Zeven Stappen naar cellen stellatum

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van hepatische stellaire cellen uit muizenlevers. Dit wordt bereikt door eerst twee perfusies van de muizenlevers uit te voeren met verteringsenzymen in situ. Na de perfusie worden de levers in kleine stukjes gesneden om de efficiëntie van de daaropvolgende in vitro digestie te verhogen.

Als laatste stap worden de hepatische stellaire cellen door middel van dichtheidsgradiëntcentrifugatie gescheiden van andere leverceltypen. Uiteindelijk worden de hepatische stellaire cellen verkregen en kan hun zuiverheid worden beoordeeld via licht- en immunofluorescentiemicroscopie. De procedure zal worden gedemonstreerd door Patrick Meyer, een promovendus uit een laboratorium. Ter voorbereiding op de NC twee-perfusie van muizenlevers worden eerst de SC één-buffer en de enzymperfusie-oplossingen opgewarmd in een waterbad van 37 °C.

Stel vervolgens de peristaltische pomp in om een laminaire stroom van 6,5 milliliters per minuut te verkrijgen en equilibreer de siliconen slang van de pomp met SC one-oplossing. Bevestig nu aan het uitblijven van reflexen dat de geanestheseerde muis diep gesedateerd is. Fixeer de muis daarna in rugligging op een geschikte basis.

Gebruik een schaar en een pincet om een longitudinale incisie in de abdominale huid te maken en het peritoneum bloot te leggen. Open het peritoneum voorzichtig en verplaats de darmen uit de buikholte naar de linkerkant van het dier om de vena portae bloot te leggen. Het meest uitdagende aspect van deze procedure is de zeto-perfusie van de levers met spijsverteringsenzymen, wat gedemonstreerd zal worden.

Vervolgens is het belangrijk om een stereomicroscoop te gebruiken bij het inbrengen van de canule en om de veranderingen in de leverstructuren tijdens de perfusie nauwlettend te volgen. Breng, terwijl u onder een stereomicroscoop werkt, de canule van de infusieset in de poortader in. Start de perfusie van de lever met 30 milliliters SC-eenheidoplossing. Open de vena cava inferior onmiddellijk naden het debiet is gestart.

Een succesvolle spoeling van de lever is herkenbaar aan het kleurverlies van het leverweefsel; spoel de lever vervolgens met 30 milliliters Pronase E-oplossing. De leverkwabben zullen opzwellen en de lobuli zullen duidelijk zichtbaar worden door het kapsel na perfusie met Pronase E-oplossing, gevolgd door perfusie met 30 milliliters collagenase P-oplossing. Wanneer de perfusie met collagenase P is voltooid, wordt de lever uit de muis geoogst door deze voorzichtig te dissekeren van het diafragma en de omliggende organen, waarna deze wordt bewaard in 70 milliliters SC two-oplossing op ijs.

De lever heeft op dit punt zijn vorm verloren en ziet er atonisch en amorf uit. De procedure voor de digestie van muizenlevers moet onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd, in een laminaire flowkast.

Gebruik een scherpe schaar om de levers in stukjes van ongeveer twee bij twee bij twee kubieke millimeter te snijden. Combineer vervolgens de suspensie van 70 milliliters SC two en de leverstukjes met 50 milliliters protease E collagenase P-oplossing. Voeg one milliliter dna, one-oplossing toe en verteer de levers gedurende 20 minuten bij 37 °C onder constant roeren.

Na enzymatische digestie van het leverweefsel worden de stellaatcellen gescheiden van andere hepatische celtypen door middel van dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Begin deze procedure door de celsuspensie door 70 µm celzeefjes in zes 50 mL falcon-buisjes te filteren en was de cellen met E2-buffer; centrifugeer vervolgens 10 minuten bij 600 Gs en 4 °C. Aspireer na centrifugatie voorzichtig 40 mL van het supernatant uit elke buis.

Voeg vervolgens 150 µL DNA's one-oplossing toe aan elke buis en resuspendeer de cellen. Voeg de cel-suspensies samen in vier Falcon-buizen van 50 mL en was deze met G-B-S-S-P; centrifugeer 10 minuten bij 600 ×g en 4 °C. Aspireer voorzichtig zoveel mogelijk van het supernatant zonder de pellet te verstoren en voeg 150 µL DNA's one-oplossing toe aan elke buis.

We suspenderen de celpellets in 10 milliliters G-B-S-S-B per buis. Voeg de cellen samen in twee 50 milliliter falcon-buizen en voeg G-B-S-S-B toe tot een totaal volume van 36 milliliters per buis. Voeg 14 milliliters den-oplossing toe aan elke buis en meng goed.

Breng vervolgens 10 milliliters van de celsuspensie over in één 12 milliliter gradiëntcentrifugatiebuis, wat resulteert in een totaal van 10 buizen. Bedek de celsuspensie voorzichtig met 1,5 milliliters G-B-S-S-B per buis. Centrifugeer de gradiënten gedurende 15 minuten bij 1500 Gs en vier graden Celsius zonder onderbreking.

Vervolgens zullen de hepatocyten bezinken op de bodem van de buis, terwijl de stellaire cellen zich in de interface bevinden als een witte ring. Oogst met een pipette van vijf milliliter voorzichtig de interface die de stellaire cellen bevat en breng deze over naar een buis van 50 milliliter. Was de cellen door G-B-S-S-B toe te voegen en centreer gedurende 10 minuten bij 600 Gs en vier graden Celsius.

Zuig het supernatant af en resuspendeer de cellen in 20 milliliters DMEM met supplementen. Nadat de cellen zijn geteld, worden ze overgebracht naar weefkweekflesjes bij een concentratie van twee keer 10⁴ cellen per vierkante centimeter; incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2. Ongeveer twee uur na de preparatie zouden de hepatische stellaatcellen adherent moeten zijn; vervang het medium om dode cellen en celresten weg te wassen.

Plaats de cellen terug in de incubator; representatieve resultaten van het prepareren van hepatische stellaire cellen uit muizenlevers met behulp van dit protocol worden hier getoond. Cellen op dag één en dag drie van de in vitro cultuur vertonen de karakteristieke morfologie van hepatische stellaire cellen. Ze zijn astrocyten-achtig van vorm en vertonen opslag van lipidevesikels.

Op nucleaire sites kan de zuiverheid van de geïsoleerde hepatische stellaire cellen ook worden geverifieerd door de expressie van gliaal fibrillair zuur proteïne of GFAP. Deze beelden tonen een representatieve immunofluorescente kleuring voor GFAP, in rood weergegeven in hepatische stellaire cellen die drie dagen na celisolatie zijn gekweekt. Na het bekijken van deze video moet u een goed inzicht hebben in hoe u hepatische stellaire cellen uit een neuronenlever isoleert voor een adequate opbrengst van zuivere stellaire cellen.

Het is belangrijk om een efficiënte digestie bij leverperfusie te waarborgen. Tot slot is het essentieel om de juiste identiteit van de geïsoleerde cellen vast te stellen door de morfologie en het fenotype van de hepatische dal-cellen te beoordelen.