Name: Zeven Stappen naar cellen stellatum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Leer hepatic stellate cellen isoleren uit muizenlever met enzymperfusie en dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Deze methode levert zuivere cellen op voor leveronderzoek en celbiologische studies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de familie Smith Award for Excellence in biomedisch onderzoek en NIH RO1 AI083426-01 (FW). Patrick Maschmeyer en Melanie Flach worden ondersteund door PhD beurzen van de Boehringer Ingelheim Foundation.

C57BL / 6 muizen worden gebruikt op ~ 20 weken oud of ouder. Het gebruik van de mannelijke muizen met een gewicht van 25 30g wordt aanbevolen. De opbrengst van stellaatcellen kan verhoogd worden door het voeren van muizen een vitamine A-verrijkt dieet gedurende 2 maanden voorafgaand aan celisolatie stellatum. Ongeveer 2x10 5 leverstellaatcellen kan worden gezuiverd uit de lever van een C57BL / 6 muis, terwijl de opbrengst van stervormige cellen van Balb / c muizen is aanzienlijk hoger. Het volgende protocol is aangepast aan de 5 muizen. Verzorging van dieren en experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met goedgekeurde Institutional Animal Care en gebruik Comite protocollen. 1. In situ perfusie van de muis levers met spijsverteringsenzymen <ol><li> Verwarm de SC1 buffer en enzym perfusie-oplossingen in een 37 ° C waterbad. </li><li> Monteer een gevleugelde infusieset op de siliconen tube van een peristaltische pomp. </li><li> Kalibreer de pomp met PBS tot een laminaire stroming van 6.5ml/min, dat is het debiet die zullen worden gebruikt voor de in situ perfusie van de lever te verkrijgen. Equilibreren de siliconen tube met SC1 oplossing. </li><li> Verdoven van de muis door intraperitoneale injectie van ketamine (90 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) oplossing en test voor het verlies van reflexen tot diepe narcotizatie te verzekeren. </li><li> Zet de muis in rugligging op een geschikte ondergrond. </li><li> Gebruik schaar en een tang om een ​​longitudinale incisie in de buikhuid te voeren en het buikvlies bloot te leggen. </li><li> Voorzichtig open het buikvlies en verplaats de ingewanden uit de buikholte naar de linkerkant van het dier om de poortader bloot te leggen. </li><li> Plaats de canule van de infusieset in de poortader. Voor deze stap, is het gebruik van een stereomicroscoop aanbevolen. </li><li> Start de perfusie van de lever met 30ml SC1 oplossing. Open de vena cava inferior onmiddellijk na het starten van de stroom. Succesvolle spoelen van de lever wordt aangegeven door een verlies van kleur van het leverweefsel. </li><li> Perfuseren de lever met 30ml pronase E-oplossing. Na een succesvolle spijsvertering, zal de lever kwabben zwellen, en de melkklieren zal verschijnen onderscheiden door middel van de capsule. </li><li> Perfuseren de lever met 30ml Collagenase P oplossing. De lever op dit punt heeft verloren zijn vorm en ziet er atonische en amorf. </li><li> Haal voorzichtig de lever vanuit het middenrif en de omliggende organen en op te slaan in 70 ml SC2 oplossing op ijs. </li><li> Herhaal de procedure voor de overige muizen. </li></ol> 2. In vitro vertering van de muis levers Alle verdere werken stappen moeten worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming kap. <ol><li> Snijd de levers in stukjes van ongeveer 3 2x2x2mm met behulp van een scherpe schaar. </li><li> Combineer de schorsing van 70ml SC2 inbegrip van de lever stukken met 50 ml pronase E-Collagenase P-oplossing en voeg 1 ml DNase I-oplossing. </li><li> Digest de levers voor 20min bij 37 ° C onder roeren. </li></ol> 3. Dichtheidsgradiënt centrifugatie <ol><li> Filter de celsuspensie door middel van 70μm cel zeven in 6 50ml Falcon buizen en optellen tot 50 ml met SC2 buffer. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 600 g en 4 ° C. </li><li> Zorgvuldig aspireren 40ml van het supernatans, voeg dan 150μl DNase I-oplossing aan elke buis en resuspendeer de cellen. </li><li> Het zwembad van het celsuspensies in 4 50 ml Falcon buizen en wassen met GBSS-B, centrifuge voor 10min bij 600 g en 4 ° C. </li><li> Zorgvuldig aspireren zoveel mogelijk van de supernatant mogelijk zonder de pellet te verstoren en voeg 150μl DNase I-oplossing aan elke buis. Resuspendeer de cel pellets in 10ml GBSS-B per tube. </li><li> Zwembad de cellen in twee 50 ml Falcon buizen en voeg GBSS-B tot een totaal volume van 36ml per tube. Voeg 14ml Nycodenz oplossing aan elke buis en meng goed. </li><li> Overdracht 10 ml van de celsuspensie in een 12ml gradiënt centrifugatie buis, wat resulteert in 10 tubes in totaal. Voorzichtig overlay de celsuspensie met 1,5 ml GBSS-B per tube. </li><li> Centrifugeer de gradiënten voor 15 minuten bij 1500g en 4 ° C zonder rem. Vervolgens zal hepatocyten gepelleteerd worden op de bodem van de buis terwijl stellaatcellen zijn te vinden in de interfase als een witte ring. </li><li> Voorzichtig oogst de interfase waarin de stellaatcellen en was ze met GBSS-B, centrifuge voor 10min bij 600 g en 4 ° C. </li><li> Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 20 ml DMEM aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd FBS, 1% penicilline / streptomycine, 2mm L-Glutamine, 1 mM natrium pyruvaat, en 10mm HEPES. Breng de cellen in weefselkweek kolven met een concentratie van 2x10 4 cellen / cm 2. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO 2. </li><li> Wijzig de media zodra de leverstellaatcellen zijn aanhanger (ongeveer 2 uur na het preparaat) te wassen dode cellen en celresten. </li><li> Op de volgende dagen, de stellaatcel cels moeten ontwikkelen hun kenmerkende vorm van een ster morfologie met perinucleaire vitamine A-opslag lipide blaasjes. </li><li> Voor de daaropvolgende experimenten, kan leverstellaatcellen gemakkelijk worden losgemaakt van niet-gecoate kunststof oppervlakken met een milde enzymatische oplossingen, zoals Accutase, bijvoorbeeld </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Naar aanleiding van de voorbereiding van leverstellaatcellen met de meegeleverde protocol, kan de zuiverheid van de geïsoleerde bevolking worden getest overweegt drie belangrijke kenmerken van dit type cel, zoals de ster-achtige vorm, perinucleaire lipide druppels, en expressie van gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP ). Vertegenwoordiger van foto's voor het karakteristieke uiterlijk van leverstellaatcellen 2 uur na celisolatie, en op dag 1 en 3 van in vitro cultuur zijn afgebeeld in figuur 1. Figuur 2 toont een representatieve immunofluorescentiekleuring voor GFAP in leverstellaatcellen, die zijn gekweekt voor de 3 dagen na celisolatie. Leverstellaatcellen differentiëren in myofibroblastic cellen tijdens de in vitro cultuur. Een kenmerk kenmerk van deze geactiveerde stellaatcellen is de expressie van alfa gladde spieren actine (αSMA). Figuur 3 toont immunofluorescentiekleuring voor ASMA en myosine IIA in geactiveerde stellaatcellen op dag 7 van de in vitro cultuur. <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Kenmerkend voor de morfologie van leverstellaatcellen. Stellaatcellen werden geïsoleerd uit muizen levers met de bijgeleverde protocol. De beelden tonen stellaatcellen 2 uur na celisolatie (a, b), en op dag 1 (c) en dag 3 (d) van de in vitro cultuur. Leverstellaatcellen vertonen grote hoeveelheden van lipide vesicles op perinucleaire plaatsen en het verwerven van hun onderscheidende astraal-achtige morfologie tijdens de eerste dag van de in vitro cultuur (vergroting 200x). <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Leverstellaatcellen specifiek etnisch uitdrukken in de lever. Stellaatcellen werden geïsoleerd en immunofluorescently gekleurd voor GFAP (rood) op dag 3 van in vitro cultuur. Celkernen zijn afgebeeld in blauw (Hoechst vlek). <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Lever stellaatcellen differentiëren tot myofibroblasten. Leverstellaatcellen geïsoleerd van C57BL / 6 muizen werden gekweekt voor 7 dagen. Vervolgens werden ze overgebracht naar kamer dia's en gekleurd voor ASMA (in rood) en myosine IIA (afgebeeld in groen). De celkernen werden tegengekleurd met Hoechst (blauw). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> SC1 Buffer </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 190mg </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 900 mg </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 ml van 1 M stockoplossing </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 400mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 151mg </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 8g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 x H 2 O </td><td> 78mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 350mg </td></tr><tr><td> Phenol Red </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> te vullen tot 1l </td></tr><tr><td colspan="2"> SC2 Buffer </td></tr><tr><td> CaCl 2 x 2H 2 O </td><td> 560mg </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 ml 1M-stamoplossing </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 400mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 151mg </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 8g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 x H 2 O </td><td> 78mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 350mg </td></tr><tr><td> Phenol Red </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> te vullen tot 1l </td></tr><tr><td colspan="2"> GBSS-A Buffer </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 370mg </td></tr><tr><td> CaCl 2 x 2H 2 O </td><td> 225mg </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 991mg </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 30mg </td></tr><tr><td> MgCl 2 x 6 H 2 O </td><td> 210mg </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 7 H 2 O </td><td> 70mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 75mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 227mg </td></tr><tr><td> Phenol Red </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> te vullen tot 1l </td></tr><tr><td colspan="2">GBSS-B Buffer </td></tr><tr><td> CaCl 2 x 2H 2 O </td><td> 225mg </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 991mg </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 370mg </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 30mg </td></tr><tr><td> MgCl 2 x 6 H 2 O </td><td> 210mg </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 7 H 2 O </td><td> 70mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 75mg </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 8g </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 227mg </td></tr><tr><td> Phenol Red </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> te vullen tot 1l </td></tr><tr><td colspan="2"> Pronase E perfusieoplossing </td></tr><tr><td> Pronase E </td><td> 100mg (4000 PU / mg min) </td></tr><tr><td> SC2 Buffer </td><td> 200ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Collagenase P perfusieoplossing </td></tr><tr><td> Collagenase P </td><td> 85 mg (1,78 U / mg lyo) </td></tr><tr><td> SC2 Buffer </td><td> 200ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Pronase E-Collagenase P Solution </td></tr><tr><td> Pronase E </td><td> 50 mg (4000 PU / mg min) </td></tr><tr><td> Collagenase P </td><td> 85 mg (1,78 U / mg lyo) </td></tr><tr><td> SC2 Buffer </td><td> 50ml </td></tr><tr><td colspan="2"> DNase I Solution </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> 6mg (ca. 2000U/mg) </td></tr><tr><td> GBSS-B </td><td> 3 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Nycodenz Solution </td></tr><tr><td> Nycodenz </td><td> 8g </td></tr><tr><td> GBSS-A </td><td> 28 ml </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Buffers en enzym-oplossingen die nodig zijn voor de isolatie van leverstellaatcellen. De pH van alle buffers moet worden aangepast om 7,3-7,4. Verder wordt steriele filtratie van alle buffers aan te bevelen. Het is belangrijk aan te passen de hoeveelheid enzym gebruikt in overeenstemming met de gegeven enzymatische activiteit.

<ol><li>Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells%3A+protean%2C+multifunctional%2C+and+enigmatic+cells+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver.</a> Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).</li>
<li>Geerts, A. H. istory <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((heterogeneity%2C+developmental+biology%2C+and+functions+of+quiescent+hepatic+stellate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells.</a> Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).</li>
<li>Gressner, A. M. &amp, Weiskirchen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+pathogenetic+concepts+of+liver+fibrosis+suggest+stellate+cells+and+TGF-beta+as+major+players+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets.</a> J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).</li>
<li>Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells%3A+role+in+microcirculation+and+pathophysiology+of+portal+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension.</a> Gut. 50, 571-581 (2002).</li>
<li>Winau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ito+cells+are+liver-resident+antigen-presenting+cells+for+activating+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses.</a> Immunity. 26, 117-129 (2007).</li>
<li>Minicis, S. D. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+during+hepatic+stellate+cell+activation+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo.</a> Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).</li>
<li>Knittel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+liver+myofibroblasts+and+hepatic+stellate+cells+in+normal+and+diseased+rat+livers%3A+distinct+roles+of+%28myo-%29fibroblast+subpopulations+in+hepatic+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair.</a> Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).</li>
</ol>

Leverstellaatcellen reguleren essentiële fysiologische en pathofysiologische processen in de lever. Bovendien stellaatcellen bezitten antigeen presenterende eigenschappen, waardoor ze een belangrijk onderdeel van de lever immuunrespons. Hoewel leverstellaatcellen bestaan ​​uit 10-15% van het totale aantal cellen in de lever, is isolatie van deze cellen uitdagend als gevolg van hun lokalisatie in de ruimte van Disse perisinusoïdale. Hier presenteren we een eenvoudige methode om leverstellaatc...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalog No </th></tr><tr><td> 70μm Cel Zeef </td><td> BD </td><td> 352350 </td></tr><tr><td> CaCl 2 x 2H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3306 </td></tr><tr><td> Collagenase P </td><td> Roche </td><td> 11249002001 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 11960 </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-cv </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Fluka </td><td> 3777 </td></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528 </td></tr><tr><td> Gradient Centrifugeren Tubes </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 163160 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco </td><td> 15630 </td></tr><tr><td> KCL </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td></tr><tr><td> MgCl 2 x 6H 2 O </td><td> Fluka </td><td> 63068 </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 7H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2773 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2H 2 O </td><td> Fluka </td><td> 71643 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S3014 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 x H 2 O </td><td> Fluka </td><td> 71507 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fluka </td><td> 71628 </td></tr><tr><td> Nycodenz </td><td> Accudenz AG </td><td> AN7050/BLK </td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td></tr><tr><td> Slangenpomp </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-7523-70 </td></tr><tr><td> Phenol Red </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4633 </td></tr><tr><td> Pronase E </td><td> Calbiochem </td><td> 7433-2 </td></tr><tr><td> Silicone Tube </td><td> Masterflex </td><td> HV-96440-14 </td></tr><tr><td> Natriumpyruvaat </td><td> Gibco </td><td> 11360 </td></tr><tr><td> Weefselkweek kolf (25cm 2) </td><td> BD </td><td> 353108 </td></tr><tr><td> Gevleugelde infusieset </td><td> Terumo </td><td> 1SV27EL </td></tr></tbody></table>

zeven stappen naar cellen stellatum

Seven Steps to Stellate Cells

Stellaatcellen zijn lever-ingezeten cellen van ster-achtige morfologie en bevinden zich in de ruimte van Disse tussen lever sinusoïdale endotheelcellen en hepatocyten 1,2. Stellaatcellen zijn afgeleid van het beenmerg precursoren en opslaan van maximaal 80% van het totale lichaam vitamine A 1, 2. Bij de activering stellaatcellen differentiëren in myofibroblasten aan de extracellulaire matrix te produceren, en aldus bijdragen tot leverfibrose 3. Op basis van hun vermogen om contract, kan myofibroblastic stellaatcellen reguleren van de vasculaire tonus geassocieerd met portale hypertensie 4. Onlangs toonden we aan dat leverstellaatcellen zijn potente antigeen presenterende cellen en kan activeren NKT-cellen evenals conventionele T-lymfocyten 5. Hier presenteren we een methode voor de efficiënte voorbereiding van leverstellaatcellen van muis lever. Door hun perisinusoïdale lokalisatie, de isolatie van leverstellaatcellen is een multi-step proces. Met het oog op stellaatcellen toegankelijk voor isolatie van de ruimte van Disse maken, muis levers worden perfusie in situ met de spijsverteringsenzymen pronase E en Collagenase P. Na perfusie, is de lever weefsel onderworpen aan een extra enzymatische behandeling met pronase E en Collagenase P in vitro. Vervolgens heeft de methode maakt gebruik van de enorme hoeveelheid vitamine A-opslag van lipide druppels in leverstellaatcellen. Deze functie kan de scheiding van stervormige cellen uit andere lever celtypen door centrifugeren op een 8% Nycodenz verloop. Het protocol hier beschreven geeft een zeer zuivere en homogene populatie van stellaatcellen. Zuiverheid van de voorbereiding kan worden beoordeeld door kleuring voor de marker molecule gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP), voorafgaand aan de analyse van fluorescentie microscopie of flowcytometrie. Verder lichtmicroscopie onthult het unieke uiterlijk van stervormige leverstellaatcellen dat grote hoeveelheden van lipide druppels haven. Samen genomen, presenteren we een gedetailleerd protocol voor de efficiënte isolatie van leverstellaatcellen, met inbegrip van representatieve beelden van hun morfologische uiterlijk en GFAP expressie die helpen om de stellaatcel cel entiteit te definiëren.

Hier beschrijven we een methode voor de isolatie van leverstellaatcellen van muis lever. Voor stellaatcellen cel zuivering, muis levers verteerd<em&gt; In situ</em&gt; En<em&gt; In vitro</em&gt; Door pronase-collagenase behandeling voorafgaand aan de dichtheidsgradiënt centrifugeren. Deze techniek levert zeer zuivere leverstellaatcellen.

Zeven Stappen naar cellen stellatum

Hepatische stellaire cellen zijn in de lever residente cellen met een stervormige morfologie en bevinden zich in de ruimte van Disse tussen de endotheliale cellen van de leversinusoïden ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van hepatische stellaire cellen uit muizenlevers. Dit wordt bereikt door eerst twee perfusies van de muizenlevers uit te voeren met verteringsenzymen in situ. Na de perfusie worden de levers in kleine stukjes gesneden om de efficiëntie van de daaropvolgende in vitro digestie te verhogen.Als laatste stap worden de hepatische stellaire cellen door middel van dichtheidsgradiëntcentrifugatie gescheiden van andere leverceltypen. Uiteindelijk worden de hepatische stellaire cellen verkregen en kan hun zuiverheid worden beoordeeld via licht- en immunofluorescentiemicroscopie. De procedure zal worden gedemonstreerd door Patrick Meyer, een promovendus uit een laboratorium. Ter voorbereiding op de NC twee-perfusie van muizenlevers worden eerst de SC één-buffer en de enzymperfusie-oplossingen opgewarmd in een waterbad van 37 °C.Stel vervolgens de peristaltische pomp in om een laminaire stroom van 6,5 milliliters per minuut te verkrijgen en equilibreer de siliconen slang van de pomp met SC one-oplossing. Bevestig nu aan het uitblijven van reflexen dat de geanestheseerde muis diep gesedateerd is. Fixeer de muis daarna in rugligging op een gesc

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Afleiding van neuro voorlopers uit embryonale stamcellen (ES)-cellen met behulp van stromale cel afkomstige inducerende activiteit (SDIA).

ES Cell-afgeleide neuro-epitheliale cel culturen

This video demonstrates a protocol for differentiating human induced pluripotent stem cells into cerebellar progenitors. It involves transferring stem cell colonies to an ultra-low attachment plate to form embryoid bodies, promoting differentiation with growth factors, and then transferring the embryoid bodies onto a matrix-coated plate for adhesion. Subsequent steps involve inducing cell migration and adding a maturation medium to guide the development of glutamatergic and GABAergic cerebellar...

A Technique to Generate a 2D Monolayer of Cerebellar Cells from Induced Pluripotent Stem Cells

Dit artikel geeft gedetailleerde methodologieën voor het gebruik van driedimensionale (3D) assays om borstkanker cel invasie kwantificeren. Concreet bespreken we het nodig om dergelijke assays procedures, kwantificering en gegevensanalyse, alsook werkwijzen voor het verlies van membraan integriteit die ontstaat wanneer cellen binnendringen onderzoeken.

Kwantificering van de Breast Cancer Cell Invasiviteit met een drie-dimensionale (3D) Model

De transcriptionele heterogeniteit binnen humane adipogeen-afgeleide stromale cellen kan op enkelcellig niveau worden gedefinieerd met behulp van celoppervlaktemarkers en osteogene genen. We beschrijven een protocol dat flowcytometrie gebruikt voor de isolatie van celsubpopulaties met verhoogd osteogeen potentieel, die kunnen worden gebruikt om craniofaciale skeletreconstructie te verbeteren.

Isolatie en Verrijking van Human Adipose-afgeleide stromale cellen voor Enhanced Osteogenesis

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) hebben de intrinsieke vermogen om onderscheid te maken en zichzelf organiseren in verschillende weefsel patronen; hoewel dit vereist de presentatie van ruimtelijke milieu-hellingen. Wij presenteren stencil micropatterning als een eenvoudige en robuuste methode om biochemische en mechanische gradiënten genereren voor het besturen van HPSC differentiatie patronen.

Stencil micropatterning van menselijke pluripotente stamcellen voor Probing ruimtelijke organisatie van Differentiatie Fates

Dit protocol beschrijft hoe de differentiatie van M cellen in menselijke stamcel afgeleide ileale monolagen en methoden om hun ontwikkeling te beoordelen induceren.

Geïnduceerde differentiatie van M cel-achtige cellen in menselijke stamcel-afgeleide Ileal Enteroid monolayers

Dit protocol presenteert een nieuw, robuust en reproduceerbaar kweeksysteem om driedimensionale sferoïden uit Caco2 colon adenocarcinoomcellen te genereren en te laten groeien. De resultaten vormen de eerste proof-of-concept voor de geschiktheid van deze aanpak om kankerstamcelbiologie te bestuderen, inclusief de respons op chemotherapie.

Een driedimensionaal model van sferoïden om stamcellen van darmkanker te bestuderen

Pathofysiologische veranderingen in het cardiale autonome zenuwstelsel, vooral in de sympathische tak, dragen bij aan het ontstaan en onderhoud van ventriculaire aritmieën. In dit protocol laten we zien hoe we murine stellate ganglia kunnen karakteriseren om het begrip van de onderliggende moleculaire en cellulaire processen te verbeteren.

Locatie, dissectie en analyse van het Murine Stellate Ganglion

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de isolatie en kleuring van muriene beenmergcellen tot fenotype hemopoietische stam- en voorlopercellen, samen met de ondersteunende niche endotheel- en mesenchymale stamcellen. Een methode om cellen in endosteale en centrale beenmerggebieden te verrijken, is ook inbegrepen.

Flowcytometrie-analyse van hematopoëtische stam- en voorlopercellen van muizenbeenmerg en stromale nichecellen

Het hieronder beschreven protocol is een eenvoudige en effectieve manier om retinoïde-bevattende cellen te isoleren uit zeer heterogene longcelpopulaties door gebruik te maken van specifieke retinoïde autofluorescentie en door gebruik te maken van fluorescerend-geactiveerde celsortering.

Isolatie van longretinoïde-bevattende cellen door celsortering

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie, zuivering en kweek van primaire marginale cellen uit de muis stria vascularis, en voor het opstellen van in vitro modellen van oxidatieve stress en cellulaire senescentie om cochleaire laterale wandaandoeningen te bestuderen.

Isolatie en kweek van primaire marginale cellen van de stria vascularis uit neonatale muizen

Leer hepatic stellate cellen isoleren uit muizenlever met enzymperfusie en dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Deze methode levert zuivere cellen op voor leveronderzoek en celbiologische studies.

Zeven Stappen naar cellen stellatum

Meer video's verkennen