Kwantificering van eiwitten met behulp van immuno-peptide Verrijking gekoppeld aan massaspectrometrie

Het algemene doel van de volgende procedure is om peptiden in een complex mengsel te isoleren en te kwantificeren die fungeren als surrogaat voor hun respectieve eiwitten. Eerst worden grote eiwitten binnen het mengsel verteerd tot componentpeptiden met behulp van een enzym zoals trypsine. Vervolgens worden de gerichte peptide-analyten en een gestabiliseerd stabiel isotoop gelabelde interne standaard verrijkt met behulp van antip-peptide-antilichamen, geïmmobiliseerd op door protein G gecodeerde magnetische deeltjes na isolatie.

De gerichte peptiden worden van de magnetische deeltjes afgeleid en geanalyseerd door massaspectrometrie voor kwantificering ten opzichte van de interne standaard. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals traditionele immunoassays zijn dat het sneller en kosteneffectiever is bij het bouwen van grote aantallen assays. Het heeft een hoge slagingsgraad en het is gemakkelijk gemultiplext, wat aantoont dat de procedure zal worden uiteengezet.

Een technicus in het laboratorium heeft een 10 microliter plasma Eloqua op nat ijs. Breng het monster over naar een 1000 microliter diepe putplaat en bedek met papierachtige film om de eiwitten te denatureren op 20 microliters verse negen molaire ureum 30 millimolair DTT voor elk monster en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius, voeg drie microliters verse 500 millimolair I oto acetamide toe aan elk monster en incubeer gedurende 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Verdun nu de ureum tot 0,6 molair met 100 millimolair tris pH acht en voeg 10 microliters van een microgram per microliter trypsine-voorraadoplossing toe voor een enzym-tot-substraatverhouding van één tot 50.

Na incubatie van de reactie bij 37 graden Celsius gedurende de nacht bij drie microliters pure formidinezuur tot een uiteindelijke concentratie van 1% ga je door met het toevoegen van de stabiele isotoopstandaard of meerdere standaarden. Als u een multiplex-assay uitvoert, was de Oasis-cartridgeplaatput met 500 microliters 0,1% formijnzuur in 80% ACE nitril en gooi de doorstroming weg. Egaliseer vervolgens de cartridgeplaat door 500 microliters 0,1% formijnzuur in water toe te voegen en gooi de doorstroming weg.

Laad de verteringsmonsters op de cartridgeplaat en pas de vacuüm aan zodat de stroom erg langzaam is. Was drie keer met 500 microliters 0,1% formijnzuur in water en gooi de doorstroming weg. Elueer de peptiden twee keer met 500 microliters 0,1% formijnzuur in 80% aceto trial en lyofiliseer of snel het eluaat tot droogheid en reconstrueer de gedroogde peptiden in 50 microliters PBS plus 0,03% Chaps. Breng de monsters over naar een standaard Kingfisher 96-putplaat, voeg een microgram antilichaam en 1,5 microliters protein G gecodeerde magnetische kralen per doel toe. Vorm de kralen voorafgaand aan toevoeging.

Om ervoor te zorgen dat de kralen goed gesuspendeerd zijn. Bedek de plaat met folie en incubeer overnacht met zacht draaien centrifugeren. De plaat bij 400 RPM gedurende 10 seconden om eventuele vloeistof van het folieoppervlak te verwijderen.

Verwijder de folieafdekking. Bemonstering vindt plaats op een geautomatiseerd Kingfisher-platform op het Kingfisher-platform. Was de kralen twee keer met 200 microliters PBS plus 0,03% chaps en eenmaal met 200 microliters van een een op tien verdunning van PBS plus 0,03% Chaps, elueer nu de peptiden met 25 microliters 5% azijnzuur plus 0,03% chaps.

Plaats de elutieplaat op een magneet en breng het eluaat over naar een 96-putplaat, zorg ervoor dat u de overgebleven kralen niet overbrengt. Bedek de plaat met de plafondmat en breng deze plaat met het eluaat naar de triple, quadruple massaspectrometer voor analyse. De MRM-methode wordt geconstrueerd door een tandemmassaspectrum van het peptide van belang te verkrijgen en vervolgens de beste transitiefragment-ionen te kiezen en te optimaliseren.

Typisch gebruikt een configuratie voor MRM-analyse een C 18-val en analytische kolommen met twee mobiele fasen. Laad 10 microliters van het monster en elueer door een lineaire gradiënt. Integreer piekgebieden voor de lichte en zware peptiden en bereken de piekgebiedsverhouding van ongelabeld naar gelabeld peptide in elk monster.

De lichte en zware peptiden elueren op hetzelfde moment en meerdere overgangen kunnen voor elk peptide worden gemonitord. Om de identiteit te bevestigen, wordt het piekgebied van het endogene peptide gemeten ten opzichte van het gebied van de interne standaard om een kwantitatief maatstaf van het doelpeptide te bieden. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u deze techniek in uw laboratorium kunt implementeren. Het kan worden gebruikt om elk eiwit van belang te kwantificeren, waardoor het geschikt is voor een breed scala aan toepassingen in biologisch onderzoek.