Genereren van Multivirus-specifieke T-cellen te voorkomen / virale infecties te behandelen na allogene hematopoietische stamceltransplantatie

Het algemene doel van de volgende procedure is het snel genereren van donor-afgeleide virus-specifieke cytotoxische T-lymfocyten of CTL's die geschikt zijn voor adoptieve transfer naar ontvangers van een allogene hematopoëtische stamceltransplantatie of HSCT. Dit wordt bereikt door eerst dendritische cellen of DC's te nuclefecteren met plasmiden die virale antigenen coderen om de cellen voor antigeenpresentatie te primen. Als tweede stap worden de nuclegefecteerde DC's gebruikt om antigeen-specifieke T-cellen te stimuleren, die vervolgens worden uitgebreid in de aanwezigheid van IL-4 en IL-7 in een gasdoorlatend kweekapparaat genaamd een GASPAK.

Vervolgens, na zeven dagen cultuur, worden de cellen gesplitst en opnieuw uitgeplaat, en wordt het medium ververst om een maximale in vitro CTL-expansie te handhaven. Ten slotte worden de cellen op dag 12 geoogst en getest op zuiverheid, potentie en veiligheid, waarna ze cryopreserveerd worden voor subsequent klinisch gebruik. Uiteindelijk kunnen CTL-lijnen met multi-virusspecificiteit en minimale allo-reactiviteit worden gegenereerd, zoals aangetoond door hun intracellulaire cytokinekleuring, interferon gamma-productie en cytotoxiciteit.

De productie van cytotoxische T-cellijnen die specifiek zijn voor meerdere virussen is tijdrovend en omslachtig. Het vereist het gebruik van EP Epstein-Barr virus-getransformeerde B-cellijnen en adenovirale vectoren, en de procedure duurt ongeveer drie maanden. Onze nieuwe methode maakt geen gebruik van virale vectoren.

De cellen groeien exponentieel in cultuur met minimaal celverlies, waardoor de procedure snel en kosteneffectief is. Deze procedure wordt gedemonstreerd door Eureka Gerdeman, een klinisch fellow in het laboratorium. Oogst monocytafgeleide dc's, die zijn gegenereerd in Cellgenic-medium, aangevuld met IL-4 en G-M-CSF, en vervolgens 24 uur zijn gerijpt in rijpingscytokines, door voorzichtig te resuspenderen met een transferpipet van 3 mL. Gebruik trypaanblauw om de dc's te tellen en breng ze vervolgens over in drie buisjes van 15 mL met niet minder dan 0,5 × 10⁶ en niet meer dan 2 × 10⁶ cellen per buisje.

Centrifugeer vervolgens de DCS gedurende 10 minuten bij 200 ×g. Bereid tijdens deze tijd zes milliliter cell genix-medium voor, aangevuld met dezelfde cytokinecocktail voor DC-rijping als voorheen, en verdeel twee milliliter over drie wells van een 12-wells tissue culture treated plaat; vul de ongebruikte wells met twee milliliter steriel water. Plaats de plaat in een incubator bij 37 °C met 5% CO2 om deze voor te verwarmen.

Zodra de cellen zijn gecentrifugeerd, wordt het supernatant afgezogen en worden de relevante DNA-plasmiden aan elke buis toegevoegd tot een eindconcentratie van 5 µg DNA per buis. Hierbij wordt het plasmide dat IE1 pp65 codeert toegevoegd aan buis nummer één, het penton aan buis nummer twee en EBNA1 LMP2 BZLF1 aan buis nummer drie. Suspendeer de cellen en het DNA in 100 µL nucleaire transfectie-oplossing.

Meng goed en breng het mengsel over in NU nucleofectie-cuvetten. Plaats de cuvetten in de four D nucleofector. Kies programma CB150 en druk op start direct na de nucleofectie.

Voeg 500 µL van het voorverwarmde CELLGENIC DC-rijpingsmedium toe aan elke buis met cellen, meng deze door twee tot drie keer voorzichtig te pipetteren en breng de nucleofecte DC's over naar de voorbereide 12-wells plaat die de resterende 1,5 mL voorverwarmd DC-rijpingsmedium bevat. Plaats de plaat voor nog eens 12 tot 18 uur in de incubator, oogst vervolgens de nucleofecte DC's en tel deze. Was de cellen één keer met 10 mL CTL-medium en resuspendeer ze vervolgens op een concentratie van 3 × 10⁵ DC's per mL medium. Pool een minimum van 7,5 × 10⁵ (of 2,5 mL) en een maximum van 15 × 10⁵ (of 5 mL) DC's van alle drie de nucleofecties en breng de gepoolde plasmid-getransfecteerde DC's over naar het G-Rex-apparaat.

Plaats het apparaat vervolgens in de incubator voor de preparatie van de respondercellen. Gebruik de niet-adherente mononucleaire cellen die overblijven na de DC-selectie. Breng de responders over naar de voorverwarmde cultuuroplossing.

Was ze eenmaal met CTL-medium. Suspendeer de cellen in CTL-medium. Tel de cellen en breng ze naar een concentratie van 2 × 10⁶ cellen per milliliter.

Neem 15 × 10⁶ cellen of 7,5 milliliter en supplementeer deze met de cytokinen IL-4 en IL-7. Draag 7,5 milliliter PBMC over naar de G Rex en vul de bioreactor aan met CTL-medium tot een totaalvolume van 30 milliliter. Plaats de G REX tot slot gedurende zes tot zeven dagen in de incubator; aspireer op dag zes tot zeven 10 milliliter van het medium.

Meng vervolgens de resterende 20 milliliters medium met een pipette van 10 milliliter. Gebruik tryan blue om de cellen te tellen als er minder dan 50 × 10⁶ cellen zijn. Vul de cultuur aan met vers medium en cytokinen.

Als er meer dan 50 × 10⁶ cellen zijn, verwijder dan 10 milliliters van de celsuspensie, breng de cellen over naar een nieuwe G rex en voed vervolgens beide G rexes met vers CTL-medium en cytokinen. Kweek de cellen nog vier tot zes dagen om de cellen in voldoende aantal uit te breiden; oogst en tel de cellen. Cryopreserveer vervolgens alle cellen die niet worden gebruikt voor fenotypische of functionele analyses voor toekomstig gebruik. Representatieve resultaten tonen aan dat multi-cyonische DNA-plasmiden multi-virus-specifieke T-cellen induceren, gemeten via interferon gamma ELISPOT, en dat de frequentie van reactieve cellen superieur is aan die van lijnen die zijn gegenereerd met conventionele PHU-plasmiden die dezelfde antigenen tot expressie brengen.

De optimale verhouding tussen DC en PBMC is belangrijk voor een krachtige T-celstimulatie, zoals te zien is in deze figuur, waar een verhouding van 1 op 50 een suboptimale reactivatie oplevert in vergelijking met een stimulator-responder-verhouding van 1 op 20. De CTL-cultuur in de G-rex, zoals weergegeven in deze figuur, ondersteunt een superieure T-celexpansie vergeleken met conventionele 24-wellplaten. De toevoeging van IL-4 en IL-7 aan de culturen vergroot het repertoire en de specificiteit van de geëxpandeerde cellen, zoals hier wordt getoond, waarbij de frequentie van T-cellen die reactief zijn tegen het CMV PP65-afgeleide HLA-A2-beperkte NLV-peptide werd beoordeeld in culturen die gegenereerd zijn in de aanwezigheid of afwezigheid van IL-4 en/of IL-7. Deze figuur toont een representatief voorbeeld van het fenotype van de snel geëxpandeerde multi-virus CTL's, die polyklonaal zijn met een mengsel van CD4-positieve en CD8-positieve T-cellen, waarvan de meerderheid de geheugenmarkers CD45RO en CD62L tot expressie brengt. De geëxpandeerde CTL's zijn specifiek voor alle stimulerende antigenen en zijn polyfunctioneel, zoals hier is beoordeeld via intracellulaire cytokinestaining om de productie van interferon-gamma en TNF-alpha na antigenstimulatie te detecteren, zoals geëvalueerd door een chroomrelease-assay.

De geëxpandeerde CTL zijn in staat om specifiek virale doelwitten te doden, maar vertoonden geen aspecifieke activiteit tegen niet-virale HLA-mismatchdoelwitten, wat een cruciaal veiligheidsoverweging is. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe snel multi-virus-specifieke cytotoxische T-cellijnen kunnen worden geproduceerd die GNP-compatibel zijn en geschikt zijn voor adoptieve transfer in patiënten met virusgerelateerde ziekten. De vereenvoudiging van deze procedure zou de uitbreiding buiten gespecialiseerde productiefaciliteiten moeten vergemakkelijken en ervoor moeten zorgen dat de procedure de standaardzorg wordt voor patiënten die immuungecompromitteerd zijn en zeer vatbaar zijn voor virusgerelateerde ziekten.