Transmembraan domein oligomerisatie Propensity bepaald door ToxR Assay

Het algemene doel van het volgende experiment is om ligamentisatieneiging van eiwitten, transmembraaneiwitten of T MD's in een natuurlijke membraanomgeving te onderzoeken. Dit wordt bereikt door de transmembraaneiwitdomein van belang in e coli tot expressie te brengen als een chimeerische proteïne met maltosegevend bindend eiwit voor lokalisatie naar de periplasm en tox. R als een transcriptionele reporter, transmembraaneiwitdomein geïnduceerde ligamentisatie resulteert in dimerisatie van tox R en activering van LXi transcriptie. Als tweede stap worden de cellen gelyseerd en behandeld met ONPG, dat wordt gehydrolyseerd door beta galacto naar de lichtabsorberende soort O nitro phoalate of ONP.

Vervolgens worden de ONP-niveaus gekwantificeerd door de lichtabsorptie bij 405 nanometer te meten. Om de niveaus van transmembraaneiwitdomein te bepalen, onthullen de ligamentisatieresultaten de ligamentisatieneiging van de transmembraaneiwitdomeinen op basis van een tox R reporter assay. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande biofysische methoden zoals SDS-pagina of fluorescentie, is dat het gedrag van het transmembraaneiwitdomein wordt bestudeerd in een natuurlijk fosfolipidebilaag door expressie in e coli in plaats van een membraanmimetisch systeem zoals een detergent zelf.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van membraaneiwitten, zoals het verduidelijken van belangrijke structurele kenmerken die betrokken zijn bij transmembraaneiwithelixassociatie. Voorafgaand aan het starten van dit protocol worden zeven plasmiden die het vereiste chimeerische eiwit tot expressie brengen, bereid uit commercieel gesynthetiseerde oligonucleotiden, die de TDS van belang voorstellen, geflankeerd door NHE één en BMH één. Beperkingsplaatsen nadat de plasmiden zijn bereid, worden fhk 12 competente cellen voorzichtig ontdooid op ijs. Zodra ontdooid, worden de cellen overgebracht naar 15 milliliter kweekbuizen bij 200 nanogram van elk plasma DNA naar een aparte buis en worden de cellen gedurende 30 minuten op ijs geïncubeerd.

Vervolgens worden de cellen gedurende 90 seconden op 42 graden Celsius verhit, gevolgd door incubatie op ijs gedurende twee minuten bij 800 microliter SOC-medium en worden de monsters gedurende één uur bij 37 graden Celsius geschud. Na de incubatie worden vijf milliliter LB-medium met chlooramfenicol en aose geïnoculeerd met 50 microliter van het transformatiemengsel met behulp van 15 milliliter kweekbuizen in drievoudig voor elk monster. Ten slotte worden de monsters gedurende 20 uur bij 37 graden Celsius geschud. Om de volledige ligamentisatie van TDS te meten, wordt de activiteit van beta galactosidase bepaald.

Verwarm eerst de plate reader op 28 graden Celsius. Gebruik Z-buffer stock om verse Z-buffer oplossingen te bereiden zoals beschreven in het geschreven protocol. Breng Z-buffer chloroform over van de buis naar de reservoir, zorg ervoor dat alleen de bovenste waterige laag van de Z-buffer chloroform wordt gepipetteerd.

Plaats de 96-well plate op een stuk papier met een getekend raster om nauwkeurig te pipetten. Breng 100 microliter Z-buffer chloroform over naar elke put van een 96-well plate, gevolgd door vijf microliter van elke kweek in viervoudig. Laat de kweek weg in de vier putten die als blanco's zullen dienen. Meet de OD 5 95 van de plate om de celdichtheid te bepalen.

Voeg 50 microliter Z-buffer SDS toe aan alle putten van de plate. Schud vervolgens de plate in de plate reader gedurende 10 minuten om de cellen te lyzeren. Na cellysis worden 50 microliter ZPA voor ONPG toegevoegd aan alle putten. Breng de plate terug naar de plate reader en meet OD 4 0 5 elke 30 seconden gedurende 20 minuten.

Bepaal het niveau van beta lacto sasactiviteit door een berekening van Miller eenheden, genormaliseerd naar de blanco. Western blotting wordt uitgevoerd om equivalente eiwitexpressie tussen constructen te verifiëren. Combineer eerst 50 microliter van de drievoudige culturen en centrifugeer vervolgens de monsters met behulp van een microcentrifuge.

Verwijder het supernatant door te pipetten en resus. Suspendeer het resterende pellet in twee x monsterlaadbuffer. Laad 7,5 microliter van elk monster op een standaard 8% gel en voer elektroforese uit bij 125 volt gedurende één uur en vijf minuten na de overdracht. Incubeer de membraan met anti M-V-P-H-R-P geconjugeerd antilichaam om het chimeerische eiwit zichtbaar te maken dat wordt waargenomen bij ongeveer 70 kilodalton met soms enkele afbraakproducten rond de 48 kilodalton.

Endogene MVP wordt ook waargenomen bij 45 kilodalton. Om de juiste membraaninsertie van de chimeerische TMD-construct te beoordelen, wordt de maltosegevend bindend eiwit-deficiënte PD 28-cellijn gebruikt wanneer deze wordt gekweekt in minimaal medium met maltosegevend bindend eiwit als enige koolstofbron. Transformeer PD 28-cellen zoals beschreven voor fhk 12-cellen en inoculeer twee milliliter LB-medium.

Laat de cellen bij 37 graden Celsius met schudbeweging bij 300 RPM overnacht groeien. Pellet de cellen door centrifugatie en was door Resus suspensie in twee milliliter PBS en voorzichtig pipetten met een grote tip. Na pelleting worden de cellen opnieuw gewassen met PBS voor een tweede keer, waarna een laatste centrifugatie wordt uitgevoerd en resuspensie in één milliliter PBS.

Gebruik 25 microliter van de resuspendeerde cellen om vijf milliliter minimaal medium te inoculeren. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius met schudbeweging gedurende 15 uur. Breng 200 microliter van elk monster over naar een 96-well plate en neem de OD 5 9 5-meting met behulp van de plate reader.

Herhaal dit proces elke twee uur tot 25 uur. De allemaal ligamentisatieneiging van individuele transmembraaneiwitdomeinen van het multis spanningsmembraaneiwit latent membraaneiwit één werd geanalyseerd met behulp van de tox R transcriptionele reporter assay. Transmembraaneiwitdomein vijf vertoont een sterke neiging om te allemaal liga rijzen zoals aangetoond door hoge Miller eenheden, die vergelijkbaar is met de positieve controle GPAA, een goed gevestigde dimerisatiesequentie.

Een schadelijke mutatie in transmembraaneiwitdomein vijf D een 50 A vermindert het vermogen van de sequentie