Name: Visualisatie van de interstitiële cellen van Cajal (ICC) Netwerk in Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Leer het visualiseren van interstitiële cellen van Cajal (ICC) netwerken in de muisgastro-intestinale tractus met immunofluorescentietechnieken. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van ICC-architectuur en gastro-intestinale fysiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het National Cancer Institute (K08CA140946, tot YC), (5F32CA130372, naar PC), (R01CA102774 en R01HL055748 naar PB), het Ministerie van Defensie (PC094302 naar YC), het Shuman Family Fonds voor GIST Onderzoek (naar PC), en het Starr Kanker Consortium (naar PC, YC, CLS en PB). We willen graag Katia MANOVA, Ning Fan, en Mesurh Turkekul van de MSKCC Moleculaire Cytologie kernfaciliteit bedanken voor hun hulp bij cryosectioning en immunokleuring.

1. Dissectie van de muis maagdarmkanaal <ol><li> Gedood muizen door de lokale IUCAC richtlijnen </li><li> Pin elke ledemaat op piepschuim oppervlak en spoel buik oppervlak met 70% ethanol. Open buikholte met lange middellijn incisie vanuit het middenrif tot schaambeen. Maak een snede in de distale slokdarm en een tweede snede bij de distale dikke darm en verwijder het spijsverteringskanaal van maag tot anus en bloc, zorgvuldig snijden ligamenten aan de twaalfvingerige darm en blindedarm met behulp van een klein schaartje. Plaats spijsverteringskanaal in een petrischaaltje met PBS. Ontleden weg mesenterium met een pincet (Figuur 1). De maag, dunne darm en dikke darm, knippen bij pylorus en Bauhin knooppunt te scheiden. Spoel het lumen van elk deel van het maagdarmkanaal met PBS met behulp van een 5ml spuit bevestigd aan een voeding naald (oudere muizen) of stompe naald (jongere muizen). </li><li> Open maag, dunne darm en dikke darm langs de mesenteriale grens. Knip twee stukken voor elk deel van het maagdarmkanaal, een voor de ganse berg visualisatie en een voor cryosection. </li></ol> 2. Hele monteren monstervoorbereiding en immunokleuring <ol><li> Plaats het hele stuk van elk deel van maag-darmkanaal in een 1,5 cm microfugebuisje gevuld met 1,0 ml ijskoude aceton en vast monsters voor ten minste 1 uur bij 4 ° C. Monsters kunnen worden opgeslagen voor maximaal 1 week bij -20 ° C. We meestal slaan monsters in aceton en ga verder met cyrosections voor te bereiden. </li><li> Was monster 2X met PBS. Plaats monster in petrischaal met PBS. Onder ontleden microscoop, voorzichtig afschrapen mucosale laag met een scalpel door de holding een uiteinde met een pincet, het verlaten van de muscularis. </li><li> Spier kan worden gesneden in 5mm stuks voor kleuring met verschillende antilichamen. Niet opslaan voor meer dan 2 dagen in PBS voor de kleuring. </li><li> Blok en incubatie stappen kunnen worden gedaan in een putje van een 24-well plaat of in een 1,5 ml microfugebuis. Blok met 0,5 ml van het blokkeren van buffer (5% geit serum, 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 1 uur bij 4 ° C). </li><li> Incubeer met primaire antilichaam verdund in de blokkeerbuffer en draait overnacht bij 4 ° C. We hebben met succes gebruikt ACK-2 rat anti-Kit, konijn anti-Ano1, en konijn anti-Pgp9.5 antilichamen voor ganse berg immunokleuring. </li><li> Was gedurende 5 min. 2x met PBS op rotator bij kamertemperatuur. </li><li> Incubeer met secundaire antilichaam verdund in blokkerende buffer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op rotator. Wij gebruiken meestal de Alexa Fluor 488 anti-konijn en Alexa Fluor 594 anti-rat antilichamen. </li><li> Was gedurende 15 min 3X met PBS op rotator bij kamertemperatuur. </li><li> Mount op dia, sereuze kant op de top om de oriëntatie van de weefsels te garanderen tijdens microscopie. Deze oriëntatie zal zorgen voor de sereuze kant naar de dekglaasje gezicht en eerst worden aangetroffen als een zich richt op de dia op een microscoop. We doen dit op een dissectie microscoop. Soms hebben we kort ingegaan op het weefsel onder fluorescentie microscopie goed te oriënteren. Onder fluorescentie microscopie aan Kit of Ano1 visualiseren, moet een eerste ontmoeting van de ICC-MY netwerk van de kant van de dekglaasje aan. Vervolgens aspiratie PBS zoveel mogelijk zonder dat het volledig drogen. Voeg 50 ul van harde set monteren media (we gebruiken Verleng Gold) en voorzichtig plaats dekglas op de top van het weefsel. Laat instelling van de montage 's nachts bij kamertemperatuur en op te slaan dia's bij -80 ° C. </li><li> Voor microscopisch onderzoek hebben we gebruik gemaakt van een wide-veld microscoop met een Z-drive. We gebruikten ofwel een 20X lucht doelstelling (NA 0,75, plan apochromat) of 60X olie doelstelling (NA 1,4, plan apochromat) en nam 2 urn of een urn Z-profielen, dat beslaat het hele muscularis. De beelden werden vervolgens met behulp van deconvoluted Autoquant deconvolutie software. Als alternatief zijn er vele anderen gebruikt confocale microscopie in plaats daarvan met vergelijkbare resultaten. </li></ol> 3. Cryosection voorbereiding en immunokleuring <ol><li> Plaats elk deel van het maagdarmkanaal, de sereuze naar beneden, plat op filtreerpapier. Cut filter papier om het weefsel. Plaats tissue op filtreerpapier in 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS (we 32% paraformaldehyde verdunnen in verzegelde flacon op in PBS vlak voor gebruik) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Fixatie kan worden gedaan in een 6 - of 12-well plaat afhankelijk van de grootte van het weefsel, of in een 1,5 ml microfugebuis. Indien het wordt gedaan in de plaat, tot een minimum te beperken parafilm PFA blootstelling. Langere fixatie tijden kan dit leiden tot antigeen maskeren, met name voor de ACK-2 anti-Kit antilichaam. </li><li> Verwijderen weefsel van PFA en plaats in 30% sucrose in PBS. Laat weefsel een nacht zinken in 4 ° C. </li><li> Evenwicht weefsel met 1:1 verhouding van 30% sucrose en de LGO gedurende 1 uur. Dient vervolgens verticaal te monteren weefsel in cryomold gevuld met oktober De lengteas van het maagdarmkanaal moet worden parallel met de cyrosections. Bij de behandeling van muizen met verschillende genotypes of met verschillende behandelingen, kan het nuttig zijn om weefsel monteren van verschillende muizen op dezelfde cryomold om parallelle verwerking te waarborgen. Freeze op droog ijs en plaats in de -80 ° C vriezer voor de opslag. </li><li> Snij 10 urn vriescoupesop glijbaan en bewaar bij -80 ° C vriezer. We meestal gesneden uit twee delen per slide. We hebben ook meestal uit te voeren H &amp; E kleuring van een cryosection dia. </li><li> Voor immunofluorescentie, eerst evenwicht glijbaan bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Teken cirkel rond weefsel met behulp van PAP pen. </li><li> Blok met 150 ul van het blokkeren van buffer (dezelfde als voor de gehele montage immunokleuring) gedurende 1 uur. </li><li> Aspireren blokkeerbuffer en voeg 150 ul primair antilichaam verdund in de blokkeerbuffer en incubeer overnacht bij 4 ° C in een bevochtigde kamer. </li><li> Was 5 min 2x met PBS. </li><li> Incubeer met secundaire antilichaam verdund in blokkerende buffer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Wij gebruiken meestal de Alexa 488 anti-konijn en Alexa 594 anti-rat antilichamen. </li><li> Was gedurende 15 minuten 3x met PBS. </li><li> Aspireren glijden zonder dat het volledig drogen weefsel. Voeg een druppel harde set montage media met DAPI (we gebruiken Verleng Gold) en plaats # 1.5 dekglaasje aan. Plaats glijbaan bij kamertemperatuur gedurende de nacht in te stellen en op te slaan in de -80 ° C vriezer. </li><li> Acquire triple fluorescentie beelden met behulp van DAPI, FITC, en Texas Red filter sets. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Hier gebruiken we de dikke darm als een voorbeeld. H &amp; E kleuring van een sucrose beschermde vaste vriescoupe gebruikt voor immunofluorescentie toont enkele artefacten in vergelijking met een referentie-paraffine gedeelte (figuur 2), waar de gele lijn markeert de myenterische plexus tussen de circulaire en longitudinale spieren lagen en de groene lijn markeert de grens tussen de mucosa en muscularlis. Het onderzoeken van de cryosection, van de serosa tot mucosa, moet je eerst kennis met de dunnere longitudinale spier (LM) laag, gevolgd door de dikkere ronde spier (CM) laag. De sectie moet in parallel met de longitudinale spieren, zodat de kernen van LM moet enigszins worden verlengd, terwijl de kernen van de CM moeten klein en rond. Tussen de LM en CM zijn myenterische plexi gemaakt van neuronen die vlek met Pgp9.5. Pgp9.5 ook vlekken neuronale processen in de CM. De myenterische ICC-netwerk (ICC-MY) omringen de myenterische plexus en zijn gemaakt van multipolaire cellen. Binnen de longitudinale spierlaag, zijn er zeldzame intramusculaire ICC (ICC-IMS) die bipolaire cellen lopen parallel met de spier. Binnen de cirkelvormige spierlaag, zijn er in overvloed ICC-IMS, die ook bipolaire cellen die parallel lopen met de ronde spier en zijn cross-delig met deze verlaging. Op de kruising van de muscularis en submucosa, de submucosale ICC netwerk van ICC-SMP is een vlakke netwerk van multipolaire ICC. Het onderzoeken van de hele berg Kit immunokleuring van de dikke darm, moet men verwachten dat de ICC-MY-netwerk eerste ontmoeting, en vervolgens de ICC-IM van de CM, en de ICC-SMP-netwerken, als een zich vanaf het dekglaasje (Figure. 3) . Volumetrische meten van ICC-netwerken met behulp van 3D-reconstructie van de hele berg foto's zijn beschreven 10. Het gebruik van wide-field microscoop, er aanzienlijke out-of-plane fluorescentie in de ruwe beelden die kunnen worden verwijderd na deconvolutie (figuur 3). Onvolledige strippen van de mucosa zal resulteren in hoge achtergrond fluorescentie. ANO1 is een andere marker van ICC en co-immunokleuring van KIT en ANO1 toont volledige overlap van ICC kleuring (figuur 4). <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Vertegenwoordiger ontleed muis maag-darmkanaal, met toestemming overgenomen 13. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. A) Representatieve H &amp; E kleuring van de muis dikke darm van vriescoupes bereid zoals beschreven en referentie in paraffine ingebedde sectie laten zien krimpen artefacten van vriescoupes. De gele lijn markeert de myenterische plexus en de blauwe lijn scheidt het slijmvlies van de muscularis. B) Representatieve Kit (rood, ACK-2) en Pgp9.5 (groen) dubbele immunofluorescentie met DAPI (blauw) tegenkleuring van de muis dikke darm. LM: longitudinale spieren CM: kringspier. Schaalbalk 20 urn. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Vertegenwoordiger Kit (rood, ACK-2) hele-mount immunofluorescentie van hetzelfde veld op drie centrale vliegtuigen, het ICC-mijn vliegtuig bij de LM / CM grens, het ICC-IM vliegtuig in de CM, en het ICC- SMP vliegtuig op de CM / submucosa grens. RAW-beelden en deconvoluted beelden worden getoond. Schaalbalk 20 urn. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Representatieve dubbele immunofluorescentie van Ano1 (groen) en Kit (rood, ACK-2) in de dikke darm. Schaalbalk 20 urn.

<ol><li>Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+case+for+interstitial+cells+of+Cajal+as+pacemakers+and+mediators+of+neurotransmission+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract.</a> Gastroenterology. 111, 492-515 (1996).</li>
<li>Ward, S. M., Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+pathophysiology+of+the+interstitial+cell+of+Cajal%3A+from+bench+to+bedside.+I.+Functional+development+and+plasticity+of+interstitial+cells+of+Cajal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal: from bench to bedside. I. Functional development and plasticity of interstitial cells of Cajal networks.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281, 602-611 (2001).</li>
<li>Komuro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+organization+of+interstitial+cells+of+Cajal+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract.</a> J Physiol. 576, 653-658 (2006).</li>
<li>Sanders, K. M., Ordog, T., Koh, S. D., Torihashi, S., Ward, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+interstitial+cells+of+Cajal%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of interstitial cells of Cajal.</a> Neurogastroenterol Motil. 11, 311-338 (1999).</li>
<li>Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+proto-oncogene+c-kit+blocks+development+of+interstitial+cells+and+electrical+rhythmicity+in+murine+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine.</a> J Physiol. 480, 91-97 (1994).</li>
<li>Huizinga, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((W%2Fkit+gene+required+for+interstitial+cells+of+Cajal+and+for+intestinal+pacemaker+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">W/kit gene required for interstitial cells of Cajal and for intestinal pacemaker activity.</a> Nature. 373, 347-349 (1995).</li>
<li>Rubin, B. P., Heinrich, M. C., Corless, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+stromal+tumour%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal stromal tumour.</a> Lancet. 369, 1731-1741 (2007).</li>
<li>Hirota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-of-function+mutations+of+c-kit+in+human+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors.</a> Science. 279, 577-580 (1998).</li>
<li>Chi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETV1+is+a+lineage-specific+survival+factor+in+Gastrointestinal+Stromal+Tumour+%28GIST%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ETV1 is a lineage-specific survival factor in Gastrointestinal Stromal Tumour (GIST).</a> Nature. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Kwon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+structure+and+function+of+ICC+networks+in+ICC+hyperplasia+and+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Changes in the structure and function of ICC networks in ICC hyperplasia and gastrointestinal stromal tumors.</a> Gastroenterology. 136, 630-639 (2009).</li>
<li>Hwang, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+anoctamin+1%2FTMEM16A+by+interstitial+cells+of+Cajal+is+fundamental+for+slow+wave+activity+in+gastrointestinal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression of anoctamin 1/TMEM16A by interstitial cells of Cajal is fundamental for slow wave activity in gastrointestinal muscles.</a> J Physiol. 587, 4887-4904 (2009).</li>
<li>Gomez-Pinilla, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ano1+is+a+selective+marker+of+interstitial+cells+of+Cajal+in+the+human+and+mouse+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1370-G1381 (2009).</li>
<li>Sommer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6706-6711 (2003).</li>
</ol>

Interstitiële cellen van Cajal werden aanvankelijk gekenmerkt door Santiago Ramóón y Cajal precies een eeuw geleden met behulp van methyleenblauw en zilver chromaat vlekken van gastro-intestinale muscularis. Cajal in eerste instantie gedacht ICC werden neuronen op basis van hun processen, die doen denken aan axonen en dendrieten. Gedurende vele jaren daarna, heeft studie van ICC biologie beperkt door het ontbreken van specifieke markers tot de ontdekking van die KIT niet alleen uitgedrukt in ICC, maar is ook nodig voor hun ontwikkeling 6. Sindsdien is KIT immunofluorescentie op grote schaal gebruikt in de studie van ICC biologie en heeft ook geleid tot de waardering van ICC in andere contractiele organen zoals de blaas. Onlangs heeft ANO1 is geïdentificeerd als een seconde betrouwbare ICC marker. Er zijn tal van publicaties over de afgelopen 15 jaar met behulp van immunofluorescentie om ICC te identificeren met behulp van verschillende fixatie en montage technieken. In onze handen &quot;fixed-bevroren &#39;vriescoupes die zijn voorafgegaan door paraformaldehyde en beschermd sucrose werkt het beste in vergelijking met aceton of paraformaldehyde post-fixatie na cryosectioning. Voor de hele mounts, hebben we ontdekt dat aceton fixatie gevolgd door mucosale dissectie van de meest robuuste resultaten geeft. Historisch gezien is de ACK-2 is de Kit antilichaam van de keuze voor de muis ICC identificatie. Het is een monoklonaal rat die de extracellulaire domein herkent en het is ook een blokkerende antistof die ileus veroorzaakt bij toediening aan muizen leven. Echter, de ACK-2 epitoop langzaam vernietigd door paraformaldehyde fixatie en wordt niet gered door standaard antigen retrieval methoden. We hebben gevonden dat de ACK-4 epitoop is beter bestand tegen paraformaldehyde fixatie. In vergelijking met vaste bevroren blokken en secties, in paraffine ingebedde blokken en secties behoudt morfologie beter en is meer vatbaar voor lange termijn archivering (figuur 4). Noch ACK-2, noch ACK-4 met succes gebruikt in paraffine secties. We hebben gekenmerkt dat D13A2, een nieuw konijn monoklonaal antilichaam, werkt uitstekend in zowel vaste-bevroren en paraffine secties van het maag-darmkanaal. Kit is uitgedrukt in verschillende andere typen cellen, inclusief melanocyten, hematopoietische cellen, geslachtscellen, en in het bijzonder mestcellen, die ook zijn te vinden in het maag-darmkanaal. Gelukkig zijn de meeste mestcellen gevonden is het slijmvlies en niet in de muscularis. Dubbele kleuring met konijnen anti-Ano1 en rat anti-Kit kan elimineren niet-specifieke kleuring van elk antilichaam (figuur 4). Het is ook vermeldenswaard dat de relatieve expressie van Kit en Ano1 tussen subklassen van ICC verschillende lijkt. Bijvoorbeeld, in de dunne darm, Kit kleuring is veel intenser in myenterische ICC in vergelijking met ICC van de diepe spieren plexus terwijl Ano1 kleuring is vergelijkbaar.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> rat anti-Kit antilichaam (kloon ACK-2) </td><td> eBioscience </td><td> 14-1172 </td><td> Gebruik op 2μg/ml. Epitoop is verloren met overfixation. </td></tr><tr><td> rat anti-Kit antilichaam (kloon ACK-4) </td><td> Cedarlane </td><td> CL8936AP </td><td> Gebruik op 2μg/ml. </td></tr><tr><td> konijn anti-KIT antilichaam (kloon D13A2) </td><td> Cell Signaling </td><td> 3074 </td><td> Gebruik bij 1:100 verdunning. Alleen antilichaam hier vermeld, dat werkt goed in paraffine secties. </td></tr><tr><td> konijn anti-Pgp9.5 antilichaam </td><td> Abcam </td><td> ab10404 </td><td> Labels neuronale cel cytoplasma. Handig voor het markeren van neuronen van de myenterische plexus. Gebruik op 1:1000 verdunning. </td></tr><tr><td> konijn anti-Ano1 antilichaam </td><td> Abcam </td><td> ab53212 </td><td> Gebruik op 2μg/ml </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 geit-anti-rat IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11007 </td><td> Gebruik op 2μg/ml </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 geit anti-konijn IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11008 </td><td> Gebruik op 2μg/ml </td></tr><tr><td> Animal Feeding Naald </td><td> Visser </td><td> 01-208-87 </td><td> Silicon getipt naald nuttig voor het doorspoelen van maag-darmstelsel van volwassen muizen </td></tr><tr><td> Stompe naald </td><td> Becton Dickison </td><td> 305180 </td><td> Stompe naald nuttig voor het doorspoelen van maag-darmstelsel van de pre-gespeende pups </td></tr><tr><td> ProLong Gold antifade reagens met DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P-36931 </td><td> Kunnen gebruik maken van andere hard-instelling montage media met DAPI </td></tr><tr><td> Tissue-Tek Cryomold </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4557 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek oktober </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 32% Paraformaldehyde (10ml gesloten ampul) </td><td> EM Sciences </td><td> 15714 </td><td> Open verzegelde ampul en verdun tot 4% vlak voor gebruik </td></tr><tr><td> Blockingbuffer </td><td></td><td></td><td> 5% Geit serum, 0,1% Triton X-100 in PBS </td></tr></tbody></table>

visualisatie van de interstitiële cellen van cajal (icc) netwerk in muizen

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

De interstitiële cellen van Cajal (ICC) zijn mesenchymale afgeleid &quot;pacemaker cellen&quot; van het gastro-intestinale (GI) stelsel, dat spontane trage golven die nodig zijn voor peristaltiek genereren en bemiddelen neuronale input van het enterisch zenuwstelsel systeem1. Verschillende subtypes van ICC formulier verschillende netwerken in de muscularis van het maagdarmkanaal 2,3. Verlies of schade aan deze netwerken wordt in verband gebracht met een aantal motiliteitsstoornissen 4. ICC-cellen brengen de KIT-receptor tyrosine kinase op de plasmamembraan en KIT immunokleuring is gebruikt voor de afgelopen 15 jaar aan het ICC-netwerk 5,6 label. Belangrijker is, is normaal KIT activiteit die nodig zijn voor het ICC ontwikkeling van 5,6. Neoplastische transformatie van ICC-cellen resulteert in gastro-intestinale stromale tumor (GIST), die vaak haven gain-of-function KIT mutaties 7,8. We hebben onlangs aangetoond dat ETV1 is een lijn-specifieke overleving factor, uitgedrukt in het ICC / GIST afkomst en is een meester in transcriptionele regulator die nodig zijn voor zowel de normale ICC-netwerk voor vorming en van GIST tumorigenese 9. We verder aantonen dat het samenwerkt met activerende KIT mutaties in ontstaan ​​van tumoren. Hier beschrijven we methoden voor het visualiseren van de ICC-netwerken in muizen, grotendeels gebaseerd op eerder gepubliceerde protocollen 10,11. Meer recent heeft het chloride kanaal anoctamin 1 (ANO1) ook gekenmerkt als een specifieke marker membraan van ICC 11,12. Door hun plasmamembraan lokalisatie, kan immunofluorescentie van beide eiwitten worden gebruikt om de ICC-netwerken te visualiseren. We beschrijven hier visualisatie van de ICC-netwerken door vaste-ingevroren cyrosections en hele berg preparaten.

De interstitiële cellen van Cajal (ICC) zijn de pacemaker cellen van het gastro-intestinale (GI) stelsel. Ze vormen complexe netwerken tussen gladde spiercellen en postganglionaire neuronale vezels GI contractiliteit te reguleren. Hier presenteren wij immunofluorescentie methoden cross-sectionele en hele-mount visualisatie van muriene ICC-netwerken.

Visualisatie van de interstitiële cellen van Cajal (ICC) Netwerk in Muizen

De interstitiële cellen van Cajal (ICC) zijn mesenchymaal afgeleide "pacemakercellen" van het maag-darmkanaal die spontane langzame golven genereren ...

Het algemene doel van deze procedure is het visualiseren van ICC-netwerken in het maag-darmkanaal van de muis. Dit wordt bereikt door eerst het volledige maag-darmkanaal te dissekeren en te isoleren, en dit vervolgens te verdelen in de maag, de dunne darm, het caecum en de dikke darm. Vervolgens wordt elk deel van het maag-darmkanaal gefixeerd, óf in aceton gevolgd door verwijdering van het slijmvlies voor whole-mount imaging, óf in gepoederde formaldehyde, gevolgd door inbedding en cryosectie voor dwarsdoorsnede-imaging.De monsters worden vervolgens immunogekleurd tegen kit en andere epitopen om ICC en andere relevante structuren te labelen. Ten slotte worden er beelden gemaakt met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de effecten van genetische of omgevingsmanipulaties van muizen op de ICC-architectuur laten zien via immunofluorescentiemicroscopie.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het ICC-veld, zoals de wijze waarop specifieke signaleringsnetwerken en transcriptiefactoren de architectuur van ICC-netwerken beïnvloeden. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ervaren, omdat onjuiste verwijdering van de mucosalaag en een foutieve oriëntatie van het whole-mount preparaat zullen leiden tot aanzienlijke achtergrondkleuring en verlies van het specifieke signaal. Om te beginnen met de dissectie van het gastro-intestinale tractus van de muis, worden de ledematen van een geëuthanaseerde muis met pinnen op een styrofoam oppervlak vastgezet en wordt het buikoppervlak afgespoeld met 70% ethanol. Open de buikholte met een lange mediane incisie van het diafragma tot het schaambeen.Maak één incisie bij de distale slokdarm en een tweede incisie bij de distale dikke darm en verwijder het gehele maagdarmstelsel van de maag tot de anus in zijn geheel. Knip de ligamenten bij het duodenum en het mesenterium voorzichtig door met een kleine schaar. Plaats het maagdarmstelsel in een Petrischaal met PBS.Dissecteer het mesenterium weg met een pincet om de maag, de dunne darm en de dikke darm van elkaar te scheiden. Maak een incisie bij de pylorus en de ileocecale overgang met behulp van een spuit van vijf milliliter voorzien van een voedingsnaald of stompe naald. Spoel het lumen van elk deel van het maag-darmkanaal met PBS.Open de maag, dunne darm en dikke darm langs de mesenteriale rand. Snijd voor elk GI-orgaan twee stukken, één voor visualisatie van het gehele preparaat (whole mount) en één voor cryosneden. Fixeer het whole mount-monster in aceton voorafgaand aan het maken van de cryosneden om het monster voor immuunkleuring voor te bereiden.Was eerst het monster twee keer in PBS. Plaats het monster vervolgens in een Petrischaal met PBS onder een dissectiemicroscoop. Schraap de slijmlaag voorzichtig met een scalpel weg door één uiteinde met een pincet vast te houden, waarbij de muscularis intact blijft; snijd de spier in stukjes van vijf millimeter voor kleuring met verschillende antilichamen.Bewaar het monster niet langer dan twee dagen in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter vóór het kleuren. Incubeer het monster gedurende één uur bij vier graden Celsius in blokkeringsbuffer. Incubeer het monster vervolgens in primaire antilichamen verdund in blokkeringsbuffer en roteer dit gedurende de nacht bij vier graden Celsius.We hebben met succes CK 2 rat anti-kitt, konijn anti-αO1 en konijn anti-PGP 9.5 antilichamen gebruikt voor whole mount kleuring. De volgende ochtend de monsters twee keer vijf minuten wassen in PBS met zachte rotatie.Incubeer de monsters vervolgens gedurende twee uur in secundaire antilichamen verdund in blokkeringsbuffer. Bij kamertemperatuur gebruiken we doorgaans Alexa Fluor 4 88 anti-konijn en Alexa 5 94 anti-rat antilichamen. Was de monsters 3 keer gedurende elk 15 minuten in PB S.Monteer de monsters met behulp van een dissectiemicroscoop op objectglazen met de serosale zijde naar boven door zoveel mogelijk PBS te verwijderen. Breng ongeveer 50 µL hardstollend monteermedium aan en plaats daar een dekglas bovenop. Laat het monteermedium een nacht uitharden en bewaar de objectglazen bij -80 °C.Gebruik voor observatie en beeldvorming een microscoop met een breedveldobjectief. Met een Z-drive gebruiken we een luchtobjectief van 20x of een olie-objectief van 60x om Z-secties van één of twee micron vast te leggen die de gehele muscularis beslaan. De beelden worden vervolgens gedeconvolueerd met behulp van AutoQuant-deconvolutiesoftware.Als alternatief kan confocale microscopie worden gebruikt om cryosneden voor immunokleuring voor te bereiden. Plaats elk deel van het maagdarmkanaal met de seroze zijde naar beneden plat op filterpapier. Snijd het filterpapier rondom het weefsel uit.Plaats het weefsel op het filterpapier in 4%paraldehyde in PBS gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Langere fixatietijden kunnen leiden tot antigeenmaskering, met name voor het a K twee anti-kit antilichaam. Verplaats het weefsel naar 30%Sucrose in PBS en laat het weefsel een nacht zinken bij vier graden Celsius.Equilibreer het weefsel gedurende één uur in een mengsel van 30% sucrose en OCT in een verhouding van één-op-één. Monteer het weefsel vervolgens verticaal in een cryovorm die is gevuld met OCT. De longitudinale as van het maag-darmkanaal moet parallel lopen aan de cryosneden.Bij het onderzoeken van muizen met verschillende genotypen of na verschillende behandelingen kan het nuttig zijn om het weefsel van verschillende muizen op hetzelfde cryovormblok te monteren. Om parallelle verwerking te waarborgen, worden de vormblokken bevroren op droogijs en bewaard bij -80 °C. Maak cryosneden van 10 µm op objectglazen, waarbij twee sneden per objectglas worden geplaatst, en bewaar deze bij -80 °C.Meestal voeren we h- en d-kleuringen uit op één objectglas voor immunofluorescentie. Laat de objectglazen eerst 15 minuten equilibreren bij kamertemperatuur. Trek vervolgens met een pap-pen een cirkel om het weefsel.Incubeer de coupes gedurende één uur in 150 µL blokkeringsbuffer. Aspireer de blokkeringsbuffer, voeg 150 µL primaire antilichamen toe, verdund in blokkeringsbuffer, en incubeer dit gedurende de nacht bij 4 °C in een bevochtigde kamer. Was twee keer gedurende vijf minuten met PBS en incubeer de monsters vervolgens gedurende twee uur met secundaire antilichamen verdund in blokkeringsbuffer.Bij kamertemperatuur gebruiken we doorgaans Alexa 488 anti-konijn en Alexa 594 anti-rat antilichamen. Was de coupes 3 keer gedurende elk 15 minuten in PBS; besproei de coupes zodat het weefsel niet volledig uitdroogt. Voeg een druppel hardset monteermedium met DPI toe en plaats daarop een nummer 1,5 dekglas.Laat de coupes een nacht bij kamertemperatuur rusten om de monsters te kunnen beelden met dpi-, fite- en Texas red-filtersets. Onderzoek de dikke darm van de serosa tot aan het slijmvlies. De dunnere laag longitudinale spier of LM wordt als eerste aangetroffen, gevolgd door de dikkere circulaire spier of cm.De doorsnede moet parallel lopen aan de longitudinale spier en loodrecht op de circulaire spier, zodat de kernen van de LM enigszins langwerpig zijn, terwijl de kernen van de CM klein en rond moeten zijn; tussen de LM en de CM bevinden zich de myenterische plexi, bestaande uit neuronen die kleuren met PGP 9.5. PGP 9.5 kleurt ook neuronale uitlopers door de gehele CM bij onderzoek van het whole mount preparaat. Wanneer u scherpstelt vanaf het dekglas, komt u de I-C-C-M-Y-I-C-C-I-M van de CM en I-C-C-S-M-P tegen.Het MYENTERIC ICC-netwerk omringt de myenterische plexus en bestaat uit multipolaire cellen binnen de longitudinale spierlaag. Er zijn zeldzame intramusculaire ICC's, wat bipolaire cellen zijn die parallel aan de spieren in de circulaire spierlaag lopen. Er zijn overvloedige ICC ims, wat eveneens bipolaire cellen zijn die parallel aan de circulaire spieren lopen en in deze doorsnede zichtbaar zijn op de overgang tussen de muscularis en de submucosa.Het submucosale ICC-netwerk is een plat netwerk van multipolaire cellen. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in drie dagen worden uitgevoerd mits deze correct wordt toegepast. U dient een goede kennis te hebben van het dissekeren en immunokleuren van het maagdarmstelsel van de muis om de ICC-architectuur te kunnen observeren.

visualization-of-the-interstitial-cells-of-cajal-icc-network-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates the visualization of γδ intraepithelial lymphocytes (IELs) in transgenic mice using confocal microscopy. The surgical procedure involves creating a perforation line and making a longitudinal incision to expose the intestinal mucosa and villi. The transgenic mice express reporter proteins exclusively in γδ IELs, allowing their tracking. Intravital imaging captures the dynamic movement of green fluorescence-labeled γδ IELs along the intestinal epithelial cell's basement...

Intravital Visualization of Gamma Delta Intraepithelial Lymphocytes

This video demonstrates the process of visualizing a biocytin-filled interneuron in a rat hippocampal section, highlighting its neurochemical identity through the use of specific antibodies and fluorescence microscopy.

Immunostaining of Interneurons in a Rat Hippocampal Section

Source: Bancroft, E. A., et al. Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons. J. Vis. Exp. (2020) This video demonstrates the real-time visualization of calcium influx in ventral midbrain neurons derived from mouse embryos. Using a viral vector to express a calcium indicator, the neurons are imaged under a confocal microscope to track changes in fluorescence intensity during spontaneous and neurotransmitter-induced calcium activity.

Visualization of Calcium Influx in Ventral Midbrain Neurons Derived from Mouse Embryos

Progenitorceltransplanten mitose is een kritische parameter van neurogenese. Veel van onze kennis van neurale voorlopercellen mitose is gebaseerd op de analyse van vaste weefsel. Live-beeldvorming in de embryonale hersenen plakjes is een veelzijdige techniek om mitose te beoordelen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in een gecontroleerde omgeving.

Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex

Verbeterde beeldvormingstechnologie maakt driedimensionale beeldvorming van organen mogelijk tijdens de ontwikkeling. Hier beschrijven we een systeem voor de kweek van hele organen dat levende beeldvorming van de zich ontwikkelende villi in de foetale muizendarm mogelijk maakt.

Muis Foetale Hele Darm Cultuur System voor Ex Vivo Manipulatie van signaalwegen en Driedimensionale Live-Imaging van Villus Development

Hier beschrijven we een procedure voor het weefsel wissen, fluorescerende benoemen, en grootschalige beeldvorming van muis hersenweefsel, waardoor, zodat, visualisatie van de driedimensionale organisatie van celtypes in de neocortex.

Grootschalige driedimensionale beeldvorming van cellulaire organisatie in de Neocortex muis

We beschrijven een methode om GFP-gelabeld γδ IELs met behulp van intravital Imaging van muizen dunne darm te visualiseren door omgekeerde spinnen schijf confocale microscopie. Deze techniek maakt het bijhouden van levende cellen in het slijmvlies voor maximaal 4 uur en kan worden gebruikt om een verscheidenheid van intestinale immuun-epitheel interacties te onderzoeken.

Intravital beeldvorming van epitheliale lymfocyten in muizen dunne darm

Hier wordt een benadering gepresenteerd voor intravitale beeldvorming op lange termijn met behulp van optisch heldere, siliconen vensters die rechtstreeks op het weefsel / orgaan van belang en de huid kunnen worden gelijmd. Deze ramen zijn goedkoper en veelzijdiger dan andere die momenteel in het veld worden gebruikt, en de chirurgische inbrenging veroorzaakt beperkte ontsteking en leed voor de dieren.

Longitudinale intravitale beeldvorming door heldere siliconenvensters

Dit protocol beschrijft een nieuw mammabeeldvormingsvenster met een vervangbaar deksel (R.MIW). Intravitale microscopie na implantatie van de R.MIW maakt longitudinale en meerdaagse beeldvorming van de gezonde en zieke borstklier mogelijk met een cellulaire resolutie tijdens de verschillende ontwikkelingsstadia.

Longitudinale intravitale microscopie met behulp van een mammabeeldvormingsvenster met vervangbaar deksel

Dit protocol beschrijft de procedure voor het in beeld brengen van calciumresponsen in de superieure colliculus (SC) van wakkere muizen, inclusief het in beeld brengen van de activiteit van één neuron met twee fotonen met behulp van twee-fotonmicroscopie terwijl de cortex intact blijft bij wild-type muizen, en het in beeld brengen van de gehele SC met breedveldmicroscopie bij mutante muizen met gedeeltelijke cortex.

Calciumbeeldvorming bij superieure colliculus bij muizen

De stria vascularis is van vitaal belang voor het genereren van endocochleair potentieel. Hier presenteren we de dissectie van de volwassen muis stria vascularis voor single-nucleus sequencing of immunostaining.

Dissectie van volwassen muis Stria vascularis voor single-nucleus sequencing of immunostaining

Leer het visualiseren van interstitiële cellen van Cajal (ICC) netwerken in de muisgastro-intestinale tractus met immunofluorescentietechnieken. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van ICC-architectuur en gastro-intestinale fysiologie.

Visualisatie van de interstitiële cellen van Cajal (ICC) Netwerk in Muizen

Meer video's verkennen