Name: Detectie van stikstofoxide en superoxide radicaal anion door Electron Paramagnetische Resonantie Spectroscopie van cellen met behulp van Spin Traps (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Leer de detectie van stikstofoxide en superoxide radicalen in cellen met behulp van EPR-spectroscopie en spin trapping. Deze methode biedt inzicht in reactieve soorten betrokken bij ziekteontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door de NIH National Heart, Lung, and Blood Institute subsidie ​​RO1 HL81248.

1. Cultuur van Bovine Aorta endotheelcellen (BAEC) <ol><li> De juiste aseptische technieken werden gevolgd. </li><li> In een waterbad, warme medium zonder antibiotica bij 37 ° C. </li></ol> Opmerking: Het medium bestaat fenolvrij Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met 4,5 g / L D-glucose, 4 mM L-glutamine, 1% niet-essentiële aminozuren, aangevuld met 10% foetaal bovine serum (FBS) en 2,5 mg / L endotheliale groeifactor. <ol start="3"><li> Verwijder de T75 kolf met cellen uit de incubator en reinig het oppervlak van de kolf met 70% ethanol voordat u het in de kap. </li><li> Verwijder de oude medium met behulp van een aspirator en was tweemaal met 5 ml van fosfaat Dulbecco's zoutoplossing (DPBS). </li><li> Voeg 2 ml trypsine en wacht voor 4-5 min voor de cellen los te koppelen tijdens het periodiek inspecteren van onder de microscoop. </li><li> Voeg 3 ml van het medium en herhaaldelijk te mengen met een pipet te scheiden tHij cellen en zorgen voor een gelijkmatige suspensie. </li><li> 5 ml van het medium met trypsine een 15 ml buis en centrifugeer bij 121 g gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder de supernatant met een aspiratorinstelling. Voeg 5 ml DPBS en meng. Centrifugeer bij 121g gedurende 5 minuten. </li><li> Zuig het supernatant en de cel pellet opnieuw te schorsen door het toevoegen van 6 ml van het medium. </li><li> Op een 6-wells plaat, 1 ml van de celsuspensie in elk putje dan 1 ml medium toevoegen. Meng de suspensie op met een pipet. </li><li> Label de plaat en nacht bij 37 ° C incuberen en 5% CO 2. </li></ol> 2A. Detectie van NO met BAEC Cell <ol><li> De juiste aseptische technieken werden gevolgd. </li><li> Verwijder de 6-well plaat uit de incubator en zuig het medium van de eerste goed. Twee keer Spoel de cellen met 1 ml DPBS. </li><li> Voeg 210 pi van 1,9 mM ijzer (II)-heptahydraat (FeSO 4 0,7 H 2 O, bereid door oplossen vers 0,8 mg1 ml DPBS met CaCl2 en MgCl2) en 210 ul van ammonium N-methyl-D-glucamine dithiocarbamaat (MGD, bereid door oplossen vers 2,7 mg in 500 pi DPBS met CaCl2 en MgCl2) met een verhouding van 1:7 . (Opmerking:. Deze verhouding waar overtollige MGD wordt gebruikt is gewoonlijk worden toegepast voor de bereiding van Fe2 +-MGD complex vanwege het feit dat het rendement van Fe3 +-MGD gemaximaliseerd in aanwezigheid van een overmaat MGD De toevoeging van ascorbaat in oplossing aan de Fe 2 stabiliseren +-MGD niet noodzakelijk is omdat de NO-Fe3 +-gevormde MGD endogeen is beperkt tot het EPR detecteerbare NO Fe2 +-MGD door ascorbaat, hydrochinon of cysteine ​​met omzettingsrendement tot 99,9% .. De lage spin diamagnetisch staat Fe2 + kan de detectie van NO met vlakke cel of capillair zonder dat een lage temperatuur apparaat) 15. </li><li> Schud de resulterende suspensie goed en voeg 4,6 μl calcium ionofoor (CAI) (bereid uit een voorraad oplossing van 1,9 mM door oplossen 1 mg 1 ml DMSO). </li><li> Werveling de oplossing weer en incuberen bij 37 ° C gedurende 36 min om verder mogelijk reductie van NO-Fe3 +-MGD de EPR detecteerbare NO Fe2 +-MGD. </li><li> De bovenstaande (425 pi) in een eppendorfbuisje en overdracht van een EPR vlakke cel (of een 50 pi capillair). </li><li> EPR-acquisitie parameters zijn: magnetron frequentie: 9,8 GHz; middenveld: 3427 G; modulatie amplitude: 6,0 g; sweep breedte: 100 G; ontvanger winst: 1 x 10 5; magnetron vermogen: 10 mW; totaal aantal scans: 121; Sweep tijd: 10 s, en de tijd constant: 20 ms (Let op: Omdat de parameters zal variëren van een instrument en experimentele omstandigheden naar de andere, dus alleen het middenveld, de frequentie en amplitude modulatie zijn de belangrijkste parameters om te overwegen.). </li><li> Neem de spectra bij kamertemperatuur en de 2-D-spectra werden integriteitgeclassificeerd op het achtergrondgeluid en de baseline gecorrigeerd met behulp van Bruker WinEPR Data Processing software of andere software voor dataverwerking te verminderen. Voor de kwantificering van adduct vorming, kan standaard standplaatsen van concentratie versus intensiteit van het signaal (of gebied) worden gebouwd met behulp van een NO donor SNAP. </li></ol> 2B. eNOS Ontkoppeling Experiment <ol><li> Verwijder de 6-well plaat uit de incubator en zuig het medium van de tweede goed en was tweemaal met 1 ml DPBS. </li><li> Een peroxynitriet donor, 5-amino-3-(4-morfolinyl) -1,2,3-oxadiazolium chloride (SIN-1) werd gebruikt om eNOS 16 ontkoppelen. Voeg 100 pi van 0,5 mM SIN-1 (M r 206,6 g / mol, van 10 mM voorraadoplossing vers bereid door het oplossen 1 mg SIN-een in 500 ul PBS zonder Ca / Mg ionen) en verdund tot 2 ml met DPBS en 10% FBS. </li><li> Incubeer 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Verwijder de plaat uit incubator en was tweemaal met DPBS. </li><li> Voeg 210 pi2,8 mM FeSO 4 .7 H 2 O en 210 ul van 19,6 mm MGD vers bereid volgens de procedure hierboven vermeld. </li><li> Schud de oplossing en voeg 4,6 pl van 1,9 mM CAI. </li><li> Werveling de oplossing weer en incuberen bij 37 ° C gedurende 36 min. </li><li> De bovenstaande (425 pi) in een eppendorfbuisje en overdracht van een EPR vlakke cel. </li><li> EPR-acquisitie parameters zijn: magnetron frequentie: 9,8 GHz; middenveld: 3427 G; modulatie amplitude: 6 G; sweep breedte: 100 G; ontvanger winst: 1 x 10 5; magnetron vermogen: 10 mW; totaal aantal scans: 121; Sweep tijd: 10 s, en de tijd constant: 20 ms. </li><li> Neem de spectra en de 2-D-spectra werden opgenomen met de ruis en de basislijn gecorrigeerd bovengenoemde verminderen. </li></ol> 3. Detectie van O 2 • - van Polymorf neutrofielen (PMN) <ol><li> Neutrofielen werden geïsoleerd uit humaan bloed, zoals eerder beschreven 17. </li><li> Maak een voorraad oplossing van 1 M DMPO * in PBS met 0,1 mM diethyleentriamine-pentaazijnzuur azijnzuur (DTPA). DMPO heeft een smeltpunt van 25-29 ° C dus het is handiger om vloeibare DMPO (dichtheid ~ 1,02 g / ml bij 25 ° C) pipetteer in een glazen flacon (Let op: geen plastic flesjes te gebruiken voor het wegen, omdat pure DMPO reageert met kunststof). Bevroren DMPO kan worden gesmolten door het uitvoeren van lauw water op de flacon (Let op: niet te warm water als DMPO kunnen ontleden). </li><li> Het is belangrijk om hoge zuiverheid DMPO (&gt; 99%) gebruikt, omdat sommige van in de handel verkrijgbare rotatie vallen bevatten paramagnetische onzuiverheden, en daarom is het noodzakelijk om EPR spectrum van alleen DMPO oplossing alleen (10 mM in dit geval) uitgevoerd. Het is essentieel dat geen achtergrond signaal duidelijk is (zie figuur 3A). </li><li> Bereid stock oplossing (1 mg / ml) forbol-12-myristaat-13-acetaat (PMA) in DMSO. Merk aliquots door verdunning van de oplossing tot 10 pg / ml in PBS. </li><li> In een 1.5 ml Eppendorf buis met een oplossing met een totaal volume van 0,6 ml door de volgorde van toevoeging: ~ 10 6 cellen per ml PMN, D-glucose (1 mg / ml) en albumine (1 mg / ml), 10 mM DMPO en 0,2 ug / ml PMA. (Opmerking: PMA de groep activator en moet worden toegevoegd laatste). </li><li> Breng de oplossing voor een EPR platte cellen. </li><li> EPR-acquisitie parameters voorwaarden zijn: magnetron frequentie: 9,8 GHz; middenveld: 3486 G; modulatie amplitude: 0,5 G; sweep breedte: 100 G; ontvanger winst: 5 x 10 5; totaal aantal scans: 10; Sweep tijd: 30 s , magnetron vermogen: 20 mW; en tijd constant: 81 ms. Voor kwantificering van adductvorming kunnen standaard plots concentratie versus signaalintensiteit (of gebied) worden geconstrueerd met de stal nitroxiden zoals TEMPO of 3-carbonzuur-PROXYL. </li></ol> * Belangrijk voor het gebruik van DMPO: Met een vlakke cel kan een verhoging van de celdichtheid waardoor het signaalintensiteit van de spin adduct maar de halfwaardetijd van O 2 • - adduct van DMPO kort (t1 / 2 ~ 1 min) die uiteenvalt DMPO-OH. DMPO kan worden gesubstitueerd met dezelfde concentraties Empo, BMPO of DEPMPO die commercieel beschikbaar voor meer adduct stabiliteit t1 / 2 tot 8 en 14 min. 4. Representatieve resultaten Spin trapping NO radicaal is uitgevoerd met Fe2 +-MGD. Figuur 2A en 2B tonen geen EPR signaal Fe2 +-MGD of mengsel van Fe2 +-MGD met CAI, aangeeft dat geen NO achtergrond signaal afkomstig uit deze reagentia. BAEC na stimulatie met CAI vrijstelt dat reageert met Fe2 +-MGD de spin adduct, NO-Fe2 +-MGD vormen en een karakteristiek toont trio signaal met constant hyperfijne splitsing (HFSC) waarde van N = 12,66 G en g-factor van g = 2,040. (Figuur 2C). De hfsc waarde werd bepaald met behulp van de WINSIM simulatie programma dat kan worden gedownload van NIEHS EPR Software Database website. De experimentele HFSC is met de literatuur waarde van N = 12,70 G en g = 2,041 18 NO-Fe2 +-MGD adduct. Evenzo is het resultaat van SIN-1 op BAEC verlaagd NO productie door eNOS ontkoppelen zoals in figuur 2D. DMPO spin-trap werd gebruikt voor O 2 • - detectie. DMPO alleen gaf geen signaal in de figuur 3A bevestigd dat de rotatie val vrij is van paramagnetisch verontreinigingen. Figuur 3B is het spectrum van DMPO en PMN alleen dezelfde en er is geen detecteerbaar signaal suggereert dat de DMPO veroorzaakt geen activering van het enzym NADPH oxidase. Figuur 3C toont het waargenomen EPR signaal na stimulatie van PMN door PMA. De HFSC waarden voor dit signaal werden bepaald als een N = 14,71 G, a &amp;beta;-H = 11,40 G en γ-H = 1,25 G, en stroken met de literatuur waarden van een N = 14,3 G, een β-H = 11,7 G en γ-H = 1,3 G 19 voor DMPO-O 2 H adduct. <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Stroomschema voor de detectie van radicalen neutrofielen en BAEC met EPR rotatie trapping. (A) werden gemengd met PMN DMPO en PMA en het verkregen mengsel overgebracht naar een EPR vlakke cel data acquisitie. (B) BAEC werden gekweekt op een bord, en gewassen met DPBS. De spin trap Fe (MGD) 2 werd toegevoegd, samen met Cai. De oplossing werd grondig gemengd en geïncubeerd. Het mengsel werd overgebracht naar een EPR vlakke cel EPR data acquisitie. <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. EPR detectie van NO uit BAEC. (A) Spectrum van Fe 2 +-MGD alleen (B) Spectrum van Fe 2 +-MGD + CAI alleen. (C) triplet spectrum gevolg van NO vangst van Fe2 +-MGD met CAI-gestimuleerde cellen. (D) Spectrum met afname NO productie door 0,5 mM SIN-1 behandeling van cellen. <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. EPR detectie van DMPO-O 2 H van geactiveerde neutrofielen. (A) Spectrum 10 mM DMPO alleen. (B) Spectrum van PMN alleen in de aanwezigheid van 10 mM DMPO. (C) Spectrum van PMN geactiveerd door PMA in aanwezigheid van 10 mM DMPO.

<ol><li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconciling+the+chemistry+and+biology+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 278-286 (2008).</li>
<li>Winterbourn, C. C., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol+chemistry+and+specificity+in+redox+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Thiol chemistry and specificity in redox signaling.</a> Free Radic. Biol. Med. 45, 549-561 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Oxygen%2C+Gene+Expression%2C+and+Cellular+Function%22">Oxygen, Gene Expression, and Cellular Function</a>. Clerch, L. B., Massaro, D. J. , (1997).</li>
<li>Gutteridge, J. M. C., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidants%3A+Molecules%2C+medicines%2C+and+myths%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Antioxidants: Molecules, medicines, and myths.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 393, 561-564 (2010).</li>
<li>Sumimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+regulation+and+evolution+of+Nox-family+NADPH+oxidases+that+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Structure, regulation and evolution of Nox-family NADPH oxidases that produce reactive oxygen species.</a> FEBS J. 275, 3249-3277 (2008).</li>
<li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIgnarro%2C+LJ+%22Editor+Nitric+Oxide%3A+Biology+and+Pathobiology%22">Editor Nitric Oxide: Biology and Pathobiology</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (2009).</li>
<li>Moreau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+alkyl-+and+arylguanidines+on+the+stability+and+reactivity+of+inducible+NOS+heme-dioxygen+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Differential effects of alkyl- and arylguanidines on the stability and reactivity of inducible NOS heme-dioxygen complexes.</a> Biochemistry. 45, 3988-3999 (2006).</li>
<li>Vasquez-Vivar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+generation+by+endothelial+nitric+oxide+synthase%3A+the+influence+of+cofactors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Superoxide generation by endothelial nitric oxide synthase: the influence of cofactors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 9220-9225 (1998).</li>
<li>Villamena, F. A., Zweier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+by+EPR+spin+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Detection of reactive oxygen and nitrogen species by EPR spin trapping.</a> Antioxid. Redox Signal. 6, 619-629 (2004).</li>
<li>Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+trapping+of+superoxide+and+hydroxyl+radical%3A+practical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Spin trapping of superoxide and hydroxyl radical: practical aspects.</a> Arch. Biochem. Biophys. 200, 1-16 (1980).</li>
<li>Frejaville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline+N-oxide+%28DEPMPO%29%3A+a+new+phosphorylated+nitrone+for+the+efficient+in+vitro+and+in+vivo+spin+trapping+of+oxygen-centered+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Soc.%2C+Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (DEPMPO): a new phosphorylated nitrone for the efficient in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals.</a> J. Chem. Soc., Chem. Commun. , 1793-1794 (1994).</li>
<li>Olive, G., Mercier, A., Le Moigne, F., Rockenbauer, A., Tordo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Ethoxycarbonyl-2-methyl-3%2C4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide%3A+Evaluation+of+the+spin+trapping+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">2-Ethoxycarbonyl-2-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide: Evaluation of the spin trapping properties.</a> Free Radical. Biol. Med. 28, 403-408 (2000).</li>
<li>Villamena, F. A., Zweier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+radical+trapping+and+spin+adduct+decay+of+5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline+N-oxide+%28BocMPO%29%3A+kinetics+and+theoretical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Soc.%2C+Perkin+Trans%22%5BJournal%5D)">Superoxide radical trapping and spin adduct decay of 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (BocMPO): kinetics and theoretical analysis.</a> J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1340-1344 (2002).</li>
<li>Tsuchiya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide-forming+reactions+of+the+water-soluble+nitric+oxide+spin-trapping+agent%2C+MGD%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide-forming reactions of the water-soluble nitric oxide spin-trapping agent, MGD.</a> Free Radical Biol. Med. 27, 347-355 (1999).</li>
<li>Vanin, A. F., Poltorakov, A. P., Mikoyan, V. D., Kubrina, L. N., van Faassen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+iron-dithiocarbamates+ensure+detection+of+nitric+oxide+in+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Why iron-dithiocarbamates ensure detection of nitric oxide in cells and tissues.</a> Nitric Oxide. 15, 295-311 (2006).</li>
<li>RojasWahl, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decomposition+mechanism+of+3-N-morpholinosydnonimine+%28SIN-1%29%3A+A+density+functional+study+on+intrinsic+structures+and+reactivities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Model%22%5BJournal%5D)">Decomposition mechanism of 3-N-morpholinosydnonimine (SIN-1): A density functional study on intrinsic structures and reactivities.</a> J. Mol. Model. 10, 121-129 (2004).</li>
<li>Klempner, M. S., Gallin, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+functional+characterization+of+human+neutrophil+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Separation and functional characterization of human neutrophil subpopulations.</a> Blood. 51, 659-669 (1978).</li>
<li>Pou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+trapping+of+nitric+oxide+by+ferro-chelates%3A+kinetic+and+in+vivo+pharmacokinetic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Spin trapping of nitric oxide by ferro-chelates: kinetic and in vivo pharmacokinetic studies.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1427, 216-226 (1999).</li>
<li>Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+trapping.+Kinetics+of+the+reaction+of+superoxide+and+hydroxyl+radicals+with+nitrones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Spin trapping. Kinetics of the reaction of superoxide and hydroxyl radicals with nitrones.</a> J. Am. Chem. Soc. 102, 4994-4999 (1980).</li>
<li>Britigan, B. E., Rosen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin-trapping+and+human+neutrophils.+Limits+of+detection+of+hydroxyl+radical%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Spin-trapping and human neutrophils. Limits of detection of hydroxyl radical.</a> J. Biol. Chem. 264, 12299-12302 (1989).</li>
<li>Frejaville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-%28Diethoxyphosphoryl%29-5-methyl-1-pyrroline+N-oxide%3A+A+new+efficient+phosphorylated+nitrone+for+the+in+vitro+and+in+vivo+spin+trapping+of+oxygen-centered+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A new efficient phosphorylated nitrone for the in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals.</a> J. Med. Chem. 38, 258-265 (1995).</li>
<li>Snyrychova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+sensitivity+of+EPR+spin+trapping+in+biological+systems+by+cyclodextrins%3A+A+model+study+with+thylakoids+and+photosystem+II+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Improvement of the sensitivity of EPR spin trapping in biological systems by cyclodextrins: A model study with thylakoids and photosystem II particles.</a> Free Radical Biol. Med. 48, 264-274 (2010).</li>
<li>Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipophilic+beta-cyclodextrin+cyclic-nitrone+conjugate%3A+Synthesis+and+spin+trapping+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipophilic beta-cyclodextrin cyclic-nitrone conjugate: Synthesis and spin trapping studies.</a> J. Org. Chem. 74, 5369-5380 (2009).</li>
<li>Han, Y., Tuccio, B., Lauricella, R., Villamena, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+spin+trapping+properties+by+beta-cyclodextrin-cyclic+nitrone+conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Improved spin trapping properties by beta-cyclodextrin-cyclic nitrone conjugate.</a> J. Org. Chem. 73, 7108-7117 (2008).</li>
<li>Hardy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+characterization%2C+and+decay+kinetics+of+ROS+and+thiyl+adducts+of+mito-DEPMPO+spin+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Detection, characterization, and decay kinetics of ROS and thiyl adducts of mito-DEPMPO spin trap.</a> Chem. Res. Toxicol. 20, 1053-1060 (2007).</li>
<li>Kim, S. -U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+reactivity+of+a+cyclic+nitrone-calix%5B4%5Dpyrrole+conjugate+with+superoxide+radical+anion%3A+Theoretical+and+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Fast reactivity of a cyclic nitrone-calix[4]pyrrole conjugate with superoxide radical anion: Theoretical and experimental studies.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 17157-17173 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

EPR spin-trapping is werkzaam in een breed scala van biomedische toepassingen voor het kwantificeren en het identificeren van vrije radicalen. Spin trapping zeer gevoelig voor het opsporen van radicalen bij concentraties variërend van nM tot uM waardoor het geschikt is voor toepassing in biologische systemen. De vorming van het paramagnetische adduct, NO-Fe2 +-MGD, is de basis van NO detectie via EPR. Fe 2 +-MGD reageert met NO snel 18 met een snelheid van ~ 10 6 M <s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Fenol vrij DMEM medium Hoge glucose-1X </td><td> GIBCO </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% trypsine-EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25200 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP379-100 </td><td></td></tr><tr><td> MEM Niet-essentiële aminozuren </td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td><td></td></tr><tr><td> Endotheliale groeifactor </td><td> Millipore </td><td> 02-102 </td><td></td></tr><tr><td> CAI </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> A-23187 </td><td> Los op in DMSO </td></tr><tr><td> SIN-1 </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> BML-CN245-0020 </td><td></td></tr><tr><td> DMPO </td><td> Dojindo Laboratories </td><td> D048-10 </td><td></td></tr><tr><td> FeSO 4 .7 H 2 O </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 215.422-250G </td><td> Los in PBS met Ca en Mg </td></tr><tr><td> MGD </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> ALX-400-014-M050 </td><td> Los in PBS met Ca2 + en Mg2 + </td></tr><tr><td> BAEC cellen </td><td> Cell Systems </td><td> 2B2-C75 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP231-100 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS met CaCl2 en MgCl2 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> Forbol-myristaat acetaat (PMA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 79346-1 mg </td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van stikstofoxide en superoxide radicaal anion door electron paramagnetische resonantie spectroscopie van cellen met behulp van spin traps

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactief stikstof / oxygen species (ROS / RNS) bij lage concentraties spelen een belangrijke rol in het reguleren van cel-functie, signalering, en immuunrespons, maar in niet-gereguleerde concentraties schadelijk zijn voor de levensvatbaarheid van de cellen 1, 2. Terwijl levende systemen hebben zich ontwikkeld met endogene en voedingssupplementen antioxidant verdedigingsmechanismen om ROS generatie te reguleren, worden ROS continu geproduceerd als natuurlijke bijproducten van de normale stofwisseling van zuurstof en kan oxidatieve schade aan biomoleculen wat resulteert in verlies van de functies van eiwitten, DNA-splitsing, of lipide veroorzaken peroxidatie 3, en uiteindelijk tot oxidatieve stress leidt tot cel letsel of de dood 4. Superoxide radicaal-anion (O 2 • -) is de belangrijkste voorloper van enkele van de meest oxiderende soorten bekend zijn in biologische systemen zoals peroxynitriet en hydroxyl radicalen. De generatie van O 2 • - signaleert de eerste tekenen van oxidatieve burst, en daarom, its detectie en / of opslag in biologische systemen is belangrijk. In deze demonstratie, O 2 • - werd gegenereerd op basis van polymorfonucleaire neutrofielen (PMN). Door chemotactische stimulatie met forbol-12-myristaat-13-acetaat (PMA) PMN genereert O 2 • - activering van nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (NADPH) oxidase 5. Stikstofoxide (NO) synthase die wordt geleverd in drie isovormen, zoals induceerbare-, neuronale-en endotheel-NOS, of iNOS, nNOS of eNOS, respectievelijk, katalyseert de omzetting van L-arginine tot L-citrulline, met behulp van NADPH op NO 6 te produceren . Hier wordt gegenereerd NO uit endotheelcellen. Onder oxidatieve stress, kan eNOS bijvoorbeeld schakelen van de productie van NO tot O 2 • - in een proces dat ontkoppeling, waarvan wordt aangenomen veroorzaakt wordt door oxidatie van heem 7 of co-factor, tetrahydrobiopterinedeficiëntie (BH 4) 8. Er zijn weinigbetrouwbare werkwijzen voor de detectie van vrije radicalen in biologische systemen, maar beperkt door de specificiteit en gevoeligheid. Spin trapping wordt gebruikt voor de identificatie van vrije radicalen en omvat de additiereactie van een groep een spin trap die een aanhoudende rotatie adduct dat gedetecteerd kan worden met elektronen paramagnetische (EPR) spectroscopie. De verschillende radicale adducten vertonen opvallende spectrum dat kan worden gebruikt om de radicalen worden gegenereerd identificeren en kan een schat aan informatie over de aard en de kinetiek van de radicale productie 9 geven. De cyclische nitronen, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO 10 de fosforylchloride gesubstitueerde DEPMPO 11 en de ester gesubstitueerde, Empo 12 en BMPO 13 zijn alom gebruikt als rotatie vallen - deze rotatie vallen vertonen langere halfwaardetijden voor O 2 • - adduct. IJzer (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamaat, Fe (MGD) 2 &lt;/ Sub&gt; wordt vaak gebruikt om NO te wijten aan hoge mate van adduct vorming en de hoge stabiliteit van de spin adduct 14 te vangen.

Elektronen paramagnetische resonantie (EPR) spectroscopie werd gebruikt om stikstofoxide te detecteren van runderen aorta endotheelcellen en superoxide radicaal anion van menselijke neutrofielen met behulp van ijzer (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamaat, Fe (MGD)<sub&gt; 2</sub&gt; En 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO respectievelijk.

Detectie van stikstofoxide en superoxide radicaal anion door Electron Paramagnetische Resonantie Spectroscopie van cellen met behulp van Spin Traps

Reactieve stikstof- en zuurstofverbindingen (RNS/ROS) spelen bij lage concentraties een belangrijke rol bij het reguleren van de celfunctie, signalering en immuunrespons, maar bij ...

Ik ben Frederick Dina, associate professor farmacologie hier aan de Ohio State University. In deze demonstratie laten we de detectie van stikstofmonoxide en superoxide uit cellen zien met behulp van EPR-spin trapping.Reactieve zuurstof- en stikstofverbindingen zijn betrokken bij de ontwikkeling van diverse ziekten, waardoor hun detectie in biologische systemen van cruciaal belang is. Slechts enkele betrouwbare methoden voor de detectie van reactieve verbindingen zijn toegepast in biologische systemen, maar deze worden beperkt door hun specificiteit en gevoeligheid. Spin-trapping wordt echter veelvuldig gebruikt voor de identificatie van reactieve zuurstofverbindingen en omvat de additiereactie van een radicaal aan een nitro-spinval of metaalcomplexen die een persistent spin-adduct vormen, welke gedetecteerd kunnen worden via elektronenspinresonantie-spectroscopie of EPR; de verschillende radicaal-adducten vertonen een kenmerkend spectrum dat kan worden gebruikt om de gegenereerde radicalen te identificeren en dat een schat aan informatie kan verschaft over de aard en kinetiek van de radicaalproductie.Stikstofmonoxide-synthase katalyseert de omzetting van L-arginine naar L-citrullin

detection-nitric-oxide-superoxide-radical-anion-electron-paramagnetic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft een methode voor micronschaal drie-dimensionale beeldvorming van zuurstofconcentratie in de directe omgeving van levende cellen door electron spin resonantie microscopie.

Electron Spin Resonantie Micro-imaging van Live Species voor zuurstof in kaart brengen

Spin-trapping ESR spectroscopie werd gebruikt om het effect van plantaardige antioxidanten lycopeen, pycnogenol en druivenpittenextract op wegvangen van gas-fase vrije radicalen in sigarettenrook te bestuderen.

Een protocol voor het opsporen en opruiming Gas-fase vrije radicalen in Mainstream Cigarette Smoke

De endogene productie van stikstofoxide (NO) regelt diverse biologische functies. Het wordt steeds duidelijker dat verstoring of ontregeling van NO op basis van signalering is betrokken bij vele ziekten bij de mens. Methoden voor het kwantificeren van relevante NO metabolieten kunnen nieuwe diagnostische of prognostische biomarkers voor ziekte bij de mens.

Analytische technieken voor het testen van stikstofoxide biologische activiteit

In dit artikel beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige manier aangepast met de fluorescentie kleurstof diaminofluorescein 2-diacetaat (DAF-2DA) en dihydroethidium (DHE) voor en face gelijktijdige detectie en visualisatie van intracellulaire stikstofoxide (NO) en superoxide anion (O 2 .- ) respectievelijk in vers geïsoleerde intacte aorta's van een obesitas muismodel.

En Face Detection van stikstofoxide en superoxide in endotheellaag van Intact slagaders

Een methode nieuwe elektronen paramagnetische resonantie (EPR), een snelle scan EPR (RS-EPR), is aangetoond voor 2D spectrale ruimtelijke beeldvorming die superieur is aan de traditionele continue golf (CW) techniek en opent nieuwe locaties voor in vivo beeldvorming. Resultaten worden gedemonstreerd op 250 MHz, maar de techniek is toepasbaar bij een bepaalde frequentie.

Rapid Scan Electron Paramagnetische Resonantie opent nieuwe wegen voor Imaging Fysiologisch belangrijke parameters<em&gt; In Vivo</em

Elektron paramagnetisch resonantie (EPR) spectroscopie is een eenduidige methode voor het meten van vrije radicalen. Het gebruik van selectieve spin sondes zorgt voor detectie van vrije radicalen in andere cellulaire compartimenten. Presenteren we een praktische, efficiënte methode voor het verzamelen van biologische monsters die behandeling, opslaan en overzetten van monsters voor EPR metingen te vergemakkelijken.

Gebruik van Electron paramagnetisch resonantie in biologische monsters bij kamertemperatuur en 77 K

Dit protocol beschrijft de opstelling van een NMR-bioreactor om ingekapselde menselijke cellen tot 72 uur levensvatbaar te houden, gevolgd door tijd-opgeloste in-cell NMR-gegevensverzameling en -analyse. De methodologie wordt toegepast om intracellulaire eiwit-ligand interacties in real time te monitoren.

Monitoring van eiwit-ligandinteracties in menselijke cellen door real-time kwantitatieve in-cell NMR met behulp van een bioreactor met hoge celdichtheid

Hier presenteren we protocollen voor het detecteren van stikstofmonoxide en zijn biologisch relevante derivaten met behulp van op chemiluminescentie gebaseerde assays met een hoge gevoeligheid.

Chemiluminescentie-gebaseerde assays voor de detectie van stikstofmonoxide en zijn derivaten van autoxidatie en nitrosated compounds

Hier stellen we een gesystematiseerd, toegankelijk en reproduceerbaar protocol voor om cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te detecteren met behulp van 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA) in Müller gliacellen (MGC's). Deze methode kwantificeert de totale cellulaire ROS-niveaus met een flowcytometer. Dit protocol is zeer eenvoudig te gebruiken, geschikt en reproduceerbaar.

Kwantificering van reactieve zuurstofsoorten met behulp van 2′,7′-dichlorofluoresceïnediacetaatsonde en flowcytometrie in Müller-gliacellen

De vorming van superoxide-anionen is essentieel voor de stimulatie van bloedplaatjes en, indien ontregeld, van cruciaal belang voor trombotische aandoeningen. Hier presenteren we drie protocollen voor de selectieve detectie van superoxide-anionen en de studie van redox-afhankelijke bloedplaatjesregulatie.

Alternatieve methoden voor de detectie van superoxide-anionvorming in bloedplaatjes 

Leer de detectie van stikstofoxide en superoxide radicalen in cellen met behulp van EPR-spectroscopie en spin trapping. Deze methode biedt inzicht in reactieve soorten betrokken bij ziekteontwikkeling.

Detectie van stikstofoxide en superoxide radicaal anion door Electron Paramagnetische Resonantie Spectroscopie van cellen met behulp van Spin Traps (Video) | JoVE Journal

Detectie van stikstofoxide en superoxide radicaal anion door Electron Paramagnetische Resonantie Spectroscopie van cellen met behulp van Spin Traps

Meer video's verkennen