Name: Lentivirale-gemedieerde Knockdown Tijdens het Ex Vivo Erytropoëse van humane hematopoietische stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: Leer hoe je humane hematopoietische stamcellen differentieert naar erytroïde cellen en TAL1 knockdown uitvoert via lentivirale transductie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar erytropoëse en bloedziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken L. Douay en MC Giarratana (Universite Paris VI, Frankrijk) voor advies over de ex vivo erytroïde differentiatie, D. Allan en H. Atkins (Ohří, Canada) voor het leveren van bloedmonsters (verkregen in het kader van de Ottawa Hospital Research Ethics board # 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne) voor het verstrekken van de lentivirale vectoren en FJ Dilworth (Ohří, Canada) voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit project werd gefinancierd door een subsidie ​​CIHR (MOP-82813) om MBCGP is een ontvanger van een Ontario Research Fund Computational Regulomics Training Postdoctoraal Fellowship. MB houdt de Canada Research Chair in de regulatie van genexpressie.

<ol><li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis%3A+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132, 631-644 (2008).</li>
<li>Kim, S. I., Bresnick, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+erythropoiesis%3A+emerging+mechanisms+and+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of erythropoiesis: emerging mechanisms and principles.</a> Oncogene. 26, (2007).</li>
<li>Friend, C., Patuleia, M. C., De Harven, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocytic+maturation+in+vitro+of+murine+%28Friend%29+virus-induced+leukemic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Cancer+Inst+Monogr%22%5BJournal%5D)">Erythrocytic maturation in vitro of murine (Friend) virus-induced leukemic cells.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 22, 505-522 (1966).</li>
<li>Weiss, M. J., Yu, C., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythroid-cell-specific+properties+of+transcription+factor+GATA-1+revealed+by+phenotypic+rescue+of+a+gene-targeted+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Erythroid-cell-specific properties of transcription factor GATA-1 revealed by phenotypic rescue of a gene-targeted cell line.</a> Mol Cell Biol. 17, 1642-1651 (1997).</li>
<li>Lozzio, B. B., Lozzio, C. B., Bamberger, E. G., Feliu, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipotential+leukemia+cell+line+%28K-562%29+of+human+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">A multipotential leukemia cell line (K-562) of human origin.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 166, 546-550 (1981).</li>
<li>Giarratana, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+generation+of+fully+mature+human+red+blood+cells+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).</li>
<li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Curr Protoc Neurosci. Chapter 4, (2006).</li>
<li>Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+normal+hematopoietic+and+leukemia+stem+cell+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).</li>
<li>Amsellem, S., Ravet, E., Fichelson, S., Pflumio, F., Dubart-Kupperschmitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximal+lentivirus-mediated+gene+transfer+and+sustained+transgene+expression+in+human+hematopoietic+primitive+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Maximal lentivirus-mediated gene transfer and sustained transgene expression in human hematopoietic primitive cells and their progeny.</a> Mol Ther. 6, 673-677 (2002).</li>
<li>Laurenti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+and+shRNA+expression+in+resident+hematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Inducible gene and shRNA expression in resident hematopoietic stem cells in vivo.</a> Stem Cells. 28, 1390-1398 (2010).</li>
<li>Palii, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+genomic+targeting+of+the+transcription+factor+TAL1+in+alternate+haematopoietic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Differential genomic targeting of the transcription factor TAL1 in alternate haematopoietic lineages.</a> EMBO J. 30, 494-509 (2011).</li>
<li>Fibach, E., Manor, D., Oppenheim, A., Rachmilewitz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+maturation+of+human+erythroid+progenitors+in+liquid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Proliferation and maturation of human erythroid progenitors in liquid culture.</a> Blood. 73, 100-103 (1989).</li>
<li>Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+major+blood+group+antigens+on+human+erythroid+cells+in+a+two+phase+liquid+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Expression of major blood group antigens on human erythroid cells in a two phase liquid culture system.</a> Blood. 75, 505-511 (1990).</li>
<li>Sui, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin-independent+erythrocyte+production%3A+signals+through+gp130+and+c-kit+dramatically+promote+erythropoiesis+from+human+CD34%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin-independent erythrocyte production: signals through gp130 and c-kit dramatically promote erythropoiesis from human CD34+ cells.</a> J Exp Med. 183, 837-845 (1996).</li>
<li>Panzenbock, B., Bartunek, P., Mapara, M. Y., Zenke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+of+human+stem+cell+factor%2Ferythropoietin-dependent+erythroid+progenitor+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation of human stem cell factor/erythropoietin-dependent erythroid progenitor cells in vitro.</a> Blood. 92, 3658-3668 (1998).</li>
<li>Lindern, M. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glucocorticoid+receptor+cooperates+with+the+erythropoietin+receptor+and+c-Kit+to+enhance+and+sustain+proliferation+of+erythroid+progenitors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The glucocorticoid receptor cooperates with the erythropoietin receptor and c-Kit to enhance and sustain proliferation of erythroid progenitors in vitro.</a> Blood. 94, 550-559 (1999).</li>
<li>Freyssinier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((amplification+and+characterization+of+a+population+of+human+erythroid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">amplification and characterization of a population of human erythroid progenitors.</a> Br J Haematol. 106, 912-922 (1999).</li>
<li>Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+human+red+blood+cell+production+from+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells.</a> Blood. 91, 2664-2671 (1998).</li>
<li>Carlile, G. W., Smith, D. H., Wiedmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-3+has+a+nonapoptotic+function+in+erythroid+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation.</a> Blood. 103, 4310-4316 (2004).</li>
<li>Mazurier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+and+efficient+selection+of+human+transduced+primitive+hematopoietic+cells+using+the+humanized+S65T+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein.</a> Gene Ther. 5, 556-562 (1998).</li>
<li>Salmon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+transgene+expression+in+human+hematopoietic+progenitors+and+differentiated+blood+lineages+after+transduction+with+improved+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors.</a> Blood. 96, 3392-3398 (2000).</li>
</ol>

Een aantal methoden zijn eerder gebruikt om de cellen te differentiëren erythroïde in cultuur met een variabele mate van succes. Bijvoorbeeld, sommige protocollen zonder co-cultuur op de MS-5 maakt uitbreiding van erythroïde cellen, maar zijn niet efficiënt in het produceren van volledig rijpe enucleated rode bloedcellen 12-17. Terwijl andere methoden is het mogelijk een efficiënte enucleatie, is het ten koste van de proliferatie 18,19. De methode die we hier hebben gebruikt, in eerste instantie on...

lentivirale-gemedieerde knockdown tijdens het ex vivo erytropoëse van humane hematopoietische stamcellen

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erytropoëse is een veel gebruikte modelsysteem om celdifferentiatie te bestuderen. Tijdens de erytropoëse, pluripotente volwassen humane hematopoietische stamcellen (HSC) differentiëren in oligopotent voorvaderen, betrokken precursoren en rijpe rode bloedcellen 1. Dit proces wordt geregeld voor een groot deel op het niveau van genexpressie, waarbij specifieke transcriptiefactoren te activeren lijn-specifieke genen, terwijl gelijktijdig het onderdrukken van genen die specifiek zijn voor andere soorten cellen 2. Studies over transcriptiefactoren reguleren erytropoëse worden vaak uitgevoerd met behulp van mensen en muizen cellijnen die, vertegenwoordigen tot op zekere hoogte, erythroïde cellen bij gegeven stadia van differentiatie 3-5. Maar getransformeerde cellijnen kan slechts gedeeltelijk nabootsen erythroïde cellen en het belangrijkste is dat het niet mogelijk om een ​​begrijpelijk studie van de dynamische veranderingen die de vooruitgang als cellen ontstaan ​​door vele podia naar hun uiteindelijke erythroid lot. Daarom is een actuele uitdaging blijft de ontwikkeling van een protocol bij relatief homogene bevolking van de primaire HSC en erythroïde cellen te verkrijgen in verschillende stadia van differentiatie in hoeveelheden die voldoende zijn om genomics en proteomics experimenten uit te voeren. Hier beschrijven we een ex vivo celkweek-protocol om erythroïde differentiatie te induceren van humane hematopoietische stam / voorlopercellen die zijn geïsoleerd van beide navelstrengbloed, beenmerg, perifeer bloed of volwassen gemobiliseerd met G-CSF (leukaferese). Deze cultuur-systeem, in eerste instantie ontwikkeld door de Douay laboratorium 6, maakt gebruik van cytokines en co-cultuur op mesenchymale cellen na te bootsen het beenmerg micro-omgeving. Met behulp van deze ex vivo differentiatie protocol, zien we een sterke versterking van erytroïde voorouders, een inductie van differentiatie enkel ten aanzien van de erytroïde lijn en een volledige rijping van het stadium van enucleated rode bloedcellen. Zo, dit systeem biedt de mogelijkheid om het moleculaire mechanisme van transcriptionele regulatie als hematopoietische stamcellen vooruitgang langs de erytroïde lijn te bestuderen. Studeren erytropoëse op het transcriptionele niveau vereist ook de mogelijkheid om over-express of knockdown specifieke factoren in primaire erythroid cellen. Hiervoor maken we gebruik van een lentivirus-gemedieerde gen-levering systeem dat zorgt voor de efficiënte infectie van zowel delende als niet-delende cellen 7. Hier laten we zien dat we in staat zijn om efficiënt te knockdown de transcriptiefactor TAL1 in primaire menselijke erythroid cellen. Daarnaast, GFP expressie toont een rendement van lentivirale infectie bijna 90%. Zo, onze-protocol zorgt voor een zeer nuttig systeem voor de karakterisering van de regulerende netwerk van transcriptiefactoren die controle erythropoiese.

Een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Protocol om te rijpen menselijke rode bloedcellen uit hematopoietische stamcellen / voorlopers genereren is beschreven. Daarnaast beschrijven we een efficiënte lentivirale-delivery methode om knockdown de transcriptiefactor TAL1 in primaire erythroid cellen. De efficiëntie van lentivirus gemedieerde gen delivery is aangetoond met behulp van GFP uiten van virussen.

Lentivirale-gemedieerde Knockdown Tijdens het Ex Vivo Erytropoëse van humane hematopoietische stamcellen

Erytropoëse is een veelgebruikt modelsysteem voor het bestuderen van celdifferentiatie. Tijdens de erytropoëse differentiëren pluripotente hematopoëtische stamcellen van volwassen mensen...

Het algemene doel van deze procedure is om menselijke hematopoëtische stam- en progenitorcellen te differentiëren langs de erythroïde lijn en om een specifieke transcriptiefactor uit te schakelen tijdens ex vivo erythropoëse. Dit wordt bereikt door eerst CD34-positieve menselijke stam- en progenitorcellen te isoleren uit navelstrengbloed, beenmerg of perifeer bloed dat is gemobiliseerd met GCSF. De tweede stap van de procedure is het differentiëren van deze hematopoëtische stamcellen langs de erythroïde lijn middels een celkweekprocedure in vier stappen, waarbij specifieke cytokinen en co-kweek op een stromale cellaag worden gecombineerd om de micro-omgeving van het beenmerg na te bootsen.Bereid vervolgens lentivirale vectorpartikels voor die een HRNA-molecuul tegen de transcriptiefactor van belang, een gescrammeld HRA-molecuul als negatieve controle en het GFP-eiwit voor het controleren van de efficiëntie van de virusinfectie tot expressie brengen. De laatste stap van de procedure is het infecteren van de primaire humane erytroïde cellen in een bepaald differentiatiestadium met lentivirale partikels. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die celproliferatie en erytroïde

lentiviral-mediated-knockdown-during-ex-vivo-erythropoiesis-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In this video, we demonstrate a method to perform transduction of shRNA lentiviral vectors to obtain stable knockdown cell lines in immortalized hematopoietic stem and progenitor cells (iHSPCs).

Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in iHSPCs In Vitro: A Lentivirus-Based shRNA Expression System Delivery into iHSPCs for Knockdown of Specific Gene Expression

We geven een in vitro muizen foetale lever erytroblast kweeksysteem dat de vroege en late stadia van terminal erytropoëse ontleedt. Dit systeem vergemakkelijkt de functionele analyse van specifieke genen in verschillende ontwikkelingsstadia.

Muis foetale lever Cultuur System Doel Gene functies ontleden in de vroege en late stadia van Terminal Erytropoëse

Het manipuleren van temporele genexpressie in differentiërende embryonale stamcellen (ESCs) kan worden bereikt met behulp van induceerbare gensystemen. De generatie van deze cellijnen is echter kostbaar en tijdrovend. Dit protocol bereikt snelle expressie van een transgen in differentiërende ES-afgeleide cellen en daaropvolgende analyse van downstream hematopoëtische differentiatie.

Retrovirale infectie van muizen embryonale stamcellijnen Afgeleid embryoiden lichaamscellen voor Analyse van hematopoietische differentiatie

Dit protocol beschrijft de efficiënte inductie van hemogene endotheel en multipotente hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen via de geforceerde expressie van transcriptiefactoren.

Direct Inductie van Hemogenic Endotheel en Bloed door overexpressie van transcriptiefactoren in menselijke pluripotente stamcellen

Hier presenteren wij ons protocol voor produceren geïnduceerde erythroid progenitoren (iEPs) van volwassen fibroblasten muis met behulp van transcriptie factor-gedreven directe bloedlijn herprogrammering (DLR).

Directe bloedlijn herprogrammering van volwassen muis Fibroblast te Erythroid voorlopercellen

Beschreven zijn protocollen voor de zeer efficiënte genoom bewerking van muriene hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPC) door het CRISPR/Cas9-systeem om snel muismodel systemen te ontwikkelen met hematopoietische systeemspecifieke genmodificaties.

Lentivirale CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerking voor de studie van hematopoietische cellen in ziekte modellen

Hier bieden we een protocol voor het screenen van potentiële transcriptiefactoren die betrokken zijn bij de ontwikkeling van dendritische cel (DC) met behulp van lentivirale transductie van shRNA om stabiele knockdown-cellijnen te verkrijgen voor in vitro DC-differentiatie.

Studie van dendritische celontwikkeling door korte haarspeld RNA-gemedieerde gen knockdown in een hematopoëtische stam en voorlopercellijn in vitro

Met behulp van het goedkope kationische polymeer polyethylenimine (PEI) produceerden we lentivirale deeltjes voor stabiele expressie van shRNA's in H9 menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en transiënt getransduceerde H9-afgeleide neurale voorlopercellen (NPC's) met een hoge efficiëntie.

Lentivirale gemedieerde levering van shRNA's aan hESCs en NPC's met behulp van goedkope kationische polymeerpolyethylenimine (PEI)

Het huidige protocol beschrijft een geoptimaliseerde hematopoietische stam- en voorlopercel (HSPC) kweekprocedure voor de robuuste engraftment van gen-bewerkte cellen in vivo.

CRISPR/Cas9-genbewerking van hematopoietische stam- en voorlopercellen voor gentherapietoepassingen

Het modelleren van erytropoëse biedt een waardevolle kans om de biologische betekenis van actoren in dit proces te begrijpen en om nieuwe therapeutische benaderingen te evalueren die differentiatiedefecten kunnen verlichten. Hier beschrijven we een eenvoudige en betrouwbare methode om CD34+ hematopoëtische stam- en voorlopercellen ex vivo efficiënt te differentiëren.

Een uitgebreide pijplijn om de efficiëntie van menselijke erytropoëse in vitro en ex vivo te beoordelen

Leer hoe je humane hematopoietische stamcellen differentieert naar erytroïde cellen en TAL1 knockdown uitvoert via lentivirale transductie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar erytropoëse en bloedziekten.

Lentivirale-gemedieerde Knockdown Tijdens het Ex Vivo Erytropoëse van humane hematopoietische stamcellen

Meer video's verkennen