Name: Genereren van Multivirus-specifieke T-cellen te voorkomen / virale infecties te behandelen na allogene hematopoietische stamceltransplantatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Leer een snelle GMP-conforme methode voor het genereren van multivirus-specifieke cytotoxische T-lymfocyten uit dendritische cellen en donor-PBMC's. Deze techniek verbetert de T-celimmunotherapie na allogene stamceltransplantatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door een Production bijstand voor cellulaire therapieën (contract NIH-NHLBI (HB-10-03) HHSN26820100000C) (CMR), een gespecialiseerde centra voor celtherapie Grant NIH-NHLBI een U54 HL081007 (CMR), een ASBMT Young Investigator Award (UG en JV), een leukemie en lymfoom Society Special Fellow in Clinical Research Award (UG), en een Amy Strelzer Manasevit Scholar Award (AML).

1. DC nucleofection <ol><li> Oogst monocyt-afgeleide DC's, die zijn verrijkt met behulp van plastic hechting, gekweekt voor 5 dagen met behulp van Cell Genix Media aangevuld met IL4 (1000U/ml), GMCSF (800IU/ml) en verder gerijpt voor 24 uur gebruik van de DC rijping cytokines IL4 (1000U / ml), GMCSF (800IU/ml), IL6100ng/ml, TNF-α 10ng/ml, IL1-β 10ng/ml en PGE2 (1μg/ml) 1, door de zachte resuspensie met een 3 ml transferpipet. </li><li> Count levensvatbare DC's met behulp van trypan blauw, transfer naar 3x 15ml buizen met niet minder dan 0.5x10 6 en niet meer dan 2x10 6 cellen / buis. </li><li> Centrifuge DC's voor 10 minuten @ 200g. Gedurende deze tijd pre-warm Cell Genix media aangevuld met de DC rijping cytokines (DC rijping media) - 2ml/well in drie putjes van een 12-well weefselkweek behandeld plaat in een 37 ° C / 5% CO 2 incubator. </li><li> Zodra cellen klaar bent met spinnen, aspireren het supernatans en voeg de desbetreffende DNA-plasmiden aan elk van de buizen in een uiteindelijke concentratie van 5μg DNA / buis. In dit geval voegt u de plasmide coderend voor IE1-pp65 om buis # 1, Hexon-Penton tube naar # 2, en EBNA1-LMP2-BZLF1 van de buis # 3. </li><li> Resuspendeer DCs en DNA met 100μl van Amaxa nucloefection oplossing, goed mengen en over te dragen aan de nucleofection cuvetten. </li><li> Plaats cuvetten in de 4D nucleofector, kiest u het programma CB150 (Amaxa / Lonza), en druk op start. </li><li> Direct na het nucleofection toe te voegen 500μl van de 2 ml voorverwarmd Cell Genix DC rijping media om de cuvet, meng voorzichtig door en neer te pipetteren 2-3 keer, en overdracht nucleofected DC's naar de voorbereide 12-wells plaat met de resterende 1,5 ml voorverwarmd DC rijping media. Transfer naar de 37 ° C / 5% CO 2 incubator voor een verdere 12-18u. </li></ol> 2. T-cel stimulatie <ol><li> Oogst en tellen nucleofected DC's, en stralen bij 30Gy. Was eenmaal met 10 ml van de CTL medium (45% RPMI, 45% Clicks EHAA, 10% FBS, 2mm Glutamax) en resuspendeer @ 3 x 10 5 DC's per ml van de CTL media. </li><li> Pool een minimum van 7.5x10 5 (2,5 ml) en een maximum van 15x10 5 (5 ml) van DCs met elk van de plasmiden en de overdracht van de gepoolde DC's naar de G-Rex apparaat die vervolgens zal worden geplaatst in de incubator. </li><li> Voor de voorbereiding van de reagerende cellen gebruiken ofwel voorheen bevroren PBMCs of niet-adherente mononucleaire cellen die achterblijven na de DC-selectie (de naleving of CD14 selectie). Ontdooi de cellen, transfer naar voorverwarmde kweekmedium, een keer wassen met CTL media. Resuspendeer de cellen in CTL Media, de telling van de cellen en breng ze naar een concentratie van 2x10 6 cellen per ml. Neem 15x10 6 cellen of 7.5ml en te vullen met 30000U IL4 (1000U/ml -. Finale conc) en 300ng IL7 (10ng/ml - finale conc.). </li><li> Overdracht 7.5ml van PBMC (15x10 6 cellen) van de G-Rex en vul de bioreactor met CTL media om een totaal volume van 30 ml. </li><li> Cultuur van de G-Rex voor 6-7 dagen in een 37 ° C / 5% CO 2 bevochtigde incubator. </li></ol> 3. T-cel expansie <ol><li> Op dag 6-7, aspiratie 10 ml van de media, en meng de cellen in de resterende 20 ml van de media met een 10 ml pipet en tel levensvatbare cellen met behulp van trypan blauw. Als er &lt;50x10 6 aan te vullen met verse media + cytokines. Als er&gt; 50x10 6 cellen te verwijderen 10 ml celsuspensie, over te dragen aan een nieuwe G-Rex, en dan voeden zowel de G-Rexs met verse CTL media + cytokines. </li><li> Cultuur voor een extra 4-6 dagen. Als er voldoende cellen zijn uitgebreid, voert fenotypische en functionele karakterisatie van het CTL en cryopreserve eigen risico voor toekomstig gebruik. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Een schema van onze FDA-goedgekeurde multivirus-specifieke CTL generatie proces is weergegeven in figuur 1. In tegenstelling tot de conventie multivirus CTL protocollen die adenovectors en EBV-LCL te gebruiken om virus-reactieve T-cellen te stimuleren 2 hebben we infectieus virus materiaal vervangen door DNA plasmiden die coderen voor meerdere antigenen afgeleid van elk van de virussen 3. Het stimuleren van trivirus CTL ontwierpen we drie multicistronic plasmiden die coderen voor Hexon en Penton van adenovirus, IE1 en pp65 van CMV, en EBNA1, LMP2, en BZLF1 van EBV. Deze antigenen zijn gekozen op basis van bemoedigende klinische resultaten van onze eigen en andere groepen waaruit blijkt dat T-cellen gericht tegen Adv-Hexon en Penton 2,4-6, en om CMV-1E1 en om CMV-pp65 beschermend zijn in vivo 7. Voor EBV, EBNA1 is een immunodominant CD4 + T-cel doelantigeen uitgedrukt in alle EBV-geassocieerde maligniteiten en in normale EBV-geïnfecteerde B-cellen 8,9, LMP2-immunogeen is over meerdere HLA-typen en uitgedrukt in de meeste EBV maligniteiten, 10,11 terwijl de BZLF1 codeert voor een immunodominant, directe vroege lytische cyclus antigen dat zowel CD4 + en CD8 + T-cellen stimuleert van de meeste particulieren en is waarschijnlijk van belang voor de samenwerkingntrol van cellen vermenigvuldigend virus 12. Verder te optimaliseren onze productie-methoden die we samen met de Natuur-technologie, die geminimaliseerd, antibiotica-vrij (FDA-compatibel) plasmiden gegenereerd voor CTL stimulatie 13,14. Met behulp van deze strategie die we consequent te bereiken nucleofection efficiëntie van&gt; 35% met behoud van hoge levensvatbaarheid van de cellen (gegevens niet getoond) 3. Figuur 2 blijkt dat de frequentie van de virus-specifieke T-cellen in reactie op geoptimaliseerde DNA plasmiden zoals gemeten door IFNy ELISPOT, was groter dan in de respons op de conventionele pShuttle-based expressieplasmiden de uiting van de dezelfde antigenen (n = 8 Adenovirus, n = 4 CMV, en n = 2 EBV). De optimale verhouding tussen DC: PBMC was belangrijk voor sterke T-cel stimulatie zoals weergegeven in figuur 3, waar een verhouding van 1:50 sub-optimale activatie geproduceerd in vergelijking met een 01:20 S: R-verhouding (n = 2 donoren). Productie van voldoende CTL nummers met een brede antigen specificiteit is een eerste vereiste voor klinische werkzaamheid tegen alle drie virussen. Dit wordt bereikt door CTL cultuur in de G-Rex, die een superieure T-cel expansie ondersteunt in vergelijking met conventionele platen met 24 putjes (Figuur 4A) 15, terwijl de toevoeging van IL4 en IL7 om culturen verhoogt het repertoire en specificiteit voldoen als weergegeven in figuur 4B waar de frequentie van de T-cellen reactief tegen het CMV-pp65-afgeleide HLA-A2 resticted NLV peptide werd beoordeeld in culturen gegenereerd in de aanwezigheid of afwezigheid van IL4 en / of IL7 16,17. Voor de beoordeling van het fenotype en functionele capaciteit van de geëxpandeerde cellen voeren we flowcytometrische analyse, intracellulaire cytokine kleuring / IFNy ELISPOT, en Cr 51 release assays op het uiteindelijke product voor cryopreservatie / infusie. Typisch de gegenereerde cellen polyklonaal met een gemengde bevolking van CD4 + en CD8 + T-cellen met antigeen-specificiteit aantoonbaar in zowel de T-cel compartimenten. De CTL zijn in staat om virale antigeen tot expressie brengen target cellen te doden, maar niet het virus negatieve gedeeltelijk HLA gematchte targets, wat aangeeft dat zij niet graft-versus-host disease (GvHD) te induceren in vivo (figuur 5). <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. RCTL generatie protocol. Eerst worden DCs nucleofected met het virale antigeen-encoding plasmiden en vervolgens gemengd met autologe PBMC's op een R: S van 10 of 20:1. Cellen zijn uitgebreid in de G-Rex voor 10-14 dagen in de aanwezigheid van IL4 en IL7, vervolgens geoogst, geteld, getest voor de functie, identiteit en steriliteit, en dan gecryopreserveerd voor klinisch gebruik. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Optimized DNA plasmiden induceren superieure T-cel activatie in vitro. DC werden nucleofected met geoptimaliseerde, FDA-compliant plasmiden die coderen voor Hexon en Penton (ADV), IE1 en pp65 (CMV), en EBNA1, LMP2, en BZLF1 (EBV) of conventionele pShuttle plasmiden die coderen voor de dezelfde antigenen. Deze werden gebruikt om de T-cellen te stimuleren en de specificiteit werd geanalyseerd door IFNy ELISPOT 10 dagen na de stimulatie. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3 Optimale DC:. T-cel-ratio's voor CTL activatie. DC's van twee donoren nucleofected met alle drie de geoptimaliseerde plasmiden en vervolgens gebruikt om autologe PBMC's te stimuleren op 1:20 of 1:50 DC: PBMC verhouding. De frequentie van gereactiveerd T-cellen werd bepaald op dag 10 door IFNy ELISPOT. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. T-cel expansie in de G-Rex met behulp van de verbetering cytokines. Panel A geeft de G-Rex apparaat als CTL verschijning op de gas-permeabel membraan, geëvalueerd door microscopie. Een vergelijking tussen de cel-uitgang bereikt in conventie weefselkweek behandeld platen vs G-Rex is ook getoond. Panel B geeft de frequentie van CMV pentameer positieve CTL bereikt in culturen uitgebreid in de aanwezigheid van geen cytokine, IL4 alleen, IL7 alleen en IL4 + IL7. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Fenotype en functie van de uitgebreide CTL. Paneel A toont een representatief voorbeeld van het fenotype van de uitgebreide multivirus CTL, die polyklonale met een mengsel van CD4 + (45% - helper) en CD8 + (42% - cytotoxische) T-cellen, waarvan de meerderheid (95%) zich op het geheugen marker CD45RO + / CD62L +. Panel B geeft aan dat deze cellen specifiek zijn voor alle stimulerende antigenen en worden polyfunctioneel zoals beoordeeld door intracellulaire cytokine kleuring om de productie van IFNy en TNFa na antigen stimulatie op te sporen. Paneel C toont aan dat de uitgebreide CTL zijn functioneel, zoals gemeten door Cr 51-test. Autologe LCL, hetzij alleen of getransduceerd met een nul-vector of een adenovirale vector die CMV-pp65 werden gebruikt als teerkrijgt. Alloreactiviteit werd gemeten met behulp van allogene PHA ontploffing als een doel.

<ol><li>Kaka, A. S., Foster, A. E., Weiss, H. L., Rooney, C. M., Leen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+dendritic+cell+maturation+and+IL-12+producing+capacity+as+markers+of+function%3A+a+cautionary+tale%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Using dendritic cell maturation and IL-12 producing capacity as markers of function: a cautionary tale.</a> J Immunother. 31, 359-369 (2008).</li>
<li>Leen, A. M., Myers, G. D., Sili, U., Huls, M. H., Weiss, H., Leung, K. S., Carrum, G., Krance, R. A., Chang, C. C., Molldrem, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoculture-derived+T+lymphocytes+specific+for+multiple+viruses+expand+and+produce+clinically+relevant+effects+in+immunocompromised+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals.</a> Nat. Med. 12, 1160-1166 (2006).</li>
<li>Gerdemann, U., Christin, A. S., Vera, J. F., Ramos, C. A., Fujita, Y., Liu, H., Dilloo, D., Heslop, H. E., Brenner, M. K., Rooney, C. M., Leen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+of+DCs+to+generate+Multivirus-specific+T+cells+for+prevention+or+treatment+of+viral+infections+in+the+immunocompromised+host%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Nucleofection of DCs to generate Multivirus-specific T cells for prevention or treatment of viral infections in the immunocompromised host.</a> Mol. Ther. 17, 1616-1625 (2009).</li>
<li>Leen, A. M., Christin, A., Khalil, M., Weiss, H., Gee, A. P., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hexon-specific+CD4+and+CD8+T-cell+epitopes+for+vaccine+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of hexon-specific CD4 and CD8 T-cell epitopes for vaccine and immunotherapy.</a> J Virol. 82, 546-554 (2008).</li>
<li>Leen, A. M., Christin, A., Myers, G. D., Liu, H., Cruz, C. R., Hanley, P. J., Kennedy-Nasser, A. A., Leung, K. S., Gee, A. P., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+therapy+with+donor+T+cells+prevents+and+treats+adenovirus+and+Epstein-Barr+virus+infections+after+haploidentical+and+matched+unrelated+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte therapy with donor T cells prevents and treats adenovirus and Epstein-Barr virus infections after haploidentical and matched unrelated stem cell transplantation.</a> Blood. 114, 4283-4292 (2009).</li>
<li>Feuchtinger, T., Matthes-Martin, S., Richard, C., Lion, T., Fuhrer, M., Hamprecht, K., Handgretinger, R., Peters, C., Schuster, F. R., Beck, R., Schumm, M., Lotfi, R., Jahn, G., Lang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safe+adoptive+transfer+of+virus-specific+T-cell+immunity+for+the+treatment+of+systemic+adenovirus+infection+after+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Safe adoptive transfer of virus-specific T-cell immunity for the treatment of systemic adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation.</a> Br J Haematol. 134, 64-76 (2006).</li>
<li>Bunde, T., Kirchner, A., Hoffmeister, B., Habedank, D., Hetzer, R., Cherepnev, G., Proesch, S., Reinke, P., Volk, H. D., Lehmkuhl, H., Kern, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+from+cytomegalovirus+after+transplantation+is+correlated+with+immediate+early+1-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Protection from cytomegalovirus after transplantation is correlated with immediate early 1-specific CD8 T cells.</a> J. Exp. Med. 201, 1031-1036 (2005).</li>
<li>Leen, A., Meij, P., Redchenko, I., Middeldorp, J., Bloemena, E., Rickinson, A., Blake, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+immunogenicity+of+Epstein-Barr+virus+latent-cycle+proteins+for+human+CD4%28%2B%29+T-helper+1+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential immunogenicity of Epstein-Barr virus latent-cycle proteins for human CD4(+) T-helper 1 responses.</a> J Virol. 75, 8649-8659 (2001).</li>
<li>Bickham, K., Munz, C., Tsang, M. L., Larsson, M., Fonteneau, J. F., Bhardwaj, N., Steinman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBNA1-specific+CD4%2B+T+cells+in+healthy+carriers+of+Epstein-Barr+virus+are+primarily+Th1+in+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">EBNA1-specific CD4+ T cells in healthy carriers of Epstein-Barr virus are primarily Th1 in function.</a> J. Clin. Invest. 107, 121-130 (2001).</li>
<li>Straathof, K. C., Leen, A. M., Buza, E. L., Taylor, G., Huls, M. H., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+latent+membrane+protein+2+specificity+in+CTL+lines+from+patients+with+EBV-positive+nasopharyngeal+carcinoma+and+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of latent membrane protein 2 specificity in CTL lines from patients with EBV-positive nasopharyngeal carcinoma and lymphoma.</a> J. Immunol. 175, 4137-4147 (2005).</li>
<li>Hislop, A. D., Taylor, G. S., Sauce, D., Rickinson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+responses+to+viral+infection+in+humans%3A+lessons+from+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cellular responses to viral infection in humans: lessons from Epstein-Barr virus.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 587-617 (2007).</li>
<li>Steven, N. M., Annels, N. E., Kumar, A., Leese, A. M., Kurilla, M. G., Rickinson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+early+and+early+lytic+cycle+proteins+are+frequent+targets+of+the+Epstein-Barr+virus-induced+cytotoxic+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Immediate early and early lytic cycle proteins are frequent targets of the Epstein-Barr virus-induced cytotoxic T cell response.</a> J. Exp. Med. 185, 1605-1617 (1997).</li>
<li>Luke, J., Carnes, A. E., Hodgson, C. P., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+antibiotic-free+DNA+vaccine+vectors+utilizing+a+novel+RNA+based+plasmid+selection+system%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Improved antibiotic-free DNA vaccine vectors utilizing a novel RNA based plasmid selection system.</a> Vaccine. 27, 6454-6459 (2009).</li>
<li>Williams, J. A., Luke, J., Johnson, L., Hodgson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pDNAVACCultra+vector+family%3A+high+throughput+intracellular+targeting+DNA+vaccine+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">pDNAVACCultra vector family: high throughput intracellular targeting DNA vaccine plasmids.</a> Vaccine. 24, 4671-4676 (2006).</li>
<li>Vera, J. F., Brenner, L. J., Gerdemann, U., Ngo, M. C., Sili, U., Liu, H., Wilson, J., Dotti, G., Heslop, H. E., Leen, A. M., Rooney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+production+of+antigen-specific+T-cells+for+pre-clinical+and+clinical+applications+using+Gas-permeable+Rapid+Expansion+cultureware+%28G-Rex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Accelerated production of antigen-specific T-cells for pre-clinical and clinical applications using Gas-permeable Rapid Expansion cultureware (G-Rex.</a> Journal of Immunotherapy. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Vella, A. T., Dow, S., Potter, T. A., Kappler, J., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine-induced+survival+of+activated+T+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cytokine-induced survival of activated T cells in vitro and in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 3810-3815 (1998).</li>
<li>Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+4+%28IL-4%29+or+IL-7+prevents+the+death+of+resting+T+cells%3A+stat6+is+probably+not+required+for+the+effect+of+IL-4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4.</a> J. Exp. Med. 186, 325-330 (1997).</li>
<li>Heslop, H. E., Ng, C., Li, Y. C., Smith, C., A, C., Loftin, S. K., Krance, R. A., Brenner, M. K., Rooney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+restoration+of+immunity+against+Epstein-Barr+virus+infection+by+adoptive+transfer+of+gene-modified+virus-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term restoration of immunity against Epstein-Barr virus infection by adoptive transfer of gene-modified virus-specific T lymphocytes.</a> Nature Medicine. 2, 551-555 (1996).</li>
<li>Rooney, C. M., Smith, C. A., Ng, C., Loftin, S. K., Li, C., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+gene-modified+virus-specific+T+lymphocytes+to+control+Epstein-Barr+virus-related+lymphoproliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to control Epstein-Barr virus-related lymphoproliferation.</a> Lancet. 345, 9-13 (1995).</li>
<li>Einsele, H., Roosnek, E., Rufer, N., Sinzger, C., Riegler, S., Loffler, J., Grigoleit, U., Moris, A., Rammensee, H. G., Kanz, L., Kleihauer, A., Frank, F., Jahn, G., Hebart, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+cytomegalovirus+%28CMV%29-specific+T+cells+for+the+treatment+of+CMV+infection+not+responding+to+antiviral+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy.</a> Blood. 99, 3916-3922 (2002).</li>
<li>Walter, E. A., Greenberg, P. D., Gilbert, M. J., Finch, R. J., Watanabe, K. S., Thomas, E. D., Riddell, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cellular+immunity+against+cytomegalovirus+in+recipients+of+allogeneic+bone+marrow+by+transfer+of+T-cell+clones+from+the+donor%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor.</a> N. Engl. J. Med. 333, 1038-1044 (1995).</li>
</ol>

Juan F. Vera is een consultant voor Wilson Wolf Manufacturing. De andere auteurs hebben geen relevante mededelingen.

Virale infecties met aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit bij patiënten die immuungecompromitteerd zijn door hun ziekte of de behandeling ervan. Na HSCT, bijvoorbeeld, zijn infecties veroorzaakt door aanhoudende herpesvirussen zoals EBV en CMV, alsmede door respiratoire virussen, zoals het Respiratoir Syncytieel Virus (RSV), bekend, terwijl het belang van infecties veroorzaakt door Adv, BK-virus, en het menselijk herpesvirus (HHV) -6 meer recentelijk gewaardeerd. Terwijl de farmacologische middelen zijn standaard therapie voor sommige infecties, zij er aanzienlijke toxiciteit, het genereren van resistente varianten, en zijn vaak niet effectief. In tegenstelling, zijn virus-specifieke T-cellen afgeleid van stamceldonoren bewezen veilig en effectief voor de preventie en behandeling van virale infectie of ziekte in de hemopoietische stamceltransplantatie (HSCT) instelling 2,5,6,18-21. Echter, de bredere implementatie van T-cel-immunotherapie uiteindelijk beperkt door de kosten, complexiteit en de tijd die nodig is voor CTL productie. Onze nieuwe en snelle aanpak van de multivirus CTL, beschreven in de huidige manuscript, het genereren van aanzienlijk zou moeten toenemen van de haalbaarheid van cytotoxische T cel-therapie voor virale ziekten, waardoor de strategie om een ​​standaard van zorg voor de immuungecompromitteerde gastheer te worden. Het gebruik van plasmide nucleofected DC&#39;s als APC&#39;s in staat stelt antigeen presentatie op zowel MHC klasse I en II zonder de concurrentie van virale vectoren of zelfs van meerdere virale antigenen worden uitgedrukt binnen een enkele cel, aangezien verschillende DC populaties worden gebruikt voor elk plasmide 3. Het gebruik van IL-4 / 7 verhoogt T-cel overleving en proliferatie, die navenant helpt bij het ​​verhogen van de frequentie en repertoire te reageren antigeen-specifieke T-cellen 16,17. Ten slotte is cultuur in de G-Rex reduceert T cel apoptose tijdens de cultuur. Gasuitwisseling (O 2 in en CO 2 uit) gebeurt over een gas-permeabel membraan silicium aan de voet van de kolf, het voorkomen van hypoxie terwijl een grotere diepte van medium boven de cellen, waardoor meer voedingsstoffen en verdunnen van afvalstoffen. Dit platform kan ook worden uitgebreid met bijkomende virussen als bij het beschermende antigenen worden geïdentificeerd.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> CellGenix </td><td> CellGenix </td><td> 2005 </td></tr><tr><td> IL4 </td><td> O &amp; O-Systems </td><td> 204-IL/CF </td></tr><tr><td> IL7 </td><td> Peprotech </td><td> 200-15 </td></tr><tr><td> Hyclone RPMI 1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30096.01 </td></tr><tr><td> Human AB serum </td><td> Valley Biomedical Inc </td><td> HP1022 </td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Amaxa / Lonza </td><td> AAF-1001B &amp; AAF-1001X </td></tr><tr><td> Nucleofection Kit </td><td> Amaxa / Lonza </td><td> V4XP-3012 </td></tr><tr><td> Plasmids </td><td> NTC </td><td> n / a </td></tr><tr><td> GM-CSF </td><td> R &amp; D </td><td> 215-GM/CF </td></tr><tr><td> IL1 </td><td> R &amp; D </td><td> 201-LB-025 </td></tr><tr><td> IL6 </td><td> R &amp; D </td><td> 206-IL-CF </td></tr><tr><td> TNFa </td><td> R &amp; D </td><td> 210-TA-010 </td></tr><tr><td> PGE2 </td><td> Sigma </td><td> P6532-1mg </td></tr><tr><td> G-Rex </td><td> Wilson Wolf Manufacturing </td><td> AY11-00027 </td></tr></tbody></table>

genereren van multivirus-specifieke t-cellen te voorkomen / virale infecties te behandelen na allogene hematopoietische stamceltransplantatie

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Virale infecties veroorzaken morbiditeit en mortaliteit bij allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) ontvangers. Wij en anderen hebben met succes gegenereerd en toegediende T-cellen die specifiek zijn voor het Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) en adenovirus (Adv) met behulp van monocyten en EBV getransformeerde lymfoblastoïde cel (EBV-LCL) gen-gemodificeerd met een adenovirus vector als antigeen presenterende cellen (APC&#39;s). Zo weinig als 2x10 5 / kg trivirus-specifieke cytotoxische T lymfocyten (CTL) zich verspreid door verschillende logs na infusie en leek te voorkomen en te behandelen, zelfs een ernstige virale ziekte resistent zijn tegen andere beschikbare therapieën. De bredere implementatie van deze bemoedigende aanpak is beperkt door de hoge productiekosten, de complexiteit van de fabricage en de langere tijd (4-6 weken voor het EBV-LCL generatie, en 4-8 weken voor CTL productie - het totaal 10 tot 14 weken) voor de voorbereiding. Om deze beperkingen hebben we een nieuwe, GMP-compliant productie van CTL-protocol. De eerste, in plaats van adenovectors aan T-cellen die we gebruiken dendritische cellen (DC&#39;s) nucleofected met DNA plasmiden die coderen voor LMP2, EBNA1 en BZLF1 (EBV), Hexon en Penton (ADV), en pp65 en IE1 (CMV) als antigeen-presenterende te stimuleren cellen. Deze APC&#39;s activeren T-cellen die specifiek zijn voor de stimulerende antigenen. Ten tweede, de cultuur van geactiveerde T-cellen in de aanwezigheid van IL-4 (1000 U / ml) en IL-7 (10ng/ml) verhoogt en onderhoudt het repertoire en de frequentie van specifieke T-cellen in onze lijnen. Ten derde, hebben we gebruik gemaakt van een nieuw, gasdoorlatend cultuur apparaat (G-Rex), dat de uitbreiding en het voortbestaan ​​van grote cel aantallen bevordert na een eenmalige stimulatie, waardoor het verwijderen van de eis van EBV-LCL en het verminderen van technicus interventie. Door het implementeren van deze veranderingen kunnen we nu produceren multispecifieke CTL gericht op EBV, CMV, en Adv tegen een prijs per 10 6 cellen die wordt verminderd met&gt; 90%, en in slechts 10 dagen in plaats van 10 weken met behulp van een aanpak die kan worden uitgebreid met bijkomende beschermende virale antigenen. Onze FDA-goedgekeurde aanpak moet worden van de waarde voor de profylactische en behandeling toepassingen voor hoog risico allogene HSCT ontvangers.

Een snelle, eenvoudige en kosteneffectieve protocol voor het genereren van donor-afgeleide multivirus-specifieke CTL (rCTL) voor infusie aan allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) ontvangers risico op het ontwikkelen CMV, Adv of EBV infecties. Dit productieproces is GMP-compliant en moet zorgen voor de bredere implementatie van T-cel-immunotherapie voorbij gespecialiseerde centra.

Genereren van Multivirus-specifieke T-cellen te voorkomen / virale infecties te behandelen na allogene hematopoietische stamceltransplantatie

Virale infecties veroorzaken morbiditeit en mortaliteit bij ontvangers van een allogene hematopoëtische stamceltransplantatie (HSCT). Wij en anderen hebben met succes ...

Het algemene doel van de volgende procedure is het snel genereren van donor-afgeleide virus-specifieke cytotoxische T-lymfocyten of CTL's die geschikt zijn voor adoptieve transfer naar ontvangers van een allogene hematopoëtische stamceltransplantatie of HSCT. Dit wordt bereikt door eerst dendritische cellen of DC's te nuclefecteren met plasmiden die virale antigenen coderen om de cellen voor antigeenpresentatie te primen. Als tweede stap worden de nuclegefecteerde DC's gebruikt om antigeen-specifieke T-cellen te stimuleren, die vervolgens worden uitgebreid in de aanwezigheid van IL-4 en IL-7 in een gasdoorlatend kweekapparaat genaamd een GASPAK.Vervolgens, na zeven dagen cultuur, worden de cellen gesplitst en opnieuw uitgeplaat, en wordt het medium ververst om een maximale in vitro CTL-expansie te handhaven. Ten slotte worden de cellen op dag 12 geoogst en getest op zuiverheid, potentie en veiligheid, waarna ze cryopreserveerd worden voor subsequent klinisch gebruik. Uiteindelijk kunnen CTL-lijnen met multi-virusspecificiteit en minimale allo-reactiviteit worden gegenereerd, zoals aangetoond door hun intracellulaire cytokinekleuring, interferon gamma-productie en cytotoxiciteit.De productie van cytotoxische T-cellijnen die specifiek zijn voor meerdere virussen is tijdrovend en omslachtig. Het vereist het gebruik van EP Epstein-Barr virus-getransformeerde B-cellijnen en adenovirale vectoren, en de procedure duurt ongeveer drie maanden. Onze nieuwe methode maakt geen gebruik van virale vectoren.De cellen groeien exponentieel in cultuur met minimaal celverlies, waardoor de procedure snel en kosteneffectief is. Deze procedure wordt gedemonstreerd door Eureka Gerdeman, een klinisch fellow in het laboratorium. Oogst monocytafgeleide dc's, die zijn gegenereerd in Cellgenic-medium, aangevuld met IL-4 en G-M-CSF, en vervolgens 24 uur zijn gerijpt in rijpingscytokines, door voorzichtig te resuspenderen met een transferpipet van 3 mL. Gebruik trypaanblauw om de dc's te tellen en breng ze vervolgens over in drie buisjes van 15 mL met niet minder dan 0,5 × 10⁶ en niet meer dan 2 × 10⁶ cellen per buisje.Centrifugeer vervolgens de DCS gedurende 10 minuten bij 200 ×g. Bereid tijdens deze tijd zes milliliter cell genix-medium voor, aangevuld met dezelfde cytokinecocktail voor DC-rijping als voorheen, en verdeel twee milliliter over drie wells van een 12-wells tissue culture treated plaat; vul de ongebruikte wells met twee milliliter steriel water. Plaats de plaat in een incubator bij 37 °C met 5% CO2 om deze voor te verwarmen.Zodra de cellen zijn gecentrifugeerd, wordt het supernatant afgezogen en worden de relevante DNA-plasmiden aan elke buis toegevoegd tot een eindconcentratie van 5 µg DNA per buis. Hierbij wordt het plasmide dat IE1 pp65 codeert toegevoegd aan buis nummer één, het penton aan buis nummer twee en EBNA1 LMP2 BZLF1 aan buis nummer drie. Suspendeer de cellen en het DNA in 100 µL nucleaire transfectie-oplossing.Meng goed en breng het mengsel over in NU nucleofectie-cuvetten. Plaats de cuvetten in de four D nucleofector. Kies programma CB150 en druk op start direct na de nucleofectie.Voeg 500 µL van het voorverwarmde CELLGENIC DC-rijpingsmedium toe aan elke buis met cellen, meng deze door twee tot drie keer voorzichtig te pipetteren en breng de nucleofecte DC's over naar de voorbereide 12-wells plaat die de resterende 1,5 mL voorverwarmd DC-rijpingsmedium bevat. Plaats de plaat voor nog eens 12 tot 18 uur in de incubator, oogst vervolgens de nucleofecte DC's en tel deze. Was de cellen één keer met 10 mL CTL-medium en resuspendeer ze vervolgens op een concentratie van 3 × 10⁵ DC's per mL medium. Pool een minimum van 7,5 × 10⁵ (of 2,5 mL) en een maximum van 15 × 10⁵ (of 5 mL) DC's van alle drie de nucleofecties en breng de gepoolde plasmid-getransfecteerde DC's over naar het G-Rex-apparaat.Plaats het apparaat vervolgens in de incubator voor de preparatie van de respondercellen. Gebruik de niet-adherente mononucleaire cellen die overblijven na de DC-selectie. Breng de responders over naar de voorverwarmde cultuuroplossing.Was ze eenmaal met CTL-medium. Suspendeer de cellen in CTL-medium. Tel de cellen en breng ze naar een concentratie van 2 × 10⁶ cellen per milliliter.Neem 15 × 10⁶ cellen of 7,5 milliliter en supplementeer deze met de cytokinen IL-4 en IL-7. Draag 7,5 milliliter PBMC over naar de G Rex en vul de bioreactor aan met CTL-medium tot een totaalvolume van 30 milliliter. Plaats de G REX tot slot gedurende zes tot zeven dagen in de incubator; aspireer op dag zes tot zeven 10 milliliter van het medium.Meng vervolgens de resterende 20 milliliters medium met een pipette van 10 milliliter. Gebruik tryan blue om de cellen te tellen als er minder dan 50 × 10⁶ cellen zijn. Vul de cultuur aan met vers medium en cytokinen.Als er meer dan 50 × 10⁶ cellen zijn, verwijder dan 10 milliliters van de celsuspensie, breng de cellen over naar een nieuwe G rex en voed vervolgens beide G rexes met vers CTL-medium en cytokinen. Kweek de cellen nog vier tot zes dagen om de cellen in voldoende aantal uit te breiden; oogst en tel de cellen. Cryopreserveer vervolgens alle cellen die niet worden gebruikt voor fenotypische of functionele analyses voor toekomstig gebruik. Representatieve resultaten tonen aan dat multi-cyonische DNA-plasmiden multi-virus-specifieke T-cellen induceren, gemeten via interferon gamma ELISPOT, en dat de frequentie van reactieve cellen superieur is aan die van lijnen die zijn gegenereerd met conventionele PHU-plasmiden die dezelfde antigenen tot expressie brengen.De optimale verhouding tussen DC en PBMC is belangrijk voor een krachtige T-celstimulatie, zoals te zien is in deze figuur, waar een verhouding van 1 op 50 een suboptimale reactivatie oplevert in vergelijking met een stimulator-responder-verhouding van 1 op 20. De CTL-cultuur in de G-rex, zoals weergegeven in deze figuur, ondersteunt een superieure T-celexpansie vergeleken met conventionele 24-wellplaten. De toevoeging van IL-4 en IL-7 aan de culturen vergroot het repertoire en de specificiteit van de geëxpandeerde cellen, zoals hier wordt getoond, waarbij de frequentie van T-cellen die reactief zijn tegen het CMV PP65-afgeleide HLA-A2-beperkte NLV-peptide werd beoordeeld in culturen die gegenereerd zijn in de aanwezigheid of afwezigheid van IL-4 en/of IL-7. Deze figuur toont een representatief voorbeeld van het fenotype van de snel geëxpandeerde multi-virus CTL's, die polyklonaal zijn met een mengsel van CD4-positieve en CD8-positieve T-cellen, waarvan de meerderheid de geheugenmarkers CD45RO en CD62L tot expressie brengt. De geëxpandeerde CTL's zijn specifiek voor alle stimulerende antigenen en zijn polyfunctioneel, zoals hier is beoordeeld via intracellulaire cytokinestaining om de productie van interferon-gamma en TNF-alpha na antigenstimulatie te detecteren, zoals geëvalueerd door een chroomrelease-assay.De geëxpandeerde CTL zijn in staat om specifiek virale doelwitten te doden, maar vertoonden geen aspecifieke activiteit tegen niet-virale HLA-mismatchdoelwitten, wat een cruciaal veiligheidsoverweging is. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe snel multi-virus-specifieke cytotoxische T-cellijnen kunnen worden geproduceerd die GNP-compatibel zijn en geschikt zijn voor adoptieve transfer in patiënten met virusgerelateerde ziekten. De vereenvoudiging van deze procedure zou de uitbreiding buiten gespecialiseerde productiefaciliteiten moeten vergemakkelijken en ervoor moeten zorgen dat de procedure de standaardzorg wordt voor patiënten die immuungecompromitteerd zijn en zeer vatbaar zijn voor virusgerelateerde ziekten.

generation-multivirus-specific-t-cells-to-preventtreat-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit artikel beschrijft een eenvoudige techniek om allogeen-specifieke anergie induceren in humane perifere bloed mononucleaire cellen. De techniek kan klinisch worden toegepast op niet-alloreactieve donorcellen te genereren. Infusie van deze cellen zou kunnen verbeteren immuun reconstitutie en vermindering van toxiciteit na allogene hematopoietische stamceltransplantatie.

Inductie van allogeen-specifieke anergie in humane perifere bloed mononucleaire cellen door allogeen stimulatie met Co-stimulerende signaal blokkade

Hier beschrijven we de eerste Good Manufacturing Practice (GMP)-compatibele werkwijze voor het produceren van virus-specifieke cytotoxische T lymfocyten (CTL) uit navelstrengbloed een bron voornamelijk naïeve T-cellen.

Uitbreiden cytotoxische T-lymphocyten uit navelstrengbloed dat Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, en Adenovirus

The video demonstrates an assay using human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived CD8+ T cells to inhibit hepatitis B virus (HBV) replication in mice. These T cells, engineered with HBV-specific receptors, are transferred into transgenic mice. Replication-competent HBV genome plasmids are then injected directly into the liver, enabling viral DNA uptake. Once viral antigens are expressed and presented by hybrid MHC-I molecules, the engineered T cells recognize and bind to these complexes.

Suppressing Hepatitis B Virus Replication Using Viral Antigen-Specific T Cells

Nieuwe generaties van functionele testen zoals gamma interferon (IFN-γ) ELISPOT, die cytokineproductie detecteren op enkele cel en bieden zowel kwantitatieve als kwalitatieve karakterisering van T cel responsen kunnen worden gebruikt om celgemedieerde immuunresponsen tegen varicella zoster beoordelen virus (VZV).

Ontwikkeling van een IFN-γ ELISpot Assay aan varicella-zoster virus-specifieke-cel gemedieerde immuniteit na transplantatie van navelstrengbloed

Dit artikel beschrijft een methode voor de generatie en proliferatie van humane T-celklonen die specifiek reageren op een gedefinieerd allo-antigen. Dit protocol kan worden aangepast voor het klonen van humane T-cellen die specifiek zijn voor een verscheidenheid aan peptide-MHC-liganden.

Genereren van menselijke allogeen-specifieke T-cellen uit perifeer bloed

Het doel van dit protocol is om pathogeen-specifieke klinische graad T-cellen te produceren met behulp van een tafelblad, geautomatiseerde, tweede generatie celverrijkingsapparaat dat een gesloten cytokine-opvangsysteem bevat en geen toegewijd personeel of gebruik van een GMP-faciliteit vereist. De gegenereerde cytomegalovirus pp65-specifieke T-cellen kunnen direct aan patiënten worden toegediend.

Geautomatiseerde Cel Verrijking van Cytomegalovirus-specifieke T-cellen voor klinische toepassingen met het cytokine-beeldverwerkingssysteem

Dit protocol beschrijft de methoden voor het construeren van een gehumaniseerd muismodel voor beenmerg/lever/thymus met stamcelgebaseerde geëngineerde immuniteit tegen HIV-infectie.

Stamcel-Based Engineered immuniteit tegen HIV infectie in het gehumaniseerde muismodel

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde workflow voor de generatie en ex vivo karakterisering van oncolytische virussen voor expressie van immunomodulators, met behulp van mazelen virussen bispecifieke T cel engagers codering als een voorbeeld. Toepassing en aanpassing aan andere vector platforms en transgenen zal de ontwikkeling van nieuwe immunovirotherapeutics voor klinische vertaling versnellen.

Paramyxovirussen voor Tumor-gerichte immunomodulatie: ontwerp en evaluatie Ex Vivo

Dit artikel beschrijft een methode voor het genereren van functionele tumor antigen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide CD8αβ+ enkele positieve T-cellen met behulp van OP9/dll1-co-cultuur systeem.

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het genereren van tumor-antigeen-specifieke T-cellen

Hier is een protocol voor de effectieve onderdrukking van replicatie van het hepatitis B-virus (HBV) in muizen door gebruik te maken van de adoptieve celoverdracht (ACT) van stamcel afkomstige virale antigeen (AG)-specifieke T-lymfocyten. Deze procedure kan worden aangepast voor mogelijke op ACT gebaseerde immunotherapie van HBV-infectie.

Stamcel afkomstige virale AG-specifieke T-lymfocyten onderdrukken HBV-replicatie bij muizen

Leer een snelle GMP-conforme methode voor het genereren van multivirus-specifieke cytotoxische T-lymfocyten uit dendritische cellen en donor-PBMC's. Deze techniek verbetert de T-celimmunotherapie na allogene stamceltransplantatie.

Genereren van Multivirus-specifieke T-cellen te voorkomen / virale infecties te behandelen na allogene hematopoietische stamceltransplantatie (Video) | JoVE Journal

Genereren van Multivirus-specifieke T-cellen te voorkomen / virale infecties te behandelen na allogene hematopoietische stamceltransplantatie

Meer video's verkennen