Name: Een celvrij Assay System Het inschatten van de neutraliserende vermogen van GM-CSF antilichaam met behulp van recombinante oplosbare GM-CSF receptor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Leer een celvrij receptorbindingsassay om de neutraliserende capaciteit van GM-CSF-autoantilichamen te kwantificeren met behulp van recombinante SGMR-alfa uit transgene zijderupsen. Deze methode biedt hoge reproduceerbaarheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn erg dankbaar K. Nakagaki, dr. H. Ishii, dr. K. Suzuki, A. Yamagata, K. Oofusa voor hun waardevolle bijdragen.

1. Productie en zuivering van sGMRα <ol><li> Amplify cDNA van sGMRα uit menselijke placenta cDNA-bibliotheek van polymerase chain reaction (PCR). </li><li> Voeg 50 base 5'-UTR volgorde van baculovirus polyhedrine-end en 27 voet codering RGS His-tag aan het 3 'einde van de PCR-amplicon door een andere PCR. </li><li> Plaats de geamplificeerde PCR-product in een plasmide pMSG1.1MG. </li><li> Injecteer het construct psGMR/M1.1MG met de helper vector pHA3PIG in eieren van zijderupsen PND-w1 stam. </li><li> De achterzijde van de uitgekomen larven G0 te motten bij 25 ° C. Scherm G1 embryo's verkregen door voortplanting tussen broers en zussen of met PND-w1 voor MGFP uitdrukking in de ogen te verkrijgen transgene zijderupsen met het sGMRα gen. </li><li> Extract recombinant sGMRα uit de cocons van transgene zijderupsen met fosfaat-buffer met 500mm NaCl toe en roer bij 4 ° C voor 24 uur. </li><li> Centrifugeer monster op 20000 g voor 15 min tot verwijderen van een neerslag. </li><li> Van toepassing supernatant aan een nikkel-affiniteitskolom. </li><li> Was de kolom met 10mm imidazol, 500mm en 20mm NaCl Natriumfosfaat, pH6.3, en elueren met een lineaire gradiënt van imidazool van 10mm tot 250mm. Zwembad de fracties die het gezuiverde sGMRα en dialyze tegen fosfaat-gebufferde zoutoplossing (pH 7,4) (PBS). </li></ol> 2. Biotinylatie van recombinant GM-CSF <ol><li> Verwijder sorbitol voorbereiding door dialyse tegen PBS. </li><li> Voeg 1 ml van 20mm koude natrium meta-perjodaat oplossing bij 4 ° C aan de oplossing op het ijs. </li><li> Incubeer het monster voor 30min op het ijs in het donker. </li><li> Voeg glycerol aan de oplossing bij een uiteindelijke concentratie van 15 mm. </li><li> Dialyze de oplossing tegen 100mm natriumacetaat buffer (pH 5,5) </li><li> Voeg biotine hydrazide aan de oplossing bij een uiteindelijke concentratie van 5mm en voortdurend roeren de oplossing voor 2 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de niet-gereageerde stof door dialyse tegen PBS, pH 7,4. </li></ol> 3. Een cel-vrije GM-CSF receptor-ligand-binding assay <ol><li> Coat een microtiterplaat met 50μl van monoklonale anti-polyhistidine antilichaam overnacht bij 4 ° C. </li><li> Was vijf keer met 500μl van PBST. </li><li> Voeg 100μl van een blokkerende oplossing en incubeer gedurende 3 uur bij 4 ° C. </li><li> Was vijf keer met 500μl van PBST. </li><li> Voeg 50μl van sGMRα in de blokkering oplossing en incubeer overnacht bij 4 ° C. </li><li> Was vijf keer met 500μl van PBST. </li><li> Voeg 25μl van de monsters met GM-CSF autoantilichaam en dan 25μl van gebiotinyleerd GM-CSF. Incubeer 1 uur bij 4 ° C tot sGMRα-GM-CSF complex te vormen. </li><li> Was vijf keer met 500μl van PBST. </li><li> Voeg 50μl van 0,4 mm streptavidine alkalische fosfatase voor een uur bij 4 ° C om de gebiotinyleerde GM-CSF gebonden sGMRα detecteren. </li><li> Was vijf keer met 500μl van PBST. </li><li> Voeg 50μl van een chemiluminescent substraat aan de oplossing en geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Met behulp van een chemiluminescentie plaat lezer, op te sporen de chemiluminescentie activiteit. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: De eerste stap in de GM-CSF receptor signaaltransductie route is de binding van GM-CSF aan GM-CSF receptor alpha op het celoppervlak. Omdat GM-CSF autoantilichaam specifiek bindt GM-CSF en blokkeren de binding aan de receptor in vitro 16,17, hebben we de hypothese dat de auto-antistoffen deze eerste reactie van rechtstreeks bindend in GM-CSF te remmen. Zoals eerder beschreven (Ref. 9-15), passen we transgene zijderups technologie om een ​​grote hoeveelheid recombinant sGMRα te verkrijgen met een hoge zuiverheid. Als de zijderups-afgeleide recombinant sGMRα werd geladen op SDS-PAGE onder niet-reducerende omstandigheden, het sGMRα toonde zowel monomere (45 kDa) en dimere (90 kDa) vormen, terwijl slechts de monomere vorm werd ontdekt onder reducerende omstandigheden (Figuur 1B) , wat aangeeft dat het recombinante sGMRα was een mengsel van monomeren en disulfide-linked dimmers 18. Met behulp van de cel-free-systeem (Fig. 2A), hebben we de remming van GM-CSF binding aan sGMRα door GM-CSF autoantilichamen (Fig. 2B en Fig. 2C). Deze methoden werden beschreven in referentie 19 door Urano et al.. De groeiremming was nauw gecorreleerd met de binding inhibitie (r = 0,988, p = 0,002) bij verschillende concentraties van de GM-CSF autoantilichaam (Fig. 3A) 19. Ook was de bindende remming significant gecorreleerd met de groei-inhibitie. De binding remming verhoogd in een dosis-afhankelijke manier door GM-CSF autoantilichamen (Fig. 3B) 19. Deze twee parameters voor de serum IgG fracties van verschillende patiënten werden gecorreleerd met elkaar (r = 0,589 p = 0,006, Fig. 3C). Niet bindend, noch inhibitie remming van de groei gecorreleerd met Kd-waarden, en dus beide parameters werden niet beïnvloed door bindingsaffiniteit 19. Bijgevolg reproduceerbaarheid van gegevens tussen binding en gROEI remming verkregen door middel van drie onafhankelijke experimenten op drie verschillende monsters werd geëvalueerd. De variatiecoëfficiënt gaf aan dat de cel-vrij systeem is meer goed dan die van bioassay (tabel 1). <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Stroomschema van de procedure voor de productie van sGMRα met behulp van transgene zijderupsen. A) Structuren van de transformatievectoren 9-11. B) SDS-PAGE en Coomassie Brilliant Blue-kleuring van het gezuiverde sGMRα onder reducerende en niet-reducerende omstandigheden. sGMRα, oplosbare GM-CSF-receptor alfa; MGFP, monster groen fluorescerend eiwit; BmNPVpol5'-UTR, 5'-onvertaalde gebied volgorde van de Bombyx mori nucleaire polyhedrosis virus polyhedrine-, SV40 polyA, SV40 polyA signaalsequentie; P 3xP3, 3xP3 promotor; P ser1, ser1 promotor; FiBL polyA, fibroin L-keten polyA signaalsequentie, HR3, Bombyx mori nucleaire polyhedrosis virus HR3 enhancer. <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Schema van de cel-vrije assay systeem. A) Een concurrerende bindingstest met behulp van sGMRα geproduceerd door zijderups. B) Effect van neutraliserende en niet-neutraliserende antilichamen op de binding remming door cel-vrij systeem. C) Het verschil van de binding remming tussen de verschillende concentraties van neutraliserende antilichamen en niet-neutraliserende antilichamen. GM-CSF, granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor, sGMRα, oplosbare GM-CSF-receptor alpha, Zijn, RGS-His-tag, AP, alkalische fosfatase. <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. GM-CSF binding remming om sGMRα door de effecten van GM-CSF polyklonale antilichamen of het serum IgG fracties van patiënten met een auto-PAP. A) Relatie tussen bindende inhibitie en groeiremming door GM-CSF autoantilichaam. B) Bindende remming bij verschillende concentraties van GM-CSF autoantilichaam. C) Relatie tussen de IC 50 voor procent binding remming en het percentage remming van de groei van het serum IgG fracties 19. IC 50, 50% remmende concentratie, GM-CSF, granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor. <table border="1"><tbody><tr><td> Monster </td><td> Een </td><td> B </td><td> C </td></tr><tr><td colspan="4"> Inter-assay </td></tr><tr><td> # Van de vaststellingen </td><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Gemiddelde waarde (% binding remming) </td><td> 61,6 </td><td> 63,8 </td><td> 69,7 </td></tr><tr><td> Gemiddelde waarde (% groeiremming) </td><td> 21,0 </td><td> 73,4 </td><td> 82,8 </td></tr><tr><td> Coëfficiënt van variatie (%) (% binding remming) </td><td> 6.0 </td><td> 5.6 </td><td> 8.3 </td></tr><tr><td> Coëfficiënt van variatie (%) (% groeiremming) </td><td> 64,4 </td><td> 18,3 </td><td> 10,4 </td></tr></tbody></table> Beide testen werden uitgevoerd op 5 ng / ml van GM-CSF en een concentratie die gelijk is aan GM-CSF autoantilichaam. Tabel 1. Vergelijking van de coëfficiënt van de variaties tussen procent binding en groei remmingen verkregen door middel van drie onafhankelijke experimenten.

<ol><li>Arai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+neutralizing+capacity+of+GM-CSF+reflects+disease+severity+in+a+patient+with+pulmonary+alveolar+proteinosis+successfully+treated+with+inhaled+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF.</a> Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).</li>
<li>Tazawa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+and+lung+immunity+in+pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and lung immunity in pulmonary alveolar proteinosis.</a> Am J Respir Crit Care Med. 171, 1142-1149 (2005).</li>
<li>Inoue, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+large+cohort+of+patients+with+autoimmune+pulmonary+alveolar+proteinosis+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a large cohort of patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis in Japan.</a> Am J Respir Crit Care Med. 177, 752-762 (2008).</li>
<li>Uchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+autoantibodies+specifically+eliminate+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+activity+in+the+lungs+of+patients+with+idiopathic+pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-affinity autoantibodies specifically eliminate granulocyte-macrophage colony-stimulating factor activity in the lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis.</a> Blood. 103, 1089-1098 (2004).</li>
<li>Sakagami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+GM-CSF+autoantibodies+and+reproduction+of+pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Human GM-CSF autoantibodies and reproduction of pulmonary alveolar proteinosis.</a> N Engl J Med. 361, 2679-2681 (2009).</li>
<li>Raines, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+molecular+cloning+of+a+soluble+human+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification and molecular cloning of a soluble human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 8203-8207 (1991).</li>
<li>Williams, W., VonFeldt, J., Rosenbaum, H., Ugen, K., Weiner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+a+soluble+form+of+the+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+receptor+alpha+chain+from+a+myelomonocytic+cell+line.+Expression%2C+biologic+activity%2C+and+preliminary+analysis+of+transcript+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of a soluble form of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor alpha chain from a myelomonocytic cell line. Expression, biologic activity, and preliminary analysis of transcript distribution.</a> Arthritis Rheum. 37, 1468-1478 (1994).</li>
<li>Prevost, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+%28GM-CSF%29+and+inflammatory+stimuli+up-regulate+secretion+of+the+soluble+GM-CSF+receptor+in+human+monocytes%3A+evidence+for+ectodomain+shedding+of+the+cell+surface+GM-CSF+receptor+alpha+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and inflammatory stimuli up-regulate secretion of the soluble GM-CSF receptor in human monocytes: evidence for ectodomain shedding of the cell surface GM-CSF receptor alpha subunit.</a> J Immunol. 169, 5679-5688 (2002).</li>
<li>Iizuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+recombinant+mouse+monoclonal+antibody+in+transgenic+silkworm+cocoons%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Production of a recombinant mouse monoclonal antibody in transgenic silkworm cocoons.</a> FEBS J. 276, 5806-5820 (2009).</li>
<li>Iizuka, M., Tomita, M., Shimizu, K., Kikuchi, Y., Yoshizato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+enhancement+of+recombinant+protein+synthesis+in+transgenic+silkworms+by+a+5%27-untranslated+region+of+polyhedrin+gene+of+Bombyx+mori+Nucleopolyhedrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Translational enhancement of recombinant protein synthesis in transgenic silkworms by a 5'-untranslated region of polyhedrin gene of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus.</a> J Biosci Bioeng. 105, 595-603 (2008).</li>
<li>Zou, W., Ueda, M., Yamanaka, H., Tanaka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+combinatorial+protein+library+displayed+on+yeast+cell+surface+using+DNA+random+priming+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Construction of a combinatorial protein library displayed on yeast cell surface using DNA random priming method.</a> J Biosci Bioeng. 92, 393-396 (2001).</li>
<li>Tamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+silkworm+Bombyx+mori+L.+using+a+piggyBac+transposon-derived+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector.</a> Nat Biotechnol. 18, 81-84 (2000).</li>
<li>Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+silkworms+produce+recombinant+human+type+III+procollagen+in+cocoons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons.</a> Nat Biotechnol. 21, 52-56 (2003).</li>
<li>Ogawa, S., Tomita, M., Shimizu, K., Yoshizato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+transgenic+silkworm+that+secretes+recombinant+proteins+in+the+sericin+layer+of+cocoon%3A+production+of+recombinant+human+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation of a transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon: production of recombinant human serum albumin.</a> J Biotechnol. 128, 531-544 (2007).</li>
<li>Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+germline+transgenic+silkworm+that+secretes+recombinant+proteins+in+the+sericin+layer+of+cocoon%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">A germline transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon.</a> Transgenic Res. 16, 449-465 (2007).</li>
<li>Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+pulmonary+alveolar+proteinosis+as+an+autoimmune+disease+with+neutralizing+antibody+against+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Idiopathic pulmonary alveolar proteinosis as an autoimmune disease with neutralizing antibody against granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 190, 875-880 (1999).</li>
<li>Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lungs+of+patients+with+idiopathic+pulmonary+alveolar+proteinosis+express+a+factor+which+neutralizes+granulocyte-macrophage+colony+stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis express a factor which neutralizes granulocyte-macrophage colony stimulating factor.</a> FEBS Lett. 442, 246-250 (1999).</li>
<li>Brown, C., Pihl, C., Murray, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+the+soluble+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+receptor%3A+identification+of+the+functional+ligand-binding+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of the soluble granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor: identification of the functional ligand-binding species.</a> Cytokine. 9, 219-225 (1997).</li>
<li>Urano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-free+assay+to+estimate+the+neutralizing+capacity+of+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A cell-free assay to estimate the neutralizing capacity of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor autoantibodies.</a> J Immunol Methods. 360, 141-148 (2010).</li>
<li>Hayashida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+a+second+subunit+of+the+receptor+for+human+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+%28GM-CSF%29%3A+reconstitution+of+a+high-affinity+GM-CSF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): reconstitution of a high-affinity GM-CSF receptor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9655-9659 (1990).</li>
<li>Hansen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+GM-CSF+receptor+complex+reveals+a+distinct+mode+of+cytokine+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The structure of the GM-CSF receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptor activation.</a> Cell. 134, 496-507 (2008).</li>
</ol>

De cel-vrije assay schatting gemaakt van de neutraliserende capaciteit van GM-CSF auto-antilichamen met een uitstekende reproduceerbaarheid en snelheid. De bindende remming door GM-CSF autoantilichamen of de patiënt serum IgG fracties werd geëvalueerd door deze test. Uit de gegevens bleek een correlatie tussen de binding inhibitie van de cel-vrije test en de groeiremming van een bioassay met behulp van TF-1 cellen, respectievelijk. De bioassay is op grote schaal gebruikt, maar koesterde moeilijkheden bij het vergelijken...

een celvrij assay system het inschatten van de neutraliserende vermogen van gm-csf antilichaam met behulp van recombinante oplosbare gm-csf receptor

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

ACHTERGRONDEN: Eerder hebben we aangetoond dat het neutraliseren van capaciteit, maar niet de concentratie van GM-CSF autoantilichaam was gecorreleerd met de ernst van de ziekte bij patiënten met auto pulmonale alveolaire proteïnose (PAP) 1-3. Als intrekking van GM-CSF bioactiviteit in de longen is de waarschijnlijke oorzaak voor auto-PAP 4,5, is het belooft de neutraliserende capaciteit van GM-CSF autoantilichamen maat voor het evalueren van de ernst van de ziekte in elke patiënt met PAP. Tot nu toe is het neutraliseren van de capaciteit van GM-CSF autoantilichamen is beoordeeld door het evalueren van de groeiremming van menselijke beenmergcellen of TF-1 cellen gestimuleerd met GM-CSF 6-8. In de bioassay-systeem, is het echter vaak problematisch om betrouwbare gegevens en de gegevens te vergelijken van verschillende laboratoria, als gevolg van de technische problemen bij het handhaven van de cellen in een constante toestand. DOELSTELLING: Het GM-CSF na te bootsen binding aan GM-CSF-receptor op het celoppervlak behulp van cel-vrije receptor-bindende-assay. METHODEN: Transgene zijderups techniek was toegepast voor het verkrijgen van een groot bedrag voor recombinant oplosbaar GM-CSF receptor alpha (sGMRα) met een hoge zuiverheid 9-13. Het recombinante sGMRα werd opgenomen in de hydrofiele sericine lagen van de zijden draden zonder gefuseerd aan de zijde proteïnen, en dus kunnen we gemakkelijk van de cocons in goede zuiverheid extract met een neutrale waterige oplossingen 14,15. Gelukkig is de oligosaccharide structuren, die kritisch zijn voor de binding met GM-CSF, zijn meer vergelijkbaar met de structuur van de menselijke sGMRα dan die welke door andere insecten of gisten. Resultaten: De cel-vrije assay systeem met behulp van sGMRα leverde de gegevens met hoge plasticiteit en betrouwbaarheid. GM-CSF binding aan sGMRα was dosis-afhankelijk geremd door polyklonaal GM-CSF autoantilichaam op een vergelijkbare manier aan de bioassay met behulp van TF-1-cellen, wat aangeeft dat onze nieuwe cel-vrije assay systeem met behulp van sGMRα is nuttiger voor het meten van neutraliserende activiteit van GM-CSF autoantilichamen dan de biologische systeem met behulp van TF-1 cel of een menselijke beenmergcellen. Conclusies: We hebben een celvrije assay het kwantificeren van de neutraliserende capaciteit van GM-CSF autoantilichaam.

We ontwierpen een cel-vrije receptor binding assay om de binding van granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) te schatten aan de receptoren. Het stelt ons in staat te evalueren competitieve remming van gebiotinyleerd GM-CSF binding aan oplosbare GM-CSF receptor alfa door GM-CSF autoantilichaam met uitstekende reproduceerbaarheid.

Een celvrij Assay System Het inschatten van de neutraliserende vermogen van GM-CSF antilichaam met behulp van recombinante oplosbare GM-CSF receptor

ACHTERGROND: Voorheen hebben we aangetoond dat de neutraliserende capaciteit, maar niet de concentratie van GM-CSF-autoantilichamen, correleerde met de ziekte ...

Het algemene doel van dit experiment is om een celvrije assay vast te stellen die de neutraliserende capaciteit van G-M-C-S-F auto-antilichamen kwantificeert. We beginnen met het verkrijgen van transgene zijderupsen. Breng het menselijke SGMR alpha-gen over om recombinant SGMR alpha te produceren en label vervolgens het recombinante menselijke G-M-C-S-F via bioTE.Vervolgens evalueren we de correlatie tussen het celvrije systeem en een reguliere bioassay met een studie naar de inhibitie van de binding van G-M-C-S-F aan SGMR alfa door G-M-C-S-F autoantilichamen. De verkregen resultaten tonen een significante correlatie aan tussen de groeiremming van de bioassay en de bindingsinhibitie van het celvrije systeem door serum IgG-fracties en gezuiverde G-M-C-S-F autoantilichamen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de TF one bioassay, is dat dit systeem een hoge analyse-efficiëntie met een goede reproduceerbaarheid biedt voor het meten van de neutraliserende capaciteit van GM CSF autoantilichamen.Aangezien GM CSF-auto-antilichamen leiden tot een auto-immuun primaire algehele prognose, strekken de implicaties van deze techniek zich uit tot

a-cell-free-assay-system-estimating-neutralizing-capacity-gm-csf

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates the in vitro differentiation of granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor or GM-CSF-producing T helper cells (THGM). Isolated naïve T cells are stimulated for differentiation into THGM, which is confirmed by detecting high intracellular GM-CSF production and a low expression of other T helper cell-specific cytokines.

An In Vitro Technique to Differentiate GM-CSF Producing T Helper Cells from Na&iuml;ve T Cells

This video demonstrates Microneutralization assays to measure neutralizing antibodies using Madin-Darby Canine Kidney cells overexpressing α2,6-linked sialic acid in human sera. This assay is often used for influenza human...

A Microneutralization Assay to Measure Neutralizing Antibody Titers in Human Serum

In de afgelopen jaren zijn levende celgebaseerde proeven met succes gebruikt om antilichamen tegen oppervlak en conformationele antigenen. Hier beschrijven we een werkwijze met hoge doorvoer flowcytometrie waardoor de analyse van grote patiëntencohorten. Detectie van nieuwe antilichamen verbetert diagnose en behandeling van immuun-gemedieerde aandoeningen.

High-throughput flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen N-methyl-D-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum

Beschrijven we een methode voor het meten van de activering van Fc-gemedieerde effector functies door antilichamen die gericht het influenza virus hemagglutinine. Deze test kan ook worden aangepast voor de beoordeling van het vermogen van monoclonal antilichamen of polyclonal sera gericht op andere virale oppervlakte glycoproteïnen ertoe Fc-gemedieerde immuniteit.

Een methode om te beoordelen van Fc-gemedieerde Effector functies geïnduceerd door Influenza hemagglutinine specifieke antilichamen

Wij hebben ectopically NR1 subeenheid van NMDA receptor gelabeld met groen fluorescent proteïne in menselijke embryonale cellen (HEK293) als antigeen te detecteren autoantilichamen tegen NMDA receptor in het bloed van patiënten verdacht met auto-immune encefalitis. Deze eenvoudige methode kan geschikt voor screeningonderzoek in klinische instellingen zijn.

Een eenvoudige cel-gebaseerde immunofluorescentie Assay voor het detecteren van Autoantibody tegen de N-Methyl-D-aspartaat (NMDA)-Receptor in het bloed

Hier presenteren we een cel-gebaseerde stroom cytometry methode voor het detecteren van neutraliserende antilichamen of andere factoren die met de cellulaire opname van enzym vervangende therapieën in een menselijke matrix, zoals cerebrale spinal fluid (CSF) of menselijk serum interfereren.

Opsporing van antilichamen die de cellulaire opname van enzym vervangende therapieën met een test van cel-gebaseerde neutraliseren

Hier presenteren we een protocol te differentiëren lymfkliertest granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T-helper (THGM) cellen van naïef CD4 + T-cellen, met inbegrip van isolatie van naïeve CD4 + T cellen, differentiatie van THGM, en analyse van gedifferentieerde THGM cellen. Deze methode kan worden toegepast op de studies van de verordening en de functie van THGM cellen.

In Vitro Differentiatie van muis granulocyt-macrofaag-kolonie-stimulerende Factor (GM-CSF)-produceren van T-Helper (THGM) cellen

Deze studie beschrijft een methode om exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes te isoleren die immuunstimulerende granulocyten macrofaagkolonie-stimulerende factoren dragen uit embryonale stamcellen.

Isolatie van exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes met granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor uit embryonale stamcellen

We presenteren een genetisch gemodificeerde vrije (GM-vrije) methode om cellen met een neuronaal fenotype te verkrijgen uit geherprogrammeerde perifere bloedcellen. Activering van een signaleringsroute gekoppeld aan nieuwe menselijke GPI-gebonden eiwitten onthult een efficiënte GM-vrije methode voor het verkrijgen van menselijke pluripotente stamcellen.

GM-vrije generatie van bloed-afgeleide neuronale cellen

Het gebruik van referentiereagentia voor cytokine-afgifte zorgt voor meer reproduceerbare en gestandaardiseerde in vitro veiligheidsprofielen van immunotherapeutische monoklonale antilichamen. Hier beschrijven we hoe cytokine-afgiftetests kunnen worden gebruikt naast een referentiereagenspanel om de veiligheid van sommige therapeutische monoklonale antilichamen te voorspellen.

Gebruik van referentiereagentia om de robuustheid van cytokine-afgiftetests te bevestigen voor de voorspelling van de veiligheid van monoklonale antilichamen

We beschrijven een recent ontwikkeld immunoassayplatform gebaseerd op de principes van celvrije synthetische biologie en de dot-blot-techniek voor aanpasbare detectie van antilichaamrespons in menselijke en dierlijke sera.

Celvrije dot blot als een praktisch en aanpasbaar immunoassayplatform voor de detectie van antilichaamrespons in menselijke en dierlijke sera

Leer een celvrij receptorbindingsassay om de neutraliserende capaciteit van GM-CSF-autoantilichamen te kwantificeren met behulp van recombinante SGMR-alfa uit transgene zijderupsen. Deze methode biedt hoge reproduceerbaarheid.

Een celvrij Assay System Het inschatten van de neutraliserende vermogen van GM-CSF antilichaam met behulp van recombinante oplosbare GM-CSF receptor (Video) | JoVE Journal

Een celvrij Assay System Het inschatten van de neutraliserende vermogen van GM-CSF antilichaam met behulp van recombinante oplosbare GM-CSF receptor

Meer video's verkennen