Een celvrij Assay System Het inschatten van de neutraliserende vermogen van GM-CSF antilichaam met behulp van recombinante oplosbare GM-CSF receptor

Het algemene doel van dit experiment is om een celvrije assay vast te stellen die de neutraliserende capaciteit van G-M-C-S-F auto-antilichamen kwantificeert. We beginnen met het verkrijgen van transgene zijderupsen. Breng het menselijke SGMR alpha-gen over om recombinant SGMR alpha te produceren en label vervolgens het recombinante menselijke G-M-C-S-F via bioTE.

Vervolgens evalueren we de correlatie tussen het celvrije systeem en een reguliere bioassay met een studie naar de inhibitie van de binding van G-M-C-S-F aan SGMR alfa door G-M-C-S-F autoantilichamen. De verkregen resultaten tonen een significante correlatie aan tussen de groeiremming van de bioassay en de bindingsinhibitie van het celvrije systeem door serum IgG-fracties en gezuiverde G-M-C-S-F autoantilichamen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de TF one bioassay, is dat dit systeem een hoge analyse-efficiëntie met een goede reproduceerbaarheid biedt voor het meten van de neutraliserende capaciteit van GM CSF autoantilichamen.

Aangezien GM CSF-auto-antilichamen leiden tot een auto-immuun primaire algehele prognose, strekken de implicaties van deze techniek zich uit tot de diagnostiek. Het kan ook worden toegepast op competitieve bindingsassays met gebruik van recombinante cytokinereceptoren, zoals receptoren voor BEGF en TNFA. De demonstratie van de procedure zal worden gepresenteerd door ano, een PhD-student uit mijn laboratorium. Hij heeft dit pH-vrije systeem ontwikkeld.

Deze video toont de zijderups die wordt gebruikt voor de productie van recombinant SGMR alpha. De eerste stap is het amplificeren van cDNA voor SGMR Alpha uit een cDNA-bibliotheek van een menselijke placenta via de polymerasekettingreactie, met het resulterende PCR-amplicon. Voer een tweede PCR uit om een 5' UTR-sequentie van 50 basen van het polyhedrine van het baculovirus aan het 5'-uiteinde toe te voegen.

Om een R RRGs te taggen, wordt zijn tag aan het 3'-uiteinde gekloneerd; cloneer het geamplificeerde PCR R-product in het plasmide P MSG one one mg. Co-injecteer het construct PS GMR slash M1 one mg samen met de helpervector PHA three pig in eitjes van de zijderupsstam PNDW one. Kweek de uitgekomen G0-larven op tot motten bij 25 °C. Screen vervolgens de G1-embryo's, ofwel door paring tussen broeders en zusters, of met PNDW one, waarbij MG FP-expressie in de ogen indicatief is voor transgene zijderupsen.

Voor het SGMR alpha-gen wordt recombinant SGMR alpha geëxtraheerd uit de cocons van transgene zijderupsen met een fosfaatbuffer die 500 millimolair natriumchloride bevat, waarbij 24 uur lang geroerd wordt bij vier graden Celsius. Centrifugeer de monsters bij 20 000 ×g gedurende 15 minuten. Om neerslagen te verwijderen, wordt het supernatant op een nikkel-affiniteitskolom aangebracht.

Was de kolom en elueer de eiwitten met een lineaire gradiënt van 10 millimolar tot 250 millimolar. Verzamel de fracties die het gezuiverde SGMR alpha bevatten en dialyseer deze tegen gefosfatgebufferde zoutoplossing. Dialyseer de monsters eerst met PBS.

Om sorbitol uit de G-M-C-S-F-preparatie te verwijderen, voegt u één milliliter koude 20 millimolaire natriummeta-datumoplossing toe en incubeert u het monster 30 minuten op ijs in het donker. Voeg nu glycerol toe tot een eindconcentratie van 15 millimolair en dialyseer tegen 100 millimolaire natriumacetaatbuffer. Voeg vervolgens biotinazide toe aan de oplossing tot een eindconcentratie van vijf millimolair en meng dit gedurende twee uur bij kamertemperatuur.

Verwijder ten slotte het niet-reactieve materiaal door middel van dialyse tegen PBS en coat een microtiterplaat met 50 µL monoklonaal anti-polyhis-antilichaam gedurende de nacht bij 4 °C. Was vijf keer met PBST. Voeg vervolgens 100 µL van een blokkeringsoplossing toe en incubeer dit gedurende drie uur bij 4 °C.

Was vervolgens vijf keer met PBST. Voeg 50 microliters SGMR alpha in de blokkeringsoplossing toe en incubeer dit overnacht bij vier graden Celsius na vijf wasbeurten met PBST. Voeg 25 microliters van de monsters met G-M-C-S-F auto-antilichaam toe en vervolgens 25 microliters gebiotinyleerd G-M-C-S-F; incubeer dit gedurende één uur bij vier graden Celsius.

Om het SGMR alfa G-M-C-S-F-complex te vormen. Was vijf keer verder met PBST en voeg vervolgens 50 µL alkalische fosfatase streptavidine toe gedurende één uur bij vier graden Celsius om het gebiotineerde G-M-C-S-F-gebonden SGMR alfa te detecteren; was vijf keer met PBST en voeg 50 µL van een chemiluminescentiesubstraat toe aan de oplossing, incubeer één uur bij kamertemperatuur en bepaal de chemiluminescentie-activiteit met een platenlezer. Bij SDS-PAGE-analyse is het uit zijderupsen afgeleid recombinant SDMR alfa onder niet-reducerende condities aanwezig in zowel monomerische als dimeere vormen, maar enkel in de monomerische vorm onder reducerende condities.

Dit recombinant mengsel van monomeren en disulfide-gekoppelde dimeren van SGMR alpha is functioneel in een competitieve bindingsassay. Het complex van gebiotineerd G-M-C-S-F met SGMR alpha vertoont specificiteit, aangezien het gedissocieerd kan worden door toevoeging van verschillende concentraties neutraliserende antilichamen, maar niet door niet-neutraliserende antilichamen. Bovendien correleren toenemende concentraties van G-M-C-S-F neutraliserende antilichamen positief met een toename van het percentage bindingsinhibitie op een dosisafhankelijke wijze.

Zoals verwacht was de bindingsremming van niet-neutraliserende G-M-C-S-F-antilichamen niet dosisafhankelijk. Dit celvrije systeem vertoont een nauwe correlatie tussen de remming van de binding van G-M-C-S-F aan SGMR alpha door G-M-C-S-F-autoantilichamen en de berekende waarden, met een r gelijk aan 0,988 en een P-waarde van 0,002. De bindingsremming nam op een dosisafhankelijke wijze toe door G-M-C-S-F-autoantilichamen.

Op dezelfde wijze correleerde de bindingsinhibitie significant met de groeiremming van import. Deze assay is nuttig voor de analyse van serum-IgG-fracties van patiënten met auto-immuun PAP, zoals hier aangetoond door de relatie tussen de IC 50 voor het percentage bindingsinhibitie en het percentage groeiremming door de serum-IgG-fracties. Bovendien wijst de variatiecoëfficiënt tussen experimenten op een voordeel van het celvrije systeem ten opzichte van de bioassay voor groeiremming.

Eenmaal beheerst, kan deze celvrije GM GSF-receptorligand-bindingsassay succesvol worden voltooid in 38 uur. Het is belangrijk om de reactietemperatuur en de incubatietijd strikt in acht te nemen. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van het screenen naar de bioactiviteiten van nieuwe antilichaamgeneesmiddelen als alternatief voor conventionele bioassays.