Detectie van stikstofoxide en superoxide radicaal anion door Electron Paramagnetische Resonantie Spectroscopie van cellen met behulp van Spin Traps

Ik ben Frederick Dina, universitair hoofddocent farmacologie hier aan de Ohio State University. In deze demonstratie laten we de detectie van stikstofoxide en superoxide uit cellen zien met behulp van EPR-spin trapping.

Reactieve zuurstof- en stikstofverbindingen zijn betrokken bij de ontwikkeling van diverse ziekten, waardoor hun detectie in biologische systemen van cruciaal belang is. Er zijn slechts enkele betrouwbare methoden voor de detectie van reactieve verbindingen in biologische systemen toegepast, maar deze zijn beperkt wat betreft specificiteit en gevoeligheid. Spin trapping wordt echter veelvuldig gebruikt voor de identificatie van ROS en omvat de additiereactie van een radicaal aan een nitro-spin trap of metaalcomplexen, waarbij een persistent spin-adduct wordt gevormd. Dit adduct kan worden gedetecteerd met elektronenspinresonantie-spectroscopie of EPR. De verschillende radicaal-adducten vertonen een kenmerkend spectrum dat kan worden gebruikt om de gegenereerde radicalen te identificeren en dat een schat aan informatie kan verschaffen over de aard en kinetiek van de radicaalproductie.

Stikstofoxidesynthase katalyseert de omzetting van L-arginine naar L-citrulline met behulp van N-A-D-P-H om stikstofoxide te produceren. Onder omstandigheden van oxidatieve stress kan eNOS overschakelen van de productie van stikstofoxide naar superoxide in een proces dat ontkoppeling wordt genoemd, wat vermoedelijk wordt veroorzaakt door oxidatie van heem of de cofactor die betrokken is bij de productie van stikstofoxide. Regulatie van stikstofoxide in biologische systemen is belangrijk, aangezien het een cruciale rol speelt in celcommunicatie, wat leidt tot gunstige fysiologische functies zoals vasodilatatie, maar overproductie ervan is vaak geassocieerd met ontstekingscondities. Daarom is de detectie van stikstofoxide in biologische systemen van groot belang.

Een andere belangrijke klasse signaleringsmoleculen in biologische systemen zijn reactieve zuurstofspecies zoals stikstofmonoxide; reactieve zuurstofspecies in lage concentraties spelen een belangrijke rol bij de regulatie van de celfunctie, signalering en immuunrespons, maar kunnen in ongereguleerde concentraties leiden tot cellulaire oxidatieve schade, wat resulteert in oxidatieve stress. Het superoxide-radicaalanion is een van de belangrijkste reactieve zuurstofspecies en is de belangrijkste precursor van enkele van de meest sterk oxiderende species die bekend zijn in biologische systemen, zoals superoxide-nitriet en het hydroxylradicaal. De detectie en/of sequestratie van superoxide in biologische systemen is daarom van belang, aangezien de generatie ervan het eerste teken is van een oxidatieve burst voorafgaand aan de start.

Dit protocol beschrijft het trypsiniseren van gecultiveerde endothelcellen uit de aorta van runderen zoals beschreven in de geschreven procedure. Breng de cellen over naar een gelabelde zeswellplaat en incubeer deze na incubatie gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO2.

Haal de zeswellsplaat uit de incubator en aspireer het medium uit de eerste well. Was de cellen tweemaal met 1 mL deltac phosphate buffered saline of DPBS. Bereid een 1,9 mM ijzersulfaat-heptahydraatoplossing door 0,8 mg ijzersulfaat toe te voegen aan 1 mL DPBS met calciumchloride en magnesiumchloride.

Bereid de MGD-oplossing door 2,7 mg ammonium-MGD toe te voegen aan 500 µL DPBS met calciumchloride en magnesiumchloride. Voeg 210 µL vers bereide 1,9 mM ijzersulfaat-heptahydraat en 210 µL vers bereid MGD toe, gebruikmakend van een molaire ratio van één op zeven, en meng de resulterende suspensie. Voeg 4,6 µL calciumion-four toe en meng de oplossing opnieuw door herhaaldelijk te pipetteren.

Incubeer het monster vervolgens 36 minuten bij 37 °C. Verzamel het supernatant dat bezinkt in een eppendorfbuisje. Voer de EPR-acquisitieparameters in: een centrumveld van 3427 gauss, een modulatieamplitude van 6 gauss en een frequentie van 9,8 GHz.

Aangezien parameters variëren per instrument en experimentele condities, raadpleegt u de tekst voor overige parameters die bij deze apparatuur worden gebruikt. Breng het supernatant over naar een EPR-vlakke cel, sluit deze af met paraffine en plaats de cel in de EPR-caviteit. Registreer de spectra gedurende ongeveer 21 minuten met 121 scans en 10,4 seconden per scan nadat het experiment is gestart.

Gebruik de brucker WIN EPR-verwerking om de basislijn te corrigeren en de 2D-spectra te integreren, wat de achtergrondruis vermindert. Er moet worden opgemerkt dat de scantijd en het aantal scans per experiment kunnen variëren. Daarnaast kunnen de methoden voor basislijncorrectie per softwarepakket verschillen.

Om de ontkoppeling van Enos te starten, verwijdert u het medium uit de tweede put van de zes-puttsplaat en wast u de cellen twee keer met 1 mL DPBS. Voeg vervolgens 100 µL van de bereide 0,5 mM Syn one-oplossing toe en vul het volume aan tot 2 mL met DPBS bevattende 10% FBS. Incubeer de cellen gedurende twee uur bij 37 °C en 5% CO2. Na incubatie.

Was de cellen twee keer met DPBS. Voeg vervolgens 210 µL vers bereide, 2.8 mM ijzersulfaatheptahydraat en 210 µL 19.6 mM MGD toe, vers bereid volgens de voorgaande procedure. Voeg daarna 4.6 µL 1.9 mM calciumion vier toe en meng de oplossing opnieuw.

Incubeer de cellen, zoals voorheen, gedurende 36 minuten bij 37 °C. Verzamel na 36 minuten het supernatant dat zich in een eppendorfbuisje heeft afgezet en breng dit over naar een EPR-flat cell. Registreer de EPR-spectra met dezelfde acquisitieparameters als voorheen na de acquisitie.

Verwerk de gegevens op dezelfde manier voorafgaand aan de start van dit protocol. Bereid een stokoplossing van 1 M DMPO en PBS met 0,1 mM DTPA. Maak vervolgens een oplossing van 1 mg/mL van vier bij 12.

Maak aliquoten van 1 ml van de PMA-stockoplossing door Myristaat 13-acetaat of PMA in DMSO te verdunnen tot 10 µg/ml in PBS in een Eppendorfbuisje met 1 mg/ml D-glucose en 1 mg/ml albumine. Maak een suspensie van 5 tot 6 miljoen PMN-cellen per ml door herhaaldelijk te pipetteren in een 1,5 ml Eppendorfbuisje. Bereid een mengsel met een eindvolume van 60 µL dat ongeveer 1,6 × 10⁶ PMN-cellen, 10 mM DMPO en 0,2 µg/ml PMA bevat.

In dit experiment gebruiken we een Bruker ESP 300 X-band spectrometer. Overbreng de oplossing naar een EPR-flatcell en plaats de flatcell vervolgens in de EPR-caviteit. Voer de EPR-acquisitieparameters in: een centrumveld van 3,486 goss, een modulatieamplitude van 0,5 goss en een frequentie van 9,8 gigahertz.

Aangezien de parameters per instrument en per experimentele conditie zullen variëren, raadpleegt u de tekst voor de overige parameters die in dit experiment zijn gebruikt voor het verkrijgen van spectra. In deze demonstratie tonen we de detectie van stikstofmonoxide en SU-peroxideradicalen met behulp van twee verschillende spin-traps: ijzer-MGD en DNPO.

We tonen aan dat stimulatie van endotheelcellen met calciumion vier stikstofoxide produceert en de behandeling met seen één. Een perine nitrietdonor kan de productie van stikstofoxide verminderen, echter geeft stimulatie van neutrofielen met PMA in aanwezigheid van een nitro spin-trap een hydroxylradicaal ADDA in plaats van de S-oxide, vanwege de instabiliteit van het initieel gevormde superoxide adda. Hoewel de mechanismen van spin-trapping door ijzer mg d nitros fundamenteel hetzelfde zijn, houdt de toevoeging van stikstofoxide aan ijzer MGD een snelle reactiesnelheid in en is de ijzer MGD stikstofoxide add-vorm zeer stabiel.

In feite kan de oplossing bij -80 °C worden ingevroren voor latere acquisitie van het EPR-spectrum zonder dat de intensiteit van het EPR-signaal significant afneemt. Aan de andere kant is de detectie van oxide met behulp van de nitro spin trap traag. Dit vereist hogere concentraties van de spin trap in vergelijking met de tegenhanger ijzer MGD four voor de detectie van stikstofmonoxide.

Er zijn verschillende benaderingen toegepast om de superoxide-adductvorm succesvol te detecteren, wat we in deze video niet verder hebben aangetoond. Het gebruik van platte cellen kan bijvoorbeeld zorgen voor een betere signaalintensiteit van het superoxide-adduct vanwege de hogere celdichtheid. Ik raad u aan om voor meer informatie over dit onderwerp de tekst te raadplegen.

Daarnaast kan men, in plaats van DMPO, een gecertificeerde spin-trap gebruiken zoals BMPO en VMP of het gefosforyleerde Nitro DAP MPO, wat kan leiden tot meer persistente SU-peroxide-adducten. Het gebruik van cyclodextrine is ook toegepast om SU-peroxide-adducten te stabiliseren bij het gebruik van spin-trapping voor US-detectie. Het onmiddellijk verkrijgen van het EP-spectrum na de generatie van SU-superoxide wordt sterk aanbevolen.

Daarom is de detectie van stikstofmonoxide met behulp van ijzer-MGD veel efficiënter, en de grootste uitdaging waar men nu bij het EPR-spin trapping van superoxide voor staat, is het bereiken van de kenmerken die zijn waargenomen bij de vorming van het ijzer-MGD stikstofmonoxide-adduct. Dat wil zeggen: een snelle reactiviteit met superoxide en stabiele adducten. Inspanningen voor de ontwikkeling van spin traps met een snelle reactiviteit voor superoxide en de vorming van stabiele spin-adducten worden momenteel in ons laboratorium en door andere groepen uitgevoerd.