin van verschillende leeftijd gerelateerde ziekten in een breed scala aan soorten, waaronder zoogdieren vertraging. Het veroorzaakt ook een afname in lichaamsgewicht en de vruchtbaarheid, maar ook lagere niveaus van plasma glucose, insuline en IGF-1 in deze dieren. Deze behandeling wordt vaak aangeduid als calorische restrictie (DR) of calorische restrictie (CR). De nematode Caenorhabditis elegans heeft zich ontpopt als een belangrijk modelorganisme voor het bestuderen van de biologie van veroudering. Zowel de milieu-en genetische manipulaties zijn gebruikt om het model DR en hebben aangetoond dat de levensduur te verlengen in C. elegans. Echter, veel van de gerapporteerde DR studies in C. elegans werden gedaan door het propageren van dieren in vloeibare media, terwijl de meeste van de genetische studies in de verouderende gebied werden gedaan op de standaard solide agar in petri-platen. Hier presenteren wij een DR-protocol met behulp van standaard solid NGM agar-based bord met gedode bacteriën.

Hier presenteren wij een protocol voor het uitvoeren van solide plaat op basis van dieetbeperking in<em&gt; C. elegans</em&gt; Met gedode bacteriën.

Solid Plate-based dieetbeperking in Caenorhabditis elegans</em

Het is bekend dat de vermindering van de voedselinname zonder ondervoeding of uithongering de levensduur verlengt en het begin van diverse ouderdomsgerelateerde ziekten uitstelt in een breed...

De procedure voert een dieetbeperking uit op de standaard abased-plaat in sea elegance om het effect ervan op de levensduur, reproductie en het metabolisme te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst nauwkeurig de concentratie van de bacteriën te meten die als voedselbron zullen dienen. De tweede stap van de procedure is het correct verdunnen van de bacteriecultuur tot geschikte concentraties.Bereid vervolgens basale SDR-platen voor met gedode bacteriën. Stel tot slot SDR-experimenten op met een leeftijdgesynchroniseerde populatie wormen. De resultaten van de metingen van de nakomelingenproductie en de levensduur kunnen een vertraagde en verminderde nakomelingenproductie laten zien, evenals een verhoogde gemiddelde levensduur.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van methoden zoals Dian in AZA-medium, is dat het gehele experiment wordt uitgevoerd op een standaard vaste AGA-plaat die door de meeste laboratoria voor onderzoek naar warmte wordt gebruikt. Voor experimenten met dieetrestrictie moeten aparte kalibratiecurves worden opgesteld voor elke bacteriestam die als voedselbron wordt gebruikt. Neem een enkele kolonie e coli OP 50-bacteriën van een verse uitstrijkplaat op lb-agar en inoculeer drie milliliter vloeibare lb-bouilloncultuur in een schudincubator bij 37 °C gedurende de nacht. Bereid seriële tweevoudige verdunningen van de overnight-cultuur voor.Meet vervolgens de absorbentie van elke verdunning bij 600 nanometer met een spectrofotometer in drievoud. Verdun elke bacteriële suspensie verder met een factor 1 miljoen; zaai vervolgens 0,4 milliliter van de bacteriële suspensie van elke verdunning gelijkmatig uit op een LB-agarplaat van 100 millimeter en incubeer deze bij 37 graden Celsius gedurende 18 tot 24 uur. Tel het aantal gegroeide bacteriële kolonies op elke plaat om de colony forming units per milliliter voor elk monster te berekenen.Zet nu de OD 600 uit als functie van de bacteriële concentratie en voer een lineaire regressieanalyse uit om de relatie tussen de gemeten OD 600-waarden en de concentraties OP 50-bacteriën vast te stellen. Voor deze methode wordt een bacteriële concentratie van 1 × 10¹¹ CFU per milliliter gebruikt voor de ad libitum voedingsconditie en 1 × 10⁸ CFU per milliliter als optimale DR-voedingsconditie. Er kunnen echter vier tot zes verschillende bacteriële concentraties nodig zijn om een volledige dosisafhankelijke relatie vast te stellen.Voor SDR en de bijbehorende responsen. Bereid een inoculum voor met een enkele kolonie E. coli OP 50-bacteriën in drie milliliter vloeibaar LB-bouillon, gekweekt in een schudincubator bij 37 graden Celsius gedurende zes tot acht uur. Draag de OP 50-cultuur over naar een nieuwe kolf met 500 milliliter LB-bouillon en laat deze indien nodig overnacht groeien totdat de bacteriën verzadiging bereiken.Bereid een geschikte verdunning van de OP 50-kweek voor voor de meting van de absorptie bij OD 600. Om de bacterieconcentratie te bepalen, worden de bacteriën gepellet door centrifugatie bij 1500 Gs gedurende 20 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de bacteriën tot een concentratie van 1 x 10¹² CFU per milliliter.Bereid nu bacteriële culturen van 10 milliliter voor in zes verschillende concentraties, variërend van 1 × 10¹² tot 1 × 10⁷ CFU per milliliter met een pipet. Pipetteer 0,2 milliliter van de bacteriële cultuur in het midden van een gestolde N GM-plaat van 60 millimeter. Voorkom dat de pipetpunt het oppervlak van de plaat raakt, aangezien inkepingen in het oppervlak ervoor zorgen dat wormen in de agar kunnen graven.Plaats de platen gedurende één uur in een incubator bij 37 °C. Voeg vervolgens 10 µL 100 mg/mL carbonic soin en 10 µL 50 mg/mL can mycin aan elke plaat toe om de bacteriële groei te remmen. Bewaar de platen met verschillende concentraties antibiotica die de bacteriën hebben gedood bij 4 °C voor toekomstig gebruik, gedurende maximaal één maand.Het is belangrijk om voldoende platen voor te bereiden en op te slaan, bij voorkeur uit dezelfde batch voor de gehele plant. Voer minimaal één tot twee dagen van tevoren een experiment uit om de levensvatbaarheid van de bacteriën te verifiëren. Schraap wat bacteriën van de SDR-platen en verspreid deze op een lege N GM-plaat met carbonic, sein en antimycine.Plaats de plaat gedurende zes tot acht uur in een incubator van 37 °C en bevestig de afwezigheid van bacteriële groei. Voor de meeste SDR-gerelateerde studies, zoals levensduuranalyse en het profileren van nakomelingenproductie, is de preparatie van een leeftijdgesynchroniseerde populatie wormen essentieel. Gebruik een platina wormpicker om 20 tot 30 reproductief actieve volwassenen over te brengen naar verschillende reguliere NGM-platen.Met OP 50. Afhankelijk van het aantal eieren dat nodig is voor de experimenten, kunnen meer volwassen exemplaren vereist zijn. Laat de platen vier uur bij 20 °C staan om eiafzetting mogelijk te maken.Verwijder de volwassenen van de plaat en inspecteer de platen visueel op eieren. Laat de platen verder incuberen bij 20 °C zodat het nageslacht zich kan ontwikkelen tot het late L4- of dag 1 volwassen stadium. Voor N2 wild-type wormen bij 20 °C duurt dit gewoonlijk drie dagen.Voor de analyse van de levensduur. Breng 10 tot 12 volwassen wormen van één dag oud over naar een SDR-plaat om de dieetrestrictie te starten. Gebruik in totaal 60 tot 100 wormen per SDR-conditie om voldoende statistische kracht te verkrijgen.Beoordeel de levensvatbaarheid van elke worm elke twee tot drie dagen totdat alle wormen zijn gestorven. Het is van groot belang om de wormen om de dag over te brengen naar verse SDR-platen om uithongering te voorkomen. Deze kalibratiecurve zet de OP 50-concentratie uit tegen de OD 600.De vergelijking die is gegenereerd via lineaire regressieanalyse kan worden gebruikt voor alle toekomstige berekeningen van de concentraties OP 50-bacteriën. Deze studie analyseert het effect van chronische SDR-behandelingen op de gemiddelde levensduur van verschillende wormstammen in vergelijking met een normale dosisafhankelijke respons van wild-type wormen op SDR. Het effect van SDR op de levensduur wordt gedeeltelijk onderdrukt door DR 2-overexpressie, terwijl de DAF 16 MU 86-mutatie geen effect heeft op de door SDR geïnduceerde verlenging van de levensduur.Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u Dian uitvoert bij het standaard AGA-gebaseerde spel in sea elegance.

solid-plate-based-dietary-restriction-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het gemak van het behoud en het uitdragen van de...

Basis-<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisatie-en-

&lt;em&gt; Caenorhabditis elegan &lt;/ em&gt; is een bruikbaar model om de functies van meervoudig onverzadigde vetzuren verkennen in ontwikkeling en fysiologie. Dit protocol beschrijft een efficiënte methode van aanvulling van het &lt;em&gt; C. elegans &lt;/ em&gt; dieet van meervoudig onverzadigde vetzuren.

Aanvulling van de voeding van meervoudig onverzadigde vetzuren in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dit protocol beschrijft hoe u het delende cellen binnen een weefsel in Caenorhabditis elegans embryo. Terwijl verschillende protocollen beschrijven hoe afbeelding celdeling in de vroege embryo, dit protocol wordt beschreven hoe u foto celdeling binnen een zich ontwikkelende weefsel tijdens midden late embryogenese.

Visualiseren neuroblast Cytokinese Tijdens<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese

Hier presenteren we een Caenorhabditis elegans -specifieke test die is ontworpen om veranderingen in het koperen aversiegedrag te evalueren en het vermogen om een ​​gemeenschappelijke voedingsbron te lokaliseren, als het organisme zich voortbrengt van een goed gevoed aan hongerige voedingswaarde.

EEN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Voedingsstatus gebaseerde Koper Aversion Assay

Hier presenteren we een kader hebben betrekking op breed scala dieet beperking genexpressie en levensduur. We beschrijven de protocollen voor breed scala dieet beperking en voor kwantitatieve beeldvorming van genexpressie onder dit paradigma. We schetsen verder computationele analyses te onthullen de functies van information processing van de genetische circuits onderliggende betrokken bij voedsel-sensing.

Kwantificering van informatie gecodeerd door Gene Expression niveaus tijdens levensduur modulatie onder breed-scala dieet beperking in C. elegans

Dit protocol laat zien hoe een eiwit nucleaire translocatie onder hittestress bijhouden met behulp van een groene fluorescentie proteïne (GFP) fusieproteïne als merkstof en 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kleuring. De DAPI kleuring protocol is snel en behoudt de GFP en eiwit subcellular localisatie-signalen.

Opsporen van Eiwit Subcellular Localisatie door Green fluorescentie eiwit Tagging en 4', 6-Diamidino-2-phenylindole vlekken in Caenorhabditis elegans

Dit protocol beschrijft een methode voor de grootschalige teelt van Caenorhabditis elegans op solide media. Als alternatief voor vloeibare cultuur kunnen dit protocol verkrijgen van parameters voor verschillende schalen onder plaat gebaseerde teelt. Dit verhoogt de vergelijkbaarheid van de resultaten door het weglaten van de morfologische en metabole verschillen tussen vloeibare en vaste mediacultuur.

Plaat gebaseerde grootschalige teelt van Caenorhabditis elegans: bereiding van de monsters voor de studie van de metabole veranderingen bij Diabetes

Proteostatische achteruitgang is een kenmerk van veroudering en vergemakkelijkt het begin van neurodegeneratieve ziekten. We schetsen een protocol om proteostase kwantificeerbaar te meten in twee verschillende Caenorhabditis elegans-weefsels door heterologe expressie van polyglutamine-herhalingen gefuseerd met een fluorescerende verslaggever. Dit model maakt een snelle in vivo genetische analyse van proteostase mogelijk.

Kwantificering van weefselspecifieke proteostatische achteruitgang van Caenorhabditis elegans

Het volgende protocol beschrijft de ontwikkeling en optimalisatie van een high-throughput workflow voor het kweken van wormen, fluorescentie beeldvorming en geautomatiseerde beeldverwerking om polyglutamine aggregaten te kwantificeren als een beoordeling van veranderingen in proteostase.

Aggregaatkwantificering automatiseren bij Caenorhabditis elegans

Dit is een veelgebruikte methode voor C. elegans gonad-dissectie gevolgd door vriesscheur, die kiembaanmonsters produceert voor immunofluorescentie via antilichaamkleuring, of voor eenvoudige DAPI-kleuring om DNA te visualiseren. Dit protocol is succesvol geweest voor studenten in een onderzoekslaboratorium en in een op cursussen gebaseerde niet-gegradueerde onderzoekservaring.

C. elegans Gonad dissectie en freeze crack voor immunofluorescentie en DAPI-kleuring

Dit protocol beschrijft een test om de voedingssnelheid van Caenorhabditis elegans te kwantificeren op basis van het meten van de klaring van bacteriën in vloeibare cultuur.

Kwantificering van de voedselinname bij Caenorhabditis elegans door de bacteriële klaring te meten

Leer een protocol voor dieetbeperking op vaste plaat bij Caenorhabditis elegans met gedode bacteriën. Deze methode onderzoekt effecten op levensduur, voortplanting en metabolisme.

Solid Plate-based dieetbeperking in Caenorhabditis elegans

Meer video's verkennen