Detectie van stikstofoxide en superoxide radicaal anion door Electron Paramagnetische Resonantie Spectroscopie van cellen met behulp van Spin Traps

Ik ben Frederick Dina, associate professor farmacologie hier aan de Ohio State University. In deze demonstratie laten we de detectie van stikstofmonoxide en superoxide uit cellen zien met behulp van EPR-spin trapping.

Reactieve zuurstof- en stikstofverbindingen zijn betrokken bij de ontwikkeling van diverse ziekten, waardoor hun detectie in biologische systemen van cruciaal belang is. Slechts enkele betrouwbare methoden voor de detectie van reactieve verbindingen zijn toegepast in biologische systemen, maar deze worden beperkt door hun specificiteit en gevoeligheid. Spin-trapping wordt echter veelvuldig gebruikt voor de identificatie van reactieve zuurstofverbindingen en omvat de additiereactie van een radicaal aan een nitro-spinval of metaalcomplexen die een persistent spin-adduct vormen, welke gedetecteerd kunnen worden via elektronenspinresonantie-spectroscopie of EPR; de verschillende radicaal-adducten vertonen een kenmerkend spectrum dat kan worden gebruikt om de gegenereerde radicalen te identificeren en dat een schat aan informatie kan verschaft over de aard en kinetiek van de radicaalproductie.

Stikstofmonoxide-synthase katalyseert de omzetting van L-arginine naar L-citrulline met behulp van N-A-D-P-H om stikstofmonoxide te produceren. Onder omstandigheden van oxidatieve stress kan eNOS overschakelen van de productie van stikstofmonoxide naar superoxide in een proces genaamd ontkoppeling, waarvan wordt aangenomen dat het wordt veroorzaakt door oxidatie van heem of de cofactor die betrokken is bij de regulatie van stikstofmonoxide. De regulatie van stikstofmonoxide in biologische systemen is belangrijk, aangezien het een kritische rol speelt in cel-signalering, wat leidt tot gunstige fysiologische functies zoals vaatverwijding, maar de overproductie ervan wordt vaak geassocieerd met ontstekingstoestanden. Daarom is de detectie van stikstofmonoxide in biologische systemen van groot belang.

Een andere belangrijke klasse signaleringsmoleculen in biologische systemen zijn reactieve zuurstofverbindingen zoals stikstofoxide; reactieve zuurstofverbindingen in lage concentraties spelen een belangrijke rol bij de regulering van de cel functie, signalering en immuunrespons, maar bij ongereguleerde concentraties kunnen ze leiden tot cellulaire oxidatieve schade, wat resulteert in oxidatieve stress. Het superoxide-radicaal anion is een van de belangrijkste reactieve zuurstofverbindingen en is de belangrijkste precursor van enkele van de sterkst oxiderende verbindingen die in biologische systemen voorkomen, zoals superoxide-nitriet en het hydroxylradicaal. De detectie en/of sequestratie van superoxide in biologische systemen is daarom van belang, aangezien de generatie hiervan het eerste teken is van een oxidatieve burst voorafgaand aan de start.

Dit protocol beschrijft het trypsiniseren van gekweekte endotheliale cellen van de runder aorta zoals beschreven in de schriftelijke procedure. Breng de cellen over naar een gelabelde zeswellenplaat en incubeer deze na incubatie een nacht bij 37 °C en 5% CO2.

Haal de zeswellplaat uit de incubator en aspireer het medium uit de eerste well. Was de cellen tweemaal met één milliliter fosfaatgebufferde zoutoplossing of DPBS. Bereid een 1,9 millimolaire ijzersulfaat-heptahydraatoplossing door 0,8 milligram ijzersulfaat toe te voegen aan één milliliter DPBS met calciumchloride en magnesiumchloride.

Bereid vervolgens de MGD-oplossing door 2,7 milligram ammonium-MGD toe te voegen aan 500 µL DPBS met calciumchloride en magnesiumchloride. Voeg 210 µL vers bereide 1,9 millimolaire ijzersulfaat-heptahydraat toe, en 210 µL vers bereid MGD met een molaire ratio van één op zeven, en meng de resulterende suspensie. Voeg 4,6 µL calciumion 4 toe en meng de oplossing opnieuw door herhaaldelijk met de pipet op en neer te zuigen.

Incubeer het monster vervolgens 36 minuten bij 37 °C. Verzamel het supernatant dat bezinkt in een Eppendorf-buisje. Voer de EPR-acquisitieparameters in: een centrumveld van 34,27 G, een modulatieamplitude van 6 G en een frequentie van 9,8 GHz.

Aangezien parameters per instrument en experimentele condities kunnen variëren, raadpleegt u de tekst voor andere parameters die bij deze apparatuur zijn gebruikt. Draag de supernatant over naar een EPR-vlakke cel, sluit deze af met paraffine en plaats deze in de EPR-caviteit. Registreer de spectra gedurende ongeveer 21 minuten met 121 scans en 10,4 seconden per scan nadat het experiment is uitgevoerd.

Gebruik de brucker WIN EPR-verwerking om de basislijn te corrigeren en de 2D-spectra te integreren, waardoor de achtergrondruis wordt verminderd. Er moet rekening mee worden gehouden dat de scantijd en het aantal scans kunnen variëren van het ene experiment naar het andere. Ook de methoden voor het corrigeren van de basislijn kunnen per software verschillen.

Om de Enos-ontkoppeling te starten, verwijdert u het medium uit de tweede put van de zesputtsplaat en wast u de cellen twee keer met 1 mL DPBS. Voeg vervolgens 100 µL van de bereide 0,5 mM Syn one-oplossing toe en vul het volume aan tot 2 mL met DPBS bevattend 10% FBS. Incubeer de cellen gedurende twee uur bij 37 °C en 5% CO2; na incubatie.

Was de cellen tweemaal met DPBS. Voeg vervolgens 210 µL vers bereid 2,8 mM ijzersulfaat-heptahydraat en 210 µL 19,6 mM MGD toe, vers bereid volgens de voorgaande procedure. Voeg daarna 4,6 µL 1,9 mM calciumion four toe en meng de oplossing opnieuw.

Incubeer de cellen opnieuw gedurende 36 minuten bij 37 °C. Verzamel na 36 minuten het supernatant dat zich in een eppendorfbuisje bevindt en breng dit over naar een EPR-vlakke cel. Registreer de EPR-spectra met dezelfde acquisitieparameters als hiervoor tijdens de acquisitie.

Verwerk de gegevens op dezelfde wijze voorafgaand aan de start van dit protocol. Bereid een voorraadoplossing van één molar DMPO en PBS met 0,1 millimolair DTPA. Maak vervolgens een oplossing van één milligram per milliliter van four by 12.

Maak aliquots van één milliliter van de PMA-stockoplossing door Myra State 13 acetaat of PMA in DMSO te verdunnen tot 10 µg/mL in PBS in een Eppendorf-buisje met 1 mg/mL D-glucose en 1 mg/mL albumine. Maak vijf tot 6 miljoen PMN-cellen per milliliter door deze in een 1,5 mL Eppendorf-buisje herhaaldelijk op en neer te pipetteren. Bereid een mengsel met een eindvolume van 60 µL dat ongeveer 1,6 × 10⁶ PMN-cellen, 10 mM DMPO en 0,2 µg/mL PMA bevat.

In dit experiment maken we gebruik van een Bruker ESP 300 X-band spectrometer. Overbreng de oplossing naar een EPR-flat cell en plaats deze vervolgens in de EPR-caviteit. Voer de EPR-acquisitieparameters in: een centraal veld van 3,486 goss, een modulatieamplitude van 0,5 goss en een frequentie van 9,8 gigahertz.

Aangezien parameters per instrument en per experimentele conditie kunnen variëren, raadpleegt u de tekst voor de overige parameters die in dit experiment zijn gebruikt voor het verkrijgen van spectra. In deze demonstratie tonen we de detectie van stikstofmonoxide en SU-peroxideradicalen met behulp van twee verschillende spin-traps: ijzer-MGD en DNPO.

Wij tonen aan dat stimulatie van endotheelcellen met calciumionofoor 4 stikstofoxide produceert en dat behandeling met spin trap 1, een perinitrietdonor, de productie van stikstofoxide kan verminderen; een stimulatie van neutrofielen met PMA in aanwezigheid van een nitro-spin trap geeft echter een hydroxylradicaal-adduct in plaats van het S-oxide, vanwege de instabiliteit van het aanvankelijk gevormde superoxide-adduct. Hoewel de mechanismen van spin-trapping door Fe-MGD-nitrosen fundamenteel hetzelfde zijn, omvat de additie van stikstofoxide aan Fe-MGD een snellere reactiesnelheid en is de Fe-MGD-stikstofoxide-adductvorm zeer stabiel.

In feite kan de oplossing bij min 80 graden Celsius worden ingevroren voor latere acquisitie van het EPR-spectrum, zonder dat de intensiteit van het EPR-signaal significant afneemt. Aan de andere kant is de detectie van oxide met behulp van de nitro spin-trap traag. Dit vereist hogere concentraties van de spin-trap in vergelijking met de tegenhanger iron MGD vier voor de detectie van stikstofoxide.

Verschillende benaderingen zijn aangewend om de superoxide-adductvorm succesvol te detecteren, wat we in deze video niet meer hebben gedemonstreerd. Het gebruik van een vlakke cel kan bijvoorbeeld een betere signaalintensiteit van het superoxide-adduct geven vanwege een hogere celdichtheid. Ik raad u aan om voor meer informatie over dit onderwerp de tekst te raadplegen.

Daarnaast kan men, in plaats van DMPO, een gecertificeerde spin-trap gebruiken zoals BMPO en VMP of de gefosforyleerde Nitro DAP MPO, die stabielere SU peroxide-adducten kunnen opleveren. Het gebruik van cyclodextrine is ook toegepast om SU peroxide-adducten te stabiliseren bij het gebruik van spin-trapping voor US-detectie. Onmiddellijke acquisitie van het EP-spectrum na SU superoxide-generatie wordt sterk aanbevolen.

Daarom is de detectie van stikstofmonoxide met behulp van ijzer-MGD veel efficiënter, en de belangrijkste uitdaging die nu bij PR-spinvanging van superoxide komt kijken, is het bereiken van de kenmerken die zijn waargenomen bij de vorming van het ijzer-MGD-stikstofmonoxide-adduct. Dat wil zeggen: een snelle reactiviteit met superoxide en stabiele adducten. Inspanningen voor de ontwikkeling van spinvangers met een snelle reactiviteit voor superoxide en de vorming van stabiele spinadducten worden momenteel in ons laboratorium en door andere groepen uitgevoerd.