Name: Niet-chirurgische intratracheale Instillatie van Muizen met Analyse van de longen en Lung drainerende lymfeklieren door middel van flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Leer een niet-chirurgische intratracheale instillatiemethode bij muizen voor longimmunologieonderzoek. Deze techniek maakt gerichte toediening van testmaterialen en flowcytometrische analyse van immuuncellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Voordat het proces, voor te bereiden en het verzamelen van de volgende items <ol><li> Verwijzen wij u naar het beeld in figuur 1a) en 1b) voor het bouwen van een houten platform om de muis te beperken tijdens de procedure. </li><li> Spijsvertering mix voor lymfeklieren - HBSS + 1.25mg/ml Collagenase TypeIV of 2,5 mg / ml Collagenase D </li><li> Spijsvertering mix voor de longen - HBSS + 1 mg / ml Collagenase </li><li> Verdunnen latex kralen (01:20) in PBS voor intraperitoneale injectie aan het LDLNs visualiseren </li></ol> Let op: LDLNs zijn klein en moeilijk te vinden. Om te leren hoe ze te vinden, injecteren 200μl van de 1:20 verdunde rode tl-latex bolletjes ip in de muis. Het buikvlies drains om deze LDLNs 8. 24 hpi, bloot de borstholte van de muis zoals hierboven beschreven. Het zal LDLNs blijkt roze van de parels die afgevoerd uit de buikholte. <ol start="5"><li> Rode Bloedcellen (RBC) Lysis Buffer - 0,15 M NH 4 Cl, 10mm KHCO 3, 0,1 mM Na 2 EDTA in 1L dH 2 0. Pas de pH op 7,2-7,4 en bewaar bij kamertemperatuur. </li><li> 70μm of 100 urn zeef cel </li><li> Stock oplossing van 0,5 M EDTA, pH = 8,0 </li><li> HBSS zonder CaCl 2 en MgCl 2 </li><li> Schaar en stompe tang </li><li> Laryngoscoop </li><li> Maagsonde naald (22 gauge) gebogen in een hoek (figuur 2) </li><li> Styrofoam boord en pinnen voor het verspreiden van de muis </li><li> Top pan balans </li><li> Aniline Blue Oplossing - 10mg/ml in H 2 O </li></ol> Opmerking: Wij zullen het gebruik van deze oplossing voor het aantonen van het injectie-techniek. 2. Bereiding en toediening van de muis verdoving <ol><li> Maak een mengsel van Xylazine en ketamine in steriele PBS, zodat de uiteindelijke concentraties zijn respectievelijk 2mg/ml en 10mg/ml. </li><li> Weeg de muis op een top pan balans. </li><li> Bereken de dosis die nodig is voor elke muis. Dosis op Xylazine (2-4 mg / kg) en ketamine (70-80 mg / kg) lichaamsgewicht met geschikte volume van de bereide mengsel en injecteer intaperitoneally. Elke muizenstam kan eisen optimalisatie van de verdoving. Muizen die te veel verdoving kunnen een verminderde ademhaling tarief dat fataal kan zijn na het inoculum wordt bijgebracht in de longen. </li><li> Na 3-5 minuten, leven zij de muis voor de effecten van de narcose. Controleer op de volgende borden te bevestigen dat de muis is volledig verdoofd: <ol><li> De ademhaling moet vertragen. </li><li> De muis moet niet strekken haar arm toen opgepikt door de nek. </li><li> Er mag geen reactie wanneer de achterste ledematen worden gestimuleerd. Als deze criteria niet wordt voldaan, wacht een paar minuten en controleer opnieuw voordat u verder gaat met de volgende stap. </li></ol></li></ol> 3. Intratracheale injectie <ol><li> Bereid de innoculum in 50μl zoutoplossing. Vul een 1ml injectiespuit voorzien van een steriele gebogen maagsonde naald met de innoculum. De spuit moet worden geladen met een 100μl luchtzak achter de innoculum om ervoor te zorgen dat alle van de vloeistof wordt bijgebracht in de longen. </li><li> Plaats de muis op de schuine houten platform opknoping door zijn snijtanden op de draad en het voorzichtig te beperken in plaats met een stuk lint. </li><li> Zet de laryngoscoop met je linkerhand (als je rechts bent overhandigd) en pak een paar stompe einde tang. Gebruik de punt van laryngoscoop en de tang voorzichtig wrikken de mond open. </li><li> Met de tang, trek de tong uit en houd hem aan de kant. Leid de laryngoscoop blad naar de achterkant van de mond. Houd de laryngoscoop ingedrukt heel voorzichtig in een hoek van 90 ° tot u de opening van de luchtpijp. Houd de laryngoscoop op zijn plaats. Voorzichtigheid is geboden bij het trekken van de tong uit de mond en dit moet voorzichtig gebeuren zodat er geen weefsel schade optreedt. </li><li> Met uw andere hand, neem dan de 1 ml spuit met de innoculum, uitgerust met de gebogen naald maagsonde met uw rechter handen en steek de naald in de luchtpijp tot aan de bocht van de naald wordt door de voorste snijtanden. Gelijkmatig Duw de zuiger om de innoculum te leveren. De innoculum mag geen zeepbel. Trek de naald uit de luchtpijp zo snel mogelijk. Muizen zullen stik en sterven als de luchtpijp geblokkeerd is te lang. Houd de muis voor een paar seconden om innoculum te worden geïnhaleerd in de longen. </li><li> Haal de muis uit het platform en plaats het in de buurt van een warmtelamp. Laat geen muizen onder directe warmte voor langere tijd. De muis moet volledig wakker te worden binnen 30 minuten na de procedure (hersteltijd kan variëren op basis van stammen). Muizen te ijverig in acht worden genomen in deze tijd en mag niet worden toegestaan ​​om te warm of te koud is, kan dit ook zet de muizen in ademnood leiden tot de dood. </li></ol> 4. Oogsten en verwerken Lung drainerende lymfeklieren en de longen voor flowcytometrie<ol><li> Offer muizen met de gewenste methode conform de AVMA euthanasie richtlijnen. Dit kan variëren afhankelijk van de individuele oogst resultaten. Toediening van een dodelijke doet van natriumpentobarbital is een voorbeeld van een geschikte euthanasie procedure. We hebben niet gezien negatieve pulmonale effecten van euthanasie door CO 2. </li><li> Pin van de armen en benen aan een dissectie boord. Maak een incisie langs het midden van de ventrale zijde met een schaar. Trek de huid en bloot te leggen van de thoraxwand spieren. </li><li> Maak incisies door de thoraxwand spieren om de buikorganen bloot te leggen. </li><li> Houd de punt van het borstbeen met de tang en prik het middenrif. Knip het membraan langs de zijkanten van de ribbenkast. </li><li> Met de schaar parallel aan de dissectie bord oppervlak, dwars door de borstholte langs de dorso-ventrale lijn aan beide kanten. </li><li> Iets hoger optillen van de ribbenkast. Aan de rechterkant van het hart, net onder de thymus, op zoek naar twee lymfeklieren. Een iets grotere derde lymfeklieren bevindt zich onder een klein arterieel bloedvat dat loodrecht op de luchtpijp. Oogst lymfeklieren in 1 ml van de lymfeklier spijsvertering mix. </li><li> Na het oogsten van de lymfeklieren, houdt u het hart met een pincet en pak de longen met een ander. Oogst longen naar 3 ml van de ijskoude PBS in een 6-wells plaat. </li><li> Scheid de lobben van de longen, aspireer PBS en hak de lobben in kleine stukjes met behulp van een tang en schaar. Voeg 3 ml van de spijsvertering mix voor longen. Houd de 6-wells plaat op het ijs tijdens deze stap. </li><li> Incubeer de lymfeklieren voor 25-30 min en longen gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Voeg EDTA tot een uiteindelijke concentratie van 10 mM aan elk van de spijsvertering mengsels om de reactie en plaats deze op ijs te stoppen. </li><li> Met behulp van een 3 ml spuit, langs delen van de longen door middel van een naald 18GA 3 keer. Pureer de stukjes van de longen en de LNS door middel van 70-100 urn cel zeven met behulp van de achterkant van een 1 ml spuit zuiger. Was de cel zeven met 10 ml van HBSS zonder Ca 2 + en Mg 2 +. Centrifugeer op 500 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer de pellet in 5 ml RBC lysis buffer en incubeer gedurende 3 min bij kamertemperatuur. Voeg 10 ml van HBSS zonder Ca 2 + en Mg 2 + tot lysis lessen. Centrifugeer op 500 xg gedurende 5 minuten. Brengen de longen en LDLN single celsuspensies tot 10 ml en 5 ml respectievelijk. Count levende cellen met behulp van een hemacytometer door trypan blauw uitsluiting. Cellen zijn nu klaar om vlek voor flowcytometrie. Een lob van de long kan voldoende zijn voor flowcytometrie. Andere lobben kan gebruikt worden voor andere experimentele vragen in dezelfde muis, zoals homogenaten voor cytokinen of weefsel voor histologie. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Minst ontwikkelde landen en alveolaire macrofagen in de longen te verwerven antigeen van de alveolaire ruimten van de longen direct na het injectie. Figuur 3 toont het percentage van CD11c + (uitgedrukt op MOL en alveolaire macrofagen) cellen die positief zijn voor fluorescent gelabelde Bacillus anthracis sporen, 30 min na het injectie. Op dit moment is ~ 15,9% van de CD45 + CD11c + cellen in de longen enkele celsuspensie koesterde Bacillus anthracis sporen (figuur 3, onderste panelen). Voor verdere karakterisering van CD11c + cellen in de longen, zie Kim en Braciale 4. Fluorescent gelabelde kralen worden routinematig gebruikt om de smokkel van deeltjes antigenen te beoordelen LDLNs 9. Om dit te beoordelen transport vanuit de longen naar LDLNs, fluorescerend gemaakt latex bolletjes geïnjecteerd met LPS en LDLNs werden geanalyseerd op 24 hpi. Ongeveer 4% van CD11c hi cellen in de LDLNs fluorescerende beads koesterde bij 24hpi (figuur 4). Deze representatieve experimenten tonen aan dat dit protocol kan efficiënt worden gebruikt om de cellen die antigenen ingeademde deeltjes te verwerven track in de longen en vervolgens het verkeer ze naar de LDLNs. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Houten platform voor het fixeren muizen tijdens het injecteren. Een houten blok werd gesneden in een hoek en metalen staven werden gemonteerd, vooraanzicht figuur 1a) en zijaanzicht figuur 1b). Een klein stukje draad was gewikkeld de metalen buis aan de voorkant snijtanden van de muis anker. Een stukje van het lint was verbonden aan het platform te binden rond de muis te houden op zijn plaats tijdens de procedure. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Maagsonde naald voor het injecteren. Een maagsonde naald (rechts) was gebogen in een hoek van ~ 135 ° (links) voor het injectie. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Percentage van alle CD11c + cellen in de longen dat het ingespoten GFP uiten van Bacillus anthracis (Sterne-p6GFP), 5 uur na de uitdaging haven. AJ muizen werden uitdaging met 1x10 8 GFP-Bacillus anthracis sporen en de longen werden geanalyseerd op 5 uur na infectie. De stip kavels tonen percentage van CD11c + long cellen die positief zijn voor Bacillus anthracis. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Detectie van fluorescerende kralen (geel / groen) in de long drainerende lymfeklieren 24 uur na de i. T injectie. AJ muizen kregen ofwel PBS (linker paneel) of 5x10 9 Fluoresbrite YG microsferen (0.5μm) met 10μg LPS (rechter paneel) het en LDLNs werden geanalyseerd 24hpi. Vertegenwoordiger dot plots tonen percentage van CD11c hi cellen in de LDLNs dat de haven fluorescerende beads uitgezet tegen een leeg kanaal.

<ol><li>Grayson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+for+lung+dendritic+cell+maturation+and+migration+during+respiratory+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection.</a> J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).</li>
<li>GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor+between+dendritic+cell+subsets+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Division of labor between dendritic cell subsets of the lung.</a> Mucosal Immunol. 1, 442-442 (2008).</li>
<li>Bar-Haim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelationship+between+dendritic+cell+trafficking+and+Francisella+tularensis+dissemination+following+airway+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Interrelationship between dendritic cell trafficking and Francisella tularensis dissemination following airway infection.</a> PLoS Pathog. 4, e1000211-e1000211 (2008).</li>
<li>Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+dendritic+cell+subsets+differ+in+their+capacity+to+support+the+induction+of+virus-specific+cytotoxic+CD8%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Respiratory dendritic cell subsets differ in their capacity to support the induction of virus-specific cytotoxic CD8+ T cell responses.</a> PLoS One. 4, e4204-e4204 (2009).</li>
<li>Bakocevic, N., Worbs, T., Davalos-Misslitz, A., Forster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dendritic+cell+interaction+dynamics+during+the+induction+of+respiratory+tolerance+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell-dendritic cell interaction dynamics during the induction of respiratory tolerance and immunity.</a> J Immunol. 184, 1317-1317 (2010).</li>
<li>Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+particle+size+on+the+pathology+and+efficacy+of+vaccination+in+a+murine+model+of+inhalational+anthrax%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of particle size on the pathology and efficacy of vaccination in a murine model of inhalational anthrax.</a> J Med Microbiol. , (2010).</li>
<li>Kiyono, H., Fukuyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NALT-+versus+Peyer%27s-patch-mediated+mucosal+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">NALT- versus Peyer's-patch-mediated mucosal immunity.</a> Nat Rev Immunol. 4, 699-699 (2004).</li>
<li>Parungo, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+drainage+of+the+peritoneal+space%3A+a+pattern+dependent+on+bowel+lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Lymphatic drainage of the peritoneal space: a pattern dependent on bowel lymphatics.</a> Ann Surg Oncol. 14, 286-286 (2007).</li>
<li>Jakubzick, C., Helft, J., Kaplan, T. J., Randolph, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+methods+to+study+pulmonary+dendritic+cell+migration+reveals+distinct+capacities+of+DC+subsets+to+acquire+soluble+versus+particulate+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of methods to study pulmonary dendritic cell migration reveals distinct capacities of DC subsets to acquire soluble versus particulate antigen.</a> J Immunol Methods. 337, 121-121 (2008).</li>
<li>Higgins, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+levels+of+M-CSF+and+GM-CSF+influence+the+specific+generation+of+macrophage+populations+during+infection+with+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Relative levels of M-CSF and GM-CSF influence the specific generation of macrophage populations during infection with Mycobacterium tuberculosis.</a> J Immunol. 180, 4892-4892 (2008).</li>
<li>Kool, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alum+adjuvant+boosts+adaptive+immunity+by+inducing+uric+acid+and+activating+inflammatory+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells.</a> J Exp Med. 205, 869-869 (2008).</li>
<li>Costa, D. L., Lehmann, J. R., Harold, W. M., Drew, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transoral+tracheal+intubation+of+rodents+using+a+fiberoptic+laryngoscope%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Transoral tracheal intubation of rodents using a fiberoptic laryngoscope.</a> Lab Anim Sci. 36, 256-256 (1986).</li>
<li>Takahashi, S., Patrick, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+lymphatic+drainage+to+individual+thoracic+and+cervical+lymph+nodes+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Patterns of lymphatic drainage to individual thoracic and cervical lymph nodes in the rat.</a> Lab Anim. 21, 31-31 (1987).</li>
<li>Broeck, W. V. anden, Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes%3A+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB%2FcAnNCrl+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-12 (2006).</li>
</ol>

We hebben dit protocol gebruikt om de smokkel van Bacillus anthracis sporen van de longen naar de LDLNs bestuderen. Voor soortgelijke toepassingen, moet het aantal deeltjes geleverd aan de longen zorgvuldig worden gekozen, zodat de geïnjecteerde materiaal kan worden gedetecteerd in de LDLNs door flowcytometrie. We hebben ook met succes gebruik gemaakt van deze methode voor adoptieve overdracht van cellen en etikettering van specifieke long celpopulaties met behulp van fluorescent gelabelde antilichamen. Bovendi...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> 70μm Cel stariner </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Aniline Blue </td><td> Visser </td><td> A967-25 </td><td></td></tr><tr><td> Animal Feeding naald </td><td> Popper en Sons Inc </td><td> 7920 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> Sigma </td><td> C2139 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase TypeIV </td><td> Worthington </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> Roche </td><td> 11088974103 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite YG microsferen (0.5μm) </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 17152 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS zonder calciumchloride en magnesiumchloride </td><td> Invitrogen </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamine HCl (100mg/ml) </td><td> Hospira Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laryngoscoop Blade </td><td> PennCentury, Inc </td><td> Voor Model LS-1 </td><td> Verwijzen naar <a href="http://www.penncentury.com">www.penncentury.com</a> </td></tr><tr><td> Lichtgewicht Fiber Optic laryngoscoop </td><td> WelchAllyn </td><td> 80814 </td><td></td></tr><tr><td> Rode TL-Beads (0.5μm) </td><td> Invitrogen </td><td> F8812 </td><td> Voor ip injectie </td></tr><tr><td> Xylazine (100mg/ml) </td><td> Lloyd Laboratories </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

niet-chirurgische intratracheale instillatie van muizen met analyse van de longen en lung drainerende lymfeklieren door middel van flowcytometrie

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Fagocyterende cellen zoals alveolaire macrofagen en longen dendritische cellen (MOL&#39;s) continu monster antigenen van de alveolaire ruimten in de longen. MOL, in het bijzonder, staan ​​bekend om te migreren naar de longen drainerende lymfeklieren (LDLNs), waar zij aanwezig is ingeademd antigenen aan T-cellen het openen van een juiste immuunreactie op een verscheidenheid van immunogenen 1,2. Voor het modelleren van interacties tussen de longen en in de lucht antigenen in muizen, kunnen antigenen intranasaal 1,3,4 worden toegediend, intratracheaal 5 of de vorm van aërosolen 6. Levering door elke route houdt in verschillende technische vaardigheden en beperkingen die moeten worden genomen voordat het ontwerpen van een experiment. Bijvoorbeeld, intranasale en aerosolized blootstelling levert antigenen aan zowel de longen en de bovenste luchtwegen. Vandaar dat antigenen kunnen toegang krijgen tot de neus daarmee verbonden lymfoïd weefsel (nalt) 7, potentieel bemoeilijkt de interpretatie van de resultaten. Daarnaast kunnen slikken, niezen en de ademhaling van de muis ook leiden tot inconsistenties in de geleverde doses. Hoewel de betrokkenheid van de bovenste luchtwegen kan de voorkeur voor sommige studies, kan het bemoeilijken experimenten gericht op gebeurtenissen die specifiek ingewijd in de longen. In deze instelling van de intratracheale (het) route de voorkeur omdat het testen van materialen levert direct in de longen en omzeilt de nalt. Velen injectie protocollen betrekking hebben op een blinde intubatie van de luchtpijp via de mondholte of chirurgische blootstelling van de luchtpijp naar de longen te openen. Hierin beschrijven we een eenvoudige, consistente, niet-chirurgische methode voor het instillatie. De opening van de luchtpijp wordt gevisualiseerd met behulp van een laryngoscoop en een gebogen naald maagsonde wordt dan rechtstreeks in de luchtpijp naar de innoculum te leveren. We beschrijven ook de procedures voor het oogsten en verwerken van LDLNs en longen voor de analyse van antigeen handel door flowcytometrie.

We illustreren niet-chirurgische levering van testmateriaal in de longen van verdoofde muizen via de luchtpijp. Deze methode laat long blootstelling aan bacteriële en virale pathogenen, cytokines, antistoffen, kralen, chemicaliën of kleurstoffen. We verder beschrijven oogst en verwerking van de longen en longen drainerende lymfeklieren (LDLNs) voor flowcytometrie.

Niet-chirurgische intratracheale Instillatie van Muizen met Analyse van de longen en Lung drainerende lymfeklieren door middel van flowcytometrie

Fagocytaire cellen, zoals alveolaire macrofagen en longdendritische cellen (LDC's), monitoren continu antigenen uit de alveolaire ruimten in de longen. LDC's, ...

Het algemene doel van deze procedure is om testmateriaal op een niet-chirurgische wijze in de longen van muizen in te brengen met behulp van een sondeernaald en vervolgens de longen en de drainerende lymfeklieren van de longen te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst een verlichte laryngoscoop en een gebogen sondeernaald in de trachea van een geanestheseerde muis in te brengen. Het testmateriaal wordt vervolgens via de laryngoscoop en de sondeernaald in de longen van het dier geïnstilleerd.Vervolgens worden de longen en de drainerende lymfeklieren verwijderd. Ten slotte worden de longen en lymfeklieren verwerkt tot enkelcel-suspensies. Uiteindelijk faciliteert deze methode flowcytometrische analyse van de associatie van het testmateriaal met immuuncellen in de longen en van de migratie van de cellen naar de drainerende lymfeklieren van de longen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals intranasale en geaerosoleerde blootstelling, is dat het een gerichte toediening van het testmateriaal in de longen mogelijk maakt, waarbij het neus-geassocieerde lymfoïde weefsel wordt omzeild. Daarnaast is het eenvoudiger uit te voeren dan chirurgische ingrepen bij ratten voor intratracheale installatie. De procedure wordt gedemonstreerd door Elizabeth Enti, een postdoc in het lab van Richie, en Manji, een promovendus in het lab van Lens.Nadat de muis is geanestheseerd, wordt het inoculum voorbereid in 50 µL fysiologische zoutoplossing. Vul een spuit van 1 ml, voorzien van een steriele gebogen sondeer-naald, met het inoculum. Voorzie de spuit van een luchtbel van 100 µL achter het inoculum om ervoor te zorgen dat alle vloeistof in de long wordt gebracht.Plaats de muis op het schuine houten platform, waarbij deze met de snijtanden aan het draad hangt, en fixeer de muis voorzichtig op zijn plaats met een lintje. Zet vervolgens met één hand de laryngoscoop aan en pak met de andere hand een pincet met stompe uiteinden. Gebruik de punt van de laryngoscoop en het pincet om de bek voorzichtig open te wrikken.Trek de tong naar buiten en houd deze opzij. Leid het blad van de laryngoscoop naar de achterkant van de mond. Houd de laryngoscoop heel voorzichtig onder een hoek van 90 graden naar beneden gedrukt totdat de opening van de trachea zichtbaar is.Houd met één hand de laryngoscoop op zijn plaats en neem met de andere hand de injectiespuit van 1 mL, voorzien van de gebogen sondeernaald met het inoculum. Voer de naald in de trachea in totdat de knik in de naald zich ter hoogte van de voortanden bevindt. Duw de zuiger gelijkmatig in om het inoculum zonder belletjes toe te dienen.Verwijder de naald zo snel mogelijk uit de trachea. Houd de muis enkele seconden rechtop zodat het inoculum in de longen kan worden geïnhaleerd. Plaats de muis bij een warmtelamp en laat het dier ontwaken.Pin na euthanasie de armen en benen van de muis vast op een dissectieplank. Maak met een schaar een incisie langs het midden van de ventrale zijde. Trek de huid voorzichtig opzij om het peritoneum bloot te leggen.Maak incisies in het peritoneum om de abdominale organen bloot te leggen. Houd de punt van het sternum vast met de pincet en punctureer het diafragma met de schaar. Knip het diafragma langs de zijkanten van de ribbenkast door, waarbij de schaar parallel aan het oppervlak van de dissectieplaat wordt gehouden.Snijd door de borstholte langs de dorsoventrale lijn aan beide zijden lichtjes in. Til de ribbenkast aan de rechterzijde van het hart op. Zoek net onder de thymus naar twee lymfeklieren.Een derde, iets grotere lymfeknoop bevindt zich onder een klein arterieel bloedvat dat loodrecht op de trachea loopt. Oogst de lymfeklieren in één milliliter lymfeknoopsdigestie, meng en plaats op ijs. Oogst na het oogsten van de lymfeklieren de longen in een plaat met zes putjes.Houd de six-wellplaat op ijs, aspireer de PBS en knip de lobben met een pincet en een schaar in kleine stukjes. Houd elke lymfeklier vast met een naald van 26 gauge en scheur deze uit elkaar met een tweede naald van 26 gauge. Om de vrijgave van alle cellen te garanderen, voegt u drie milliliters van het digestiemengsel voor longen toe en één milliliter voor de lymfeklieren.Nadat de lymfeklieren 25 tot 30 minuten en de longen 30 minuten zijn geïncubeerd bij 37 °C, voegt u EDTA toe aan een eindconcentratie van 10 mM aan elk van de digestiemengsels om de reactie te stoppen, en plaatst u deze vervolgens op ijs. Gebruik een spuit van 3 mL om stukjes longweefsel door een naald van 18 gauge te persen. Prak de stukjes longweefsel en de lymfeklieren drie keer door celzeefjes van 70 tot 100 µm.Was de cellzeven met 10 milliliters HBSS zonder calcium en magnesium centrifuge met behulp van de achterkant van een zuiger van een spuit van één milliliter. Centrifugeer de celmonsters bij 500 times gravity gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Resuspendeer de pellets in vijf milliliters lysebuffer voor rode bloedcellen en incubeer gedurende drie minuten.Voeg bij kamertemperatuur 10 milliliter HBSS zonder calcium en magnesium toe om de lysis te stoppen en centrifugeer de monsters bij 500 ×g gedurende vijf minuten. Breng de enkelcel-suspensies van de long en de drainerende lymfeklieren van de long respectievelijk aan tot 10 milliliter en vijf milliliter. Gebruik trypannenblauw-exclusie in een hemocytometer om de cellen te tellen.In deze twee figuren werden AJ-muizen geïnfecteerd met 1 x 10⁸ Bacillus anthracis-sporen, en de longen werden 30 minuten na infectie geanalyseerd via flowcytometrie. Deze dot-plots tonen de gating-strategie. Deze panelen tonen het percentage CD45-positieve CD11c-positieve longcellen die positief zijn voor Bacillus anthracis-sporen.In deze figuur werden AJ-muizen intratracheaal geïnjecteerd, waarna hun longdrainerende lymfeklieren werden geanalyseerd. Representatieve dotplots tonen het percentage CD 11 C high-cellen in de longdrainerende lymfeklieren die fluorescerende beads bevatten, uitgezet tegen een leeg kanaal. Het linkerpaneel toont de resultaten van muizen die werden geïnjecteerd met PBS, en het rechterpaneel toont de resultaten van muizen die werden geïnjecteerd met 5 × 10⁹ fluorescerende geelgroene microsferen met 10 µg LPS.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in dit vakgebied, zoals welke gebeurtenissen specifiek in de longen worden geïnitieerd en hoe geïnhaleerde antigenen vanuit de longen naar de drainerende lymfeklieren worden getransporteerd.

non-surgical-intratracheal-instillation-mice-with-analysis-lungs-lung

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Het gebruik van een model dat de toestand van longziekten bij mensen nabootst is kritiek voor het bestuderen van de pathofysiologie en / of etiologie van een bepaalde ziekte en ontwikkelen van therapeutische interventie. Hier een niet-invasieve intratracheaal intubatie methode die direct exogene materialen kunnen leveren aan muizenlongen wordt gepresenteerd.

Niet-invasieve Intratracheaal intubatie om te studeren de Pathologie en Fysiologie van Mouse Lung

De gastheer immuunrespons op pathogene infectie een strak gereguleerd proces. Met behulp van een lipopolysaccharide long exposure model in muizen, is het mogelijk om hoge resolutie evaluaties van de complexe mechanismen van pathogenese voeren.

Het gebruik van Oropharyngeal Intratracheaal PAMP Administratie en bronchoalveolaire lavage om de immuunrespons van de gastheer in Muizen Evalueer

Intratracheale intubatie-gemedieerde (IMIT) instillatie van reagentia is een uitstekend invasieve methode voor het bestuderen ademhalingsziekte, alsmede een werkwijze voor het indruppelen therapeutische reagentia direct in de longen. Het is een snelle en zeer reproduceerbare werkwijze die geschikt is voor preklinische proeven.

Intubatie-gemedieerde Intratracheaal (IMIT) Blaasinstillatie: een niet-invasieve, Lung-specifieke Delivery System

Het doel van dit artikel is om eenvoudige methoden die sterk zal helpen bij de opzet en analyse van de muis longen met longkanker of andere aandoeningen te beschrijven. We presenteren 3 protocollen eenvoudig en betrouwbaar uit te voeren long instillaties, fixatie, en longvolume metingen.

Instillatie en Fixatie Methoden Nuttig in Mouse Lung Cancer Research

Dit artikel presenteert een snelle en eenvoudige methode voor het toedienen van bleomycine rechtstreeks in de muis luchtpijp via intubatie. Belangrijkste voordelen van deze werkwijze zijn dat het zeer reproduceerbaar, gemakkelijk onder de knie, en vereist geen gespecialiseerde apparatuur of lange hersteltijden.

Een verbeterde werkwijze voor snelle intubatie van de trachea in muizen

We beschrijven een werkwijze voor het precisie-cut Lung Schijfjes (PCLS) en immunokleuring ze naar de lokalisatie van diverse immuun celsoorten te visualiseren in de longen. Ons protocol kan worden uitgebreid tot de locatie en de functie van vele verschillende celtypen te visualiseren onder verschillende omstandigheden.

Precisie-cut Mouse Lung Slices Live Pulmonary visualiseren van dendritische cellen

Hier beschrijven we een minimaal invasieve syngeneic orthotopic transplantatie model van muis Long adenocarcinoom cellen als een tijd - en kostenbesparende model om te studeren niet-kleincellige longkanker.

Orthotopic transplantatie van Syngeneic Long adenocarcinoom cellen te bestuderen van PD-L1 expressie

Intratracheal (IT) toediening van experimentele agentia bij muizen resulteert vaak in asymmetrische afgifte aan de distale longen.  In dit rapport beschrijven we een directe intrabronchiale (IB) benadering om elke Long in levende muizen niet-operatief te cannuleren.  Deze aanpak kan worden gebruikt om agenten selectief te beheren tot één Long of kan worden aangepast om de symmetrische agent levering aan beide longen te verbeteren.

Directe Intrabronchiale toediening om de selectieve depositie van de agent binnen de muis Long te verbeteren

In deze studie presenteren we een effectief en reproduceerbaar protocol om de immuunpopulaties van het muriene ademhalingssysteem te isoleren. We bieden ook een methode voor de identificatie van alle aangeboren en adaptieve immuuncellen die zich in de longen van gezonde muizen bevinden, met behulp van een op 9 kleuren gebaseerd flowcytometriepaneel.

Flowcytometrische analyse voor identificatie van de aangeboren en adaptieve immuuncellen van muizenlong

Hier stellen we een protocol voor intratracheale lipopolysaccharide (LPS) levering via niet-invasieve orofaryngeale endotracheale intubatie. Deze methode minimaliseert het trauma van de chirurgische procedure voor het dier en levert LPS nauwkeurig af aan de luchtpijp en vervolgens aan de longen.

Niet-invasieve intratracheale lipopolysaccharide-instillatie bij muizen

Het muizen intrapulmonale tracheale transplantatie (IPTT) model is waardevol voor het bestuderen van obliteratieve luchtwegaandoeningen (OAD) na longtransplantatie. Het biedt inzicht in longspecifiek immunologisch en angiogeen gedrag bij luchtwegvernietiging na allotransplantatie met een hoge reproduceerbaarheid. Hier beschrijven we de IPTT-procedure en de verwachte resultaten.

Intrapulmonale tracheale transplantatie bij muizen: een model voor het onderzoeken van obliteratieve luchtwegaandoeningen na longtransplantatie

Leer een niet-chirurgische intratracheale instillatiemethode bij muizen voor longimmunologieonderzoek. Deze techniek maakt gerichte toediening van testmaterialen en flowcytometrische analyse van immuuncellen mogelijk.

Niet-chirurgische intratracheale Instillatie van Muizen met Analyse van de longen en Lung drainerende lymfeklieren door middel van flowcytometrie (Video) | JoVE Journal

Niet-chirurgische intratracheale Instillatie van Muizen met Analyse van de longen en Lung drainerende lymfeklieren door middel van flowcytometrie

Meer video's verkennen