Name: Methoden om Beta Cell Death gemedieerd beoordelen door cytotoxische T lymfocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Leer twee in-vitromethoden om CD8+ T-cel-gemedieerde bètaceldood bij type 1 diabetes te meten: een Chromium-51-release-assay en live-celbeeldvorming met mitochondriale membraanpotentiaalverf.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health DK074656 en AI56374 (CEM), evenals de Juvenile Diabetes Research Foundation.

1. De voorbereiding van de cellen <ol><li> Doelcel cultuur: Cultuur van de muis beta-cellijnen, NIT-1 en NIT-4, werd een eerder beschreven 1,2 in DMEM aangevuld met 10% FBS, 0,02% BSA, niet-essentieel aminozuur, 15MM HEPES, 16,5 mm Glocose en penicilline / streptomycine. Voor 51 Cr etikettering, zaad cellen in een vlakke bodem 96-well plaat cultuur op 5x10 4 cellen / putje in 200 ul kweekmedium. Voor microscopie experimenten, zaad cellen in een acht-goed Lab-Tak II chambered dekglaasje op 5x10 4 per kamer in 500 ul kweekmedium, en laat vooraf laten groeien gedurende 48 uur voor het gebruik in de cytotoxiciteit experimenten. </li><li> Controle T-cellijn cultuur: Gebruik de Jurkat cellijn (ATCC, CD3 + menselijke lymfocyt cellijn) als een negatieve controle. Cultuur Jurkat cellen in RPMI1640 aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1,5 g / L natriumbicarbonaat, 10 mM HEPES en 1,0 mM natrium pyruvaat. </li></ol> 2. Inzameling en activering van effector autoreactieve CD8 + T-cellen NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] en NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] werden gekocht bij The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) en gefokt in onze muis faciliteit. F1 hybride nakomelingen van kruisingen van de NOD-AI4a met NOD-AI4b [NOD-AI4a / b] de ontwikkeling van diabetes op 3-5 weken oud zijn. Alle muizen werden gehuisvest in specifieke pathogeen-vrij faciliteiten en goedgekeurd door de desbetreffende instelling Animal Care en gebruik Comite. <ol><li> Euthanaseren van 3-4 weken oud NOD-AI4a / b muizen met behulp van CO 2. </li><li> Verzamel milt van muizen. Gedood muizen zijn bereid met ethanol spray en geopend onder de chirurgische kap. Milt is verwijderd en in de ijskoude HBSS buffer onmiddellijk. </li><li> Verzamel milt cellen met behulp van een 7 ml glas homogenisator. Twee tot drie milt elk worden in 5 ml koud HBSS en gehomogeniseerd met een 7 ml glas homogenisator. Homogenaat wordt verzameld en gecentrifugeerd bij 1200 gedurende 5 minuten bij 4 ° C met behulp van een Sorvall RT7 + centrifuge. Celpellets worden verzameld. </li><li> Verwijder de rode bloedcellen met behulp van hypotone oplossing behandeling. Pellets worden behandeld met 5 ml hypotone oplossing / milt op ijs gedurende 5 minuten, vervolgens geneutraliseerd door het toevoegen van een gelijk volume van HBSS. Verzamel cellen door centrifugeren, zoals hierboven, en resuspendeer in 50 ml HBSS. Passeren de geschorste cellen door cellen zeef en te tellen met behulp van een hemocytometer met TrypanBlue vlekken. </li><li> Activeren cellen. Resuspendeer cellen bij 5x10 6 / mL en te activeren met behulp van een 3-daagse cultuur met 0,1 uM AI4 mimotope (aminozuursequentie YFIENYLEL) en 25 U / ml IL-2 in RPMI1640 aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1,5 g / L natriumbicarbonaat, 10 mM HEPES en 1,0 mM natrium pyruvaat. </li></ol> 3. 51 Cr los test om te onderzoeken CML <ol><li> Label doelcellen: Voeg 51 Cr aan cellen op een doel uCi / goed en cultuur voor 3 uur, en 3 keer wassen met kweekmedium. </li><li> Suspend effector-cellen in RPMI 1640-medium, zoals vermeld in stap 2.5, zodat het uiteindelijke volume aan elk putje toegevoegd is 200 pi. </li><li> Na de laatste wasbeurt van gemerkte doelcellen, voeg geactiveerde effector-cellen om het doel celculturen op de gewenste effector naar (E: T) doel ratio's. We meestal gebruik van E: T ratio op 0.4:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1 en 50:1. </li><li> Voeg verse gewijzigd RPMI 1640 medium (zie stap 2.5) tot 6 wells van target-cellen op te treden als een spontane lysis controle. </li><li> Co-cultuur effector en doelcellen gedurende 16 uur. </li><li> Verzamel supernatant in 6x50 mm Lime glazen buizen </li><li> Lyse cellen door het toevoegen van 100μl 2% SDS en pipetteren een paar keer zachtjes. </li><li> Verzamel cellysaat in een andere set van 6x50 mm Lime glazen buisjes. </li><li> Een keer wassen putten met schone H 2 O en voeg de was naar de cel lysaat buizen. </li><li> Tel de supernatants samen en cellysaten met behulp van een gamma-teller. </li><li> Bereken specifieke lysis als volgt: <img src="files/ftp_upload/2724/2724eq1.jpg" alt="Vergelijking 1"></li></ol> 4. Kleuring van cellen voor live cell imaging Onder de meest gebruikte mitochondriale membraanpotentiaal kleurstoffen, TMRM de minst mitochondriale toxiciteit vertoont. 3 Daarom kiezen we TMRM voor deze live-cell imaging studies. <ol><li> Bereid een 40 mM voorraad TMRM oplossing in DMSO en bewaar bij -20 ° C. Maak een [25 nM] verse werkende oplossing in fenol rood-vrij DMEM met alle supplementen voor NIT-een celcultuur 1. </li><li> Vlek doel NIT-1-cellen met TMRM 25 nM gedurende 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Vervang de media met verse media met 5 nM TMRM het evenwicht verdeling van de kleurstof 4 te houden. </li><li> Count geactiveerde effector AI4 T-cellen met behulp van een hematocytometer. </li><li> Vlek geactiveerde effector AI4 T-cellen met een ul / ml Picogreen voor5 minuten bij kamertemperatuur en wassen met fenol rood-vrij kweekmedium 3 keer. </li></ol> 5. Het beoordelen van T-lymfocyt-gemedieerde beta celdood met behulp van live-cell imaging <ol><li> Monteer de chambered dekglaasje met glas NIT-cellen op het podium van een Zeiss LSM 510 confocale microscoop. Verwijder het stickertje met een dremmel en gas de chambered glas steriliseren met Etheline oxide. Het podium is voorzien van een live-cell imaging kamer die de temperatuur geregeld op 37 ° C en 5% CO 2 met vocht. Heeft </li><li> Voeg geactiveerd en gekleurd T-cellen bij de aangewezen kamers op verschillende E: T ratio. </li><li> Toegevoegd hetzelfde aantal gekleurde Jurkat-cellen aan de controle kamers. </li></ol> 6. Het verkrijgen van live-cell beelden De microscoop is uitgerust met een gemotoriseerde fase die liet ons toe om steeds beelden te verwerven op verschillende locaties van dezelfde of verschillende kamers automatisch over het tijdsverloop van het experiment. <ol><li> Met behulp van een 63x olie objectief, foto's maken met een interval van elke 3 minuten voor een totaal van 300 frames per locatie. </li><li> Detecteren TMRM kleuring met behulp van een excitatie golflengte van 543 nm en filterset voor emissie 565 tot 619 nm </li><li> Detecteren Picogreen kleuring met behulp van een excitatie 488 nm en een filter instellen voor emissie 500 tot 630 nm. De video werd gemaakt met behulp van Zeiss LSM-software. </li></ol> 7. Video conversie voor publicatie <ol><li> Met behulp van de LSM Zeiss-software, maakt u een niet-gecomprimeerd filmbestand in een AVI-formaat. </li><li> Om te zetten van de video in de gepubliceerde formaat, importeert u de video in het software pakket Fiji ( <a href="http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji">http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji</a> ), een ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info. nih.gov / ij /</a> ) de distributie, het gebruik van de Bioformats plugin van LOCI ( <a href="http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats">http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats</a> ). </li><li> Pas de helderheid en contrast instellingen om de groene en rode signalen en de framerate was ingesteld op 2 frames / seconde met behulp van de animatie-opties menu balans. </li><li> Snijd de video om 512 x 512 pixels en exporteren als een ongecomprimeerd AVI bestand. </li><li> Open dit AVI-bestand in de software Quicktime 7 (Apple computer, Cupertino, CA) en comprimeren en exporteren in de open video-bestandsformaat H264/MPEG-4 1200 kbs / seconde. </li></ol> 8. Representatieve resultaten: <ol><li> Een vertegenwoordiger resultaat van 51 Cr CML-test. Figuur 1 toont een representatief resultaat van een CML-test, waar procent specifieke lysis (Y-as), neemt toe naarmate de Effector: Target ratio (X-as) toeneemt. Doelcellen zijn primaire eilandjes geïsoleerd van immunodeficiënte NOD Rag1-/ -. Muizen en voorzien van 51 Cr. Splenocyten van NOD.AI4α / β transgene muizen zijn geïsoleerd en geactiveerd, zoals beschreven in stap 2 hierboven. Doelstellingen en effectoren werden samen gekweekt gedurende 16 uur. Percentage specifieke lysis wordt berekend als beschreven in stap 3.11. </li><li> Twee representatieve (positieve en negatieve) resultaten van een T-cel-gemedieerde beta cel mitochondriale membraanpotentiaal dissipatie worden gepresenteerd. Cellen worden gekleurd en de reacties zijn opgenomen zoals beschreven in stap 4, 5 en 6 hierboven, video-bestanden worden gemaakt zoals in stap 7. Video 1: De muis beta cellijn NIT-1 was bevlekt de mitochondriale membraanpotentiaal kleurstof TMRM (rood). Geactiveerd, autoreactieve CD8 + T-cellen AI4 (Stained groen met Picogreen) werden samen gekweekt met deze NIT-1-cellen op een E: T-verhouding van 50:1. NIT-1 mitochondriale membraanpotentiaal geleidelijk aan verdwenen tijdens een 400-minuten duur, maar alleen in de clusters die de interactie met AI4 T-cellen. Video 2: Als een controle-experiment, NIT-1-cellen werden gekleurd met TMRM en co-gekweekt met Picogreen gekleurde Jurkat cellen op een E: T-verhouding van 50:1. Jurkat-cellen zijn een humane T-cel lijn die is MHC verkeerde. NIT-1-cellen aangehouden mitochondriale membraanpotentiaal gedurende de gehele duur van de 400 minuten co-incubatie periode. Jurkat-cellen hadden geen invloed op NIT-1 clusters en dus, niet laten doden. </li></ol><img src="files/ftp_upload/2724/2724fig1.jpg" alt="Figuur 1"> Figuur 1 vertegenwoordiger gevolg van CML gebruiken als doelcellen primaire eilandjes geïsoleerd van immunodeficiëntie NOD.Rag1-/ -. Muizen en splenocyten van NOD.AI4α / β transgene muizen. Doelstellingen en effectoren werden samen gekweekt gedurende 16 uur. Procent specifieke lysis neemt toe naarmate de Effector: Target-ratio toeneemt. Video 1. Mouse beta cellijn NIT-1 was bevlekt de mitochondriale membraanpotentiaal kleurstof TMRM (rood). Geactiveerde autoreactieve CD8 + T-cellen AI4 (Stained groen met Picogreen) werden samen gekweekt met deze NIT-1-cellen bij E: T-verhouding van 50:1. NIT-1 mitochondriale membraanpotentiaal dissipated geleidelijk in een 400-minuten duur, maar alleen in de clusters die de interactie met groene AI4 T-cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/video.mov">Klik hier om video te bekijken</a> . Video 2. NIT-1-cellen werden dezelfde gekleurd zoals beschreven in de Video 1 en co-gekweekt met Picogreen gebrandschilderde humane T-cellijn Jurkat. NIT-1-cellen waren in staat om mitochondriale membraanpotentiaal doordacht de duur van 400 minuten te houden. Jurkat-cellen hadden geen invloed op NIT-1 clusters en dus niet het braken doden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/Video2.mp4">Klik hier om de video te bekijken</a> .

<ol><li>Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIT-1%2C+a+pancreatic+beta-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD%2FLt+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40, 842-849 (1991).</li>
<li>Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mt-Nd2a+modifies+resistance+against+autoimmune+Type+1+diabetes+in+NOD+mice+at+the+level+of+the+pancreatic+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell.</a> Diabetes. , (2010).</li>
<li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+mitochondrial+polarization+and+depolarization+with+cationic+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores.</a> Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).</li>
<li>Abel, M., Krokowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+immune-mediated+%28type+1%29+diabetes+mellitus%3A+potential+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy.</a> BioDrugs. 15, 291-301 (2001).</li>
<li>Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+resistance+of+ALR%2FLt+mouse+beta+cells+to+autoimmune+destruction%3A+role+for+beta+cell-expressed+resistance+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).</li>
<li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+mediated+cell+death+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Mitochondria mediated cell death in diabetes.</a> Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).</li>
<li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+membrane+potential+%28deltapsi%28m%29%29+in+apoptosis%3B+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8, 115-128 (2003).</li>
<li>Dudek, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T-cells+from+T-cell+receptor+transgenic+NOD8.3+mice+destroy+beta-cells+via+the+perforin+and+Fas+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways.</a> Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).</li>
<li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li>
</ol>

Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Universiteit van Florida Institutional Animal Care en gebruik Comite.

Cytotoxische T-cel gemedieerde beta celdood is de belangrijkste pathofysiologie van T1D 5. CML testen met behulp van 51 Cr vrijgeven ons toelaten om de graad van effector-target response 6 studiepunten. Echter, de gedetailleerde proces en de paden van T-cel-gemedieerde celdood beta nog steeds niet volledig begrepen. Omdat mitochondriën zijn van cruciaal belang voor de bèta-celfunctie en dood 7, richtten we ons op de mitochondriale veranderingen tijdens de visuele CML. Mitochon...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> Cr-51 </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEZ030500IMC </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-60 </td><td></td></tr><tr><td> Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td><td></td></tr><tr><td> Picogreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7581 </td><td></td></tr><tr><td> AI4 mimotope </td><td> mimotopes.com </td><td> aminozuursequentie: YFIENYLEL </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 </td><td> R &amp; D </td><td> 485-MI </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumine </td><td> Sigma </td><td> A8412 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Cellgro </td><td> 25-060-Cl </td><td></td></tr><tr><td> MEM Niet-essentiële aminozuren </td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> Tweelingen </td><td> 400-109 </td><td></td></tr><tr><td> Fenol rood-vrij DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5303 </td><td></td></tr><tr><td> CO2 Incubator </td><td> Thermo Fisher </td><td> HeraCell 150i </td><td> Bleef steriel voor celcultuur </td></tr><tr><td> Biologische veiligheid kast </td><td> Thermo Fisher </td><td> Forma 1440 </td><td></td></tr><tr><td> Wegwerp cultuur buizen, 6x50 mm Lime Glas </td><td> Visser </td><td> 14 tot 958-A </td><td></td></tr><tr><td> Gamma Counter </td><td> Perkin Elmer </td><td> Wizard 1470 Automatic Gamma Counter </td><td></td></tr><tr><td> Confocale microscoop </td><td> Zeiss </td><td> LSM 510 Meta Confocale </td><td> Met gemotoriseerde podium en levende cellen kamer </td></tr><tr><td> Pipet (1 ml, 200μl, 20μl, 10μl, 2μl) </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubes (Amber) </td><td> Visser </td><td> 50819772 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuge </td><td> Sorvall Legend RT + </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> Hemacytometer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 267110 </td><td></td></tr><tr><td> Upright Microscoop </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop40 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ Muizen </td><td> The Jackson Laboratory </td><td> 004347 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ Muizen </td><td> The Jackson Laboratory </td><td> 004348 </td><td></td></tr><tr><td> NOD-AI4α / β F1 muizen </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Gefokt in UF dier faciliteit </td></tr></tbody></table>

methoden om beta cell death gemedieerd beoordelen door cytotoxische t lymfocyten

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is een T-cel gemedieerde auto-immuunziekte. Tijdens de pathogenese, de patiënten worden steeds meer insulinopenic zoals insuline productie verloren is gegaan, vermoedelijk dit voortvloeit uit de vernietiging van pancreatische beta-cellen door T-cellen. Inzicht in de mechanismen van beta-celdood tijdens de ontwikkeling van T1D zal inzichten verschaffen om een ​​effectieve behandeling voor deze ziekte te genereren. Cel-gemedieerde lymphocytotoxicity (CML) assays van oudsher de gebruikte radionuclide Chroom 51 (51 Cr) om doelcellen label. Deze doelstellingen worden vervolgens blootgesteld aan effector cellen en het vrijkomen van 51 Cr van target cellen wordt gelezen als een indicatie van de lymfocyt-gemedieerde celdood. Remmers van celdood resulteren in een verminderde afgifte van 51 Cr. Als effector cellen, gebruikten we een geactiveerde autoreactieve clonale populatie van CD8 + cytotoxische T lymfocyten (CTL) geïsoleerd van een muis voorraad transgene voor zowel de alfa-en bèta-ketens van de AI4 T-cel receptor (TCR). Geactiveerde T-cellen AI4 werden samen gekweekt met 51 Cr gelabelde doelwit NIT cellen voor 16 uur, vrijlating van 51 Cr werd opgenomen om specifieke lysis te berekenen Mitochondriën deel te nemen aan vele belangrijke fysiologische gebeurtenissen, zoals de productie van energie, de regulatie van signalering transductie, en apoptose. De studie van de beta cel mitochondriale functionele veranderingen tijdens de ontwikkeling van T1D is een nieuw gebied van onderzoek. Met behulp van de mitochondriale membraanpotentiaal kleurstof tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) en confocale microscopische live cell imaging, we gecontroleerd mitochondriale membraanpotentiaal loop van de tijd in de beta-cellijn NIT-1. Voor beeldvorming studies werden effector AI4 T-cellen gelabeld met de fluorescente kleurstof Picogreen nucleaire kleuring. NIT-1-cellen en T cellen werden gekweekt in co-chambered dekglaasje en gemonteerd op de microscoop podium uitgerust met een live-cell kamer, gecontroleerd bij 37 ° C, met 5% CO 2, en bevochtigd. Tijdens deze experimenten foto&#39;s werden genomen van elke cluster om de 3 minuten voor 400 minuten. Meer dan een cursus van 400 minuten, zagen we de afvoer van mitochondriale membraanpotentiaal in de NIT-1 cel clusters waar AI4 T-cellen werden bevestigd. In de gelijktijdige controle-experiment waar NIT-1-cellen werden samen gekweekt met MHC verkeerd afgestemd menselijke lymfocyten Jurkat cellen, mitochondriale membraanpotentiaal intact gebleven. Deze techniek kan worden gebruikt om real-time veranderingen in de mitochondriale membraanpotentiaal in cellen onder aanval van cytotoxische lymfocyten, cytokines, of andere cytotoxische reagentia te observeren.

Cel-gemedieerde lymphocytotoxicity (CML) testen kunnen worden gebruikt voor het autoreactieve reacties en onderzoek naar mechanismen van celdood in vitro test. Echter, met behulp van live-cell confocale microscopische beeldvorming technieken met fluorescente kleurstoffen, het type en de kinetiek van celdood en gebruik gemaakt van de paden worden bestudeerd in meer detail.

Methoden om Beta Cell Death gemedieerd beoordelen door cytotoxische T lymfocyten

Type 1 diabetes (T1D) is een T-celgemedieerde autoïmuunziekte. Tijdens de pathogenese worden patiënten progressief meer insulinopenisch naarmate insuline ...

Diabetes type 1 is een auto-immuunziekte waarbij insuline-secreterende pancreatische bètacellen worden vernietigd door autoreactieve T-cellen. Inzicht in de betrokken mechanismen zal helpen bij het ontwikkelen van een effectieve genezing voor deze ziekte. Hier worden twee methoden gedemonstreerd om de specifieke vernietiging van pancreatische bètacellen door cd8-positieve T-cellen in vitro waar te nemen: een op chromium 51 gebaseerde cel-gemedieerde lymfocytotoxiciteitsanalyse (CML-assay) en een visuele CML-assay.CD8-positieve T-effectorcellen worden eerst geprepareerd uit muizmilten om een CML-assay uit te voeren; Target bèta-cellen uit Knit 1 of Knit 4 worden gelabeld met chroom-51 en gecocultuurd met de effectorcellen. Wanneer de target bèta-cellen worden gedood, komt het chroom-51 vrij. De supernatanten en cellysaten worden vervolgens verzameld en de radioactiviteitsniveaus, die de mate van celdood aangeven, worden gemeten met een gammacounter. Om een visuele CML-assay uit te voeren, worden Target bèta-cellen uit Knit 1 en Knit 4 gelabeld met de mitochondriale potentiaal kleurstof TM RM en worden de effectorcellen gelabeld met PicoGreen.De cellen worden gecombineerd en er wordt live cell imaging uitgevoerd om de snelheid van celsterfte te onderzoeken, aangeduid door de dissipatie van het mitochondriale membraanpotentiaal. Het belangrijkste voordeel van deze assay ten opzichte van traditionele assays, zoals de chroomvrijmakingsassay, is dat we de sterfte van bètacellen in real-time kunnen observeren. Aanvullende voordelen zijn de mogelijkheid om vast te stellen of de door CD8 T-cel gemedieerde sterfte van bètacellen contactafhankelijk is, en dat deze assay kan worden uitgebreid met fluorescentie-indicatoren om de routes van bètacelsterfte in kaart te brengen.Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden over de pathogenese van elke ziekte waarbij cytotoxische T-cellen een rol spelen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot therapie en mogelijk diagnostiek, aangezien de mitochondriale functie essentieel is voor zowel de overleving als de fysiologie van bètacellen. Jing Chen en ik zullen deze procedure demonstreren.De doelcellen die in deze demonstratie worden gebruikt, zijn de muize-bètacellijnen knit one en knit four. De Jurkat CD3+ menselijke lymfocytencellijn, die muize-bètacellen niet herkent en doodt, wordt gebruikt als negatieve controle. De effectorcellen die hier worden gebruikt, zijn autoreactieve CD8+ T-cellen verkregen uit de milten van NOD AI4 alpha beta F1-muizen van drie tot vier weken oud. Om de cellen te verkrijgen, begint u door de milten in een glazen Dounce-homogenisator van 7 mL te plaatsen met 5 mL ijskoude HBSS. Homogeniseer de milten met de Dounce-homogenisator en breng de celsuspensie vervolgens over naar een conische buis en centrifugeer deze bij 250 Gs gedurende vijf minuten. Gooi na het centrifugeren het supernatant weg. Om vervolgens de rode bloedcellen te verwijderen, resuspendeert u het pellet in 5 mL hypotone oplossing per milt. Incubeer dit gedurende vijf minuten op ijs.Was na de incubatie het celpellet twee keer met 10 milliliters ijskoud HBSS door middel van centrifugatie. Resuspendeer de cellen tussen elke wasbeurt in 10 milliliters ijskoud HBSS. Tel vervolgens de cellen met een hemocytometer nadat de celgetallen zijn bepaald.Centrifugeer opnieuw, resuspendeer de cellen vervolgens in aangevuld RPMI 1640 tot een dichtheid van 5 × 10⁶ cellen per milliliter en zaai de cellen uit met een dichtheid van 5 × 10⁶ per milliliter in een T 75-fles. Voeg ten slotte AI4myope en IL2 toe aan de fles in uiteindelijke concentraties van respectievelijk 0,1 µM en 25 units per milliliter om de cellen te activeren. Incubeer de fles in een 5% CO2-incubator bij 37 °C gedurende drie dagen. De geactiveerde cellen kunnen nu worden gebruikt voor een ACROMIUM 51-gebaseerde CML-assay of een visuele CML-assay.De celgemedieerde lymfocytoxiciteitstest, oftewel de CML-assay, maakt hier gebruik van de afgifte van chroom 51 uit doelcellen als indicator voor CD8-gemedieerde bètaceldood. Om MIN6- of MIN4-doelbètacellen te labelen met chroom 51, begint u met het uitplaten van deze cellen met een dichtheid van 5 × 10⁴ cellen per putje van een 96-wells plaat in 200 µL gesupplementeerd DMEM; incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2. Verdun de volgende dag chroom 51 in gesupplementeerd DMEM tot een concentratie van 1 µCi per 20 µL.Voeg vervolgens 20 µL van het verdunde chroom 51 toe aan elke wel met de doelbètacellen om een concentratie van één µCi per wel te bereiken. Plaats de plaat in een bevochtigde incubator op 37 °C met 5% CO2 en incubeer gedurende drie uur na de incubatie. Aspireer het medium en was de cellen drie keer met vers cultuurmedium.Voeg vervolgens medium toe aan de geactiveerde CD8-positieve effectorcellen, zodanig dat het uiteindelijke volume dat aan elke well wordt toegevoegd 200 µL bedraagt. Combineer de effector- en target-bètacelculturen in de gewenste E:T-ratio's; hier worden ratio's van 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1 en 0,25:1 gebruikt om controles voor spontane lyse voor te bereiden. Voeg vers medium toe aan zes wells van de target-bètacellen.Plaats vervolgens de plaat in de incubator en co-cultiveer de effector- en doelcellen gedurende 16 uur. Gebruik de volgende dag een meerkanaalpipet om het supernatant over te brengen naar zes glazen buisjes van 50 millimeter. Voeg vervolgens 100 µL 2% SDS toe aan de plaat om de cellen te lyseren en pipetteer dit voorzichtig enkele keren op en neer.Breng het cellysaat over naar een nieuwe reeks van zes glazen buisjes van 50 millimeter. Voeg vervolgens 100 µL steriel water toe aan elke put en pipetteer dit op en neer om ervoor te zorgen dat al het cellysaat wordt verzameld; voeg dit toe aan de buisjes met cellysaat om de mate van bètaceldestructie te bepalen. Meet de radioactiviteit in het supernatant en het lysaat met een gammacounter zodra de tellingen zijn uitgevoerd.Bepaal de specifieke lysis door het percentage tellingen in de supernatanten van de spontane lysiscontrole af te trekken van het percentage tellingen in de experimentele supernatanten, zoals weergegeven in deze vergelijking. Om T-celgemedieerde bètaceldood in real-time te onderzoeken. Het mitochondriale membraanpotentiaal wordt gemonitord door live-cell imaging van co-culturen van doel- en effectorcellen.Ter voorbereiding op de microscopie werden doel-bètacellen gezaaid op gemodificeerd en gesteriliseerd coverglas met acht kamertjes bij een dichtheid van 5 × 10⁴ cellen per kamertje. Plaats de slides in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 en laat de cellen 48 uur groeien. Voeg op de dag van het experiment de mitochondriale membraanpotentiaal-kleurstof tetraethylbroomide methyl ester (TMRM) toe in een concentratie van 25 nM in supplementeerden DMEM zonder fenolrood en incubeer gedurende 30 minuten.Zodra de cellen zijn gekleurd met TMRM, wordt het medium vervangen door vers medium dat vijf nanomolaire TMRM bevat om de evenwichtsverdeling van de kleurstof te handhaven. Tel vervolgens de geactiveerde effector AI four T-cellen of de controle jerk it-cellen met behulp van een hemocytometer en resuspendeer de cellen in supplementair DMEM zonder fenolrood in 15 milliliter conische buisjes in de juiste concentratie. Voeg daarna PicoGreen toe aan de geactiveerde effectorcellen of de jerk it-controlecellen tot een eindconcentratie van één microliter per milliliter.Wikkel de buis in aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen en laat deze na de incubatie vijf minuten incuberen bij kamertemperatuur. Was de cellen drie keer door fenolrood-vrij DMEM toe te voegen, kort te mengen en te centrifugeren bij 250 GS gedurende vijf minuten. Om de cellen voor beeldvorming te verzamelen, wordt het chamber slide geplaatst op de tafel van een confocale microscoop die is uitgerust met een gemotoriseerde tafel en een bevochtigde live-cell imaging kamer bij 37 °C en 5% CO2.Voeg de geactiveerde, met Pico Green gekleurde effectorcellen toe aan de kamers in de effector-targetratio die hier wordt beoordeeld. De gefotografeerde ET-ratio is 50:1; stel de imaging-software zo in dat er elke drie minuten beelden worden verzameld in vier wells, met drie locaties per well, 300 frames per locatie en excitatie met gebruik van de juiste filtersets voor TMRM en Pico Green. Zodra alle beelden zijn verzameld, moeten deze hier worden geconverteerd voor publicatie.Fiji en Image J worden gebruikt met een bio-formats plugin van loci. Meer details met betrekking tot videoconversie zijn te vinden in de bijbehorende geschreven tekst. Een celgemedieerde lymfocytotoxiciteitstest of CML-assay werd uitgevoerd met gebruik van chroom 51 zoals beschreven in deze video.Zoals hier wordt getoond, neemt het percentage specifieke lysis op de Y-as toe naarmate de effector-target-ratio op de x-as toeneemt. Om celdood via live-cell imaging te beoordelen, werd de muizen bètacellijn KNIT1 gekleurd met de mitochondriale membraanpotentiaal-kleurstof TMRM, weergegeven in rood. Geactiveerde autoreactieve I4 CD8-positieve T-cellen werden groen gekleurd met PicoGreen, en de twee celtypen werden samen gekweekt bij een E:T-ratio van 50:1, zoals hier te zien is. De mitochondriale membraanpotentiaal van KNIT1 nam geleidelijk af gedurende een periode van 400 minuten, maar alleen in de clusters die interacteerden met de groene I4 T-cellen. Als controle-experiment werden gekleurde KNIT1-cellen in plaats daarvan gekweekt met PicoGreen-gekleurde MHC-mismatched menselijke Jurkat T-cellen, zoals hier te zien is.Knit one-cellen waren in staat om het mitochondriale membraanpotentiaal gedurende 400 minuten te handhaven. Circuit-cellen interacteerden niet met knit one-clusters en induceerden daarom geen celdood. Eenmaal beheerst.Deze techniek duurt ongeveer vijf dagen, inclusief de celpreparatie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe het membraanpotentiaal van bètacellen verandert wanneer deze worden aangevallen door autoreactieve T-cellen. Vergeet niet dat het werken met radio-isotopen gevaarlijk kan zijn; er moet passende training worden gevolgd en er moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.

methods-to-assess-beta-cell-death-mediated-by-cytotoxic-t-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Het chromium afgifte assay, een gemeenschappelijke test voor het detecteren cytotoxische T-celactiviteit, heeft verschillende beperkingen. Gebruikmakende van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen en humane borsttumor lijn, SKBR3, in dit artikel is een impedantie-gebaseerde aanpak onderzocht kan detecteren celdoding.

Het bepalen van optimale cytotoxische activiteit van de mens Her2neu Specifieke CD8 T cellen door vergelijking van de Cr51 afgifte test aan de xCELLigence System

The video showcases a flow cytometry-based assay for assaying immunodominance in cytotoxic T lymphocytes or CTL responses. Injected fluorescent target cells exhibit varying fluorescence corresponding to immunogenic epitopes. Post-spleen collection and sorting reveal a reduction in high-intensity fluorescent cells, confirming immunodominance in CTL responses.

An Assay to Evaluate Immunodominance in Cytotoxic T Lymphocyte Responses

This video demonstrates an imaging-based method to visualize transplanted luciferase-expressing beta cells into a non-obese diabetic immunodeficient mouse. The introduction of splenocytes from a diabetic mouse leads to progressive beta cell destruction, visually confirmed by declining luminescence after substrate introduction.

Imaging Transgenic Beta-Cells in an Immunodeficient Mouse Challenged with Diabetic Splenocytes

Dit protocol beschrijft een gevoelige, cel-gebaseerde cytotoxiciteit assay. Door het tellen van de afname in frequentie van levende doelwit CD4+ T-cellen in aanwezigheid van een toenemend aantal effector CD8+ T-cellen, staat deze assay toe de directe beoordeling van de cytolytische activiteit van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen.

Celgebaseerde flowcytometrie-test om cytotoxische activiteit te meten

Het vermogen om T-cel responsen in detail volgen in vivo is belangrijk voor de ontwikkeling van ons begrip van de immuunrespons. Hier beschrijven we het gebruik van fluorescerende doel arrays (FTA's) in een in vivo T-cel test die&gt; 250 parameters beoordeelt gelijktijdig door flowcytometrie.

Het gebruik van TL-Target Arrays voor het beoordelen van de T-cel responsen<em&gt; In vivo</em

We beschrijven hier een protocol om te onderzoeken van de cytotoxiciteit van pre-geactiveerde CD8+ T cellen tegen kankercellen door het detecteren van apoptotic kanker cellen via real-time microscopie. Dit protocol kan mechanismen achter myeloïde cel-geïnduceerde T cel onderdrukking onderzoeken en evalueren van de verbindingen die zijn gericht op het aanvullen van T cellen via blokkade van onderdrukkende myeloïde immuuncellen.

Real-time detectie van In Vitro Tumor cel Apoptosis geïnduceerd door CD8+ T cellen te bestuderen immuun onderdrukkende functies van Tumor-infiltreren myeloïde cellen

We beschrijven hier een flow Cytometry-based in vivo doden assay die het mogelijk maakt onderzoek van immunodominance in chemo T lymfocyten (CTL) Reacties op een model tumor antigeen. Wij bieden voorbeelden van hoe deze elegante assay kan worden gebruikt voor mechanistische studies en voor de effectiviteit van geneesmiddelen testen.

Maatwerk in vivo chemo tests om Immunodominance in tumor-specifieke CD8+ T Cell responsen te bestuderen

Dit artikel beschrijft een protocol voor het genereren van antigeen-specifieke CD8 T-cellen, en de uitbreiding ervan in vitro, met als doel het opleveren van een hoog aantal functionele T-cellen voor gebruik in vitro en in vivo.

Zeer efficiënte generatie van antigeen-specifieke cytotoxische T-cellen voor de functionele test in een auto-immune diabetes model

Dit protocol beschrijft de chirurgische generatie van orthotopic alvleesklier tumoren en de snelle vertering van vers geïsoleerde lymfatische alvleesklier tumoren. Na de spijsvertering kunnen levensvatbare immuuncelpopulaties worden gebruikt voor verdere downstream-analyse, inclusief ex-vivo stimulatie van T-cellen voor intracellulaire cytokine detectie door Flowcytometrie.

Generatie van Orthotopic alvleesklier tumoren en ex vivo karakterisering van tumor-Infiltrerende T cel cytotoxiciteit

Deze studie maakt gebruik van multi-kleuring fluorescentie-gebaseerde markers van celdood en apoptose in combinatie met confocale microscopie om cytokine-geïnduceerde apoptose en β-celspecifieke dood in pancreaseilandjes te beoordelen. Het onthult ruimtelijke en temporele veranderingen in celdood en apoptose als reactie op extracellulaire stimuli.

Geïsoleerde behandeling van pancreaseilandjes en meting van apoptose

Leer twee in-vitromethoden om CD8+ T-cel-gemedieerde bètaceldood bij type 1 diabetes te meten: een Chromium-51-release-assay en live-celbeeldvorming met mitochondriale membraanpotentiaalverf.

Methoden om Beta Cell Death gemedieerd beoordelen door cytotoxische T lymfocyten

Meer video's verkennen