Zeven Stappen naar cellen stellatum

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van hepatische stellaire cellen uit muizenlever. Dit wordt bereikt door eerst in C twee perfusies van muizenlevers met digestieve enzymen uit te voeren. Na de perfusie worden de levers in kleine stukjes gesneden om de efficiëntie van de daaropvolgende in vitro digestie te verhogen.

Als laatste stap worden de hepatische stellaire cellen gescheiden van andere leverceltypen door middel van dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Uiteindelijk worden de hepatische stellaire cellen verkregen en kan hun zuiverheid worden beoordeeld via licht- en immunofluorescentiemicroscopie. De procedure zal worden gedemonstreerd door Patrick Meyer, een promovendus uit een laboratorium. Ter voorbereiding op de NC twee perfusie van muizenlevers worden eerst de SC één buffer en de enzymperfusie-oplossingen opgewarmd in een waterbad van 37 °C.

Stel vervolgens de peristaltische pomp in om een laminaire stroming van 6,5 milliliters per minute te verkrijgen en equilibreer de siliconen slang van de pomp met SC one-oplossing. Bevestig nu aan de hand van het uitblijven van reflexen dat de geanestheseerde muis diep gesedeerd is. Fixeer de muis daarna in rugligging op een geschikte basis.

Gebruik een schaar en een pincet om een longitudinale incisie in de buikhuid te maken en het peritoneum bloot te leggen. Open het peritoneum voorzichtig en verplaats de darmen uit de buikholte naar de linkerzijde van het dier om de vena portae bloot te leggen. Het meest uitdagende aspect van deze procedure is de zeto-perfusie van de levers met spijsverteringsenzymen, wat gedemonstreerd zal worden.

Vervolgens is het belangrijk om een stereomicroscoop te gebruiken bij het inbrengen van de canule en om de veranderingen in de leverstructuren tijdens de perfusie nauwgezet te monitoren. Terwijl u onder de stereomicroscoop werkt, brengt u de canule van de infusieset in de poortader in. Start de perfusie van de lever met 30 milliliters SC one-oplossing. Open de vena cava inferior onmiddellijk nadat de flow is gestart.

Een succesvolle spoeling van de lever is aanwijsbaar door een kleurverlies van het leverweefsel; spoel vervolgens de lever met 30 milliliters Pronase E-oplossing. De leverkwabben zullen opzwellen en de lobuli zullen duidelijk zichtbaar worden door het kapsel na perfusie met Pronase E-oplossing, gevolgd door perfusie met 30 milliliters collagenase P-oplossing. Wanneer de perfusie met collagenase P voltooid is, wordt de lever uit de muis geoogst door deze zorgvuldig te dissekeren van het diafragma en de omliggende organen en te bewaren in 70 milliliters SC twee-oplossing op ijs.

De lever is op dit punt van vorm verloren en ziet er atoon en amorf uit. De procedure voor de digestie van muizenlevers dient onder steriele omstandigheden te worden uitgevoerd, in een laminaire flowkast.

Gebruik een scherpe schaar om de levers in stukjes van ongeveer twee bij twee bij twee kubieke millimeters te snijden. Combineer vervolgens de suspensie van 70 milliliters SC twee en de leverstukjes met 50 milliliters protease E collagenase P-oplossing. Voeg een milliliter dna, één oplossing toe en verteer de levers gedurende 20 minuten bij 37 °C onder geroer.

Na enzymatische digestie van het leverweefsel worden de stellate cellen gescheiden van andere hepatische celtypen middels dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Om deze procedure te starten, wordt de celsuspensie door 70 µm celzeven gefilterd in zes 50 ml falcon-buisjes en worden de cellen gewassen met E2-buffer, gevolgd door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 600 ×g en 4 °C. Na centrifugatie worden 40 ml van het supernatant voorzichtig uit elke buis geaspireerd.

Voeg vervolgens 150 µL DNA's one-oplossing aan elke buis toe en resuspendeer de cellen. Breng de celsuspensies samen in vier Falcon-buisjes van 50 mL en was deze met G-B-S-S-P door 10 minuten te centrifugeren bij 600 ×g en 4 °C. Aspireer voorzichtig zoveel mogelijk van het supernatant zonder de pellet te verstoren en voeg 150 µL DNA's one-oplossing aan elke buis toe.

We suspenderen de celpellets in 10 milliliters G-B-S-S-B per buis. Voeg de cellen samen in twee 50 milliliter falcon-buizen en voeg G-B-S-S-B toe tot een totaal volume van 36 milliliters per buis. Voeg 14 milliliters den-oplossing toe aan elke buis en meng goed.

Overbreng vervolgens 10 milliliter van de cel-suspensie naar één 12 milliliter gradiëntcentrifugatiebuis, wat resulteert in een totaal van 10 buizen. Bedek de cel-suspensie voorzichtig met 1,5 milliliter G-B-S-S-B per buis. Centrifugeer de gradiënten gedurende 15 minuten bij 1500 Gs en vier graden Celsius zonder rem.

Vervolgens zullen de hepatocyten op de bodem van de buis bezinken, terwijl de stellaire cellen zich in de interface bevinden als een witte ring. Oogst met een pipette van vijf milliliter voorzichtig de interface die de stellaire cellen bevat en breng deze over naar een buis van 50 milliliter. Was de cellen door G-B-S-S-B toe te voegen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 600 Gs en vier graden Celsius.

Zuig het supernatant af en resuspendeer de cellen in 20 milliliters DMEM met supplementen. Na het tellen van de cellen worden deze overgezet naar weefselkweekflessen bij een concentratie van twee keer 10⁴ cellen per vierkante centimeter; incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2. Ongeveer twee uur na de voorbereiding moeten de hepatische stellaire cellen adherent zijn; vervang het medium om dode cellen en celresten weg te wassen.

Plaats de cellen terug in de incubator. Representatieve resultaten van het prepareren van hepatische steltcellen uit muizenlevers met behulp van dit protocol worden hier getoond. Cellen op dag één en dag drie van in vitro-kweek vertonen de karakteristieke morfologie van hepatische steltcellen. Ze zijn astrocytoïde van vorm en vertonen opslag van lipidesthesels.

Op per nucleaire locaties kan de zuiverheid van de geïsoleerde hepatische stellaire cellen ook worden geverifieerd door de expressie van gliaal fibrillair zuur eiwit of GFAP. Deze afbeeldingen tonen een representatieve immunofluorescente kleuring voor GFAP, in rood weergegeven in hepatische stellaire cellen die drie dagen na celisolatie zijn gekweekt. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u hepatische stellaire cellen uit neuron lever isoleert voor een adequate opbrengst van zuivere stellaire cellen.

Het is belangrijk om een efficiënte digestie bij leverperfusie te waarborgen. Ten slotte is het essentieel om de juiste identiteit van de geïsoleerde cellen te bepalen door de morfologie en het fenotype van hepatische dal-cellen te beoordelen.