Name: Chirurgische Transplantatie van Mouse neurale stamcellen in het ruggenmerg van muizen geïnfecteerd met neurotrope Mouse Hepatitis Virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-10T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Leer neurale stamceltransplantatie in het ruggenmerg van JHMV-geïnfecteerde muizen voor remyelinisatieonderzoek. Deze methode ondersteunt studies naar celvervangingstherapieën voor demyeliniserende ziekten zoals MS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Voorbereiding <ol><li> Bereid Xylazine-ketamine oplossing (Ketamine is een gereguleerde stof. Gedetailleerde gegevens worden bewaard en de oplossingen die zijn opgeslagen in een veilige, afgesloten locatie). </li><li> Schoon en steriliseren apparatuur. </li><li> Bereid operatie gebied door af te vegen met aseptische agent en vervolgens bedekken met steriel papier badstof, en het opzetten van de micromanipulator. </li></ol> 2. De voorbereiding van cellen voor transplantatie <ol><li> De cellen moeten worden geresuspendeerd tot een concentratie van 100.000 cellen / e l en, hoewel slechts 250.000 cellen worden getransplanteerd per muis, is een overschot aan cellen die nodig zijn voor het laden van spuit doeleinden (voor te bereiden op zijn minst 300.000 cellen per muis het ontvangen van cellen). </li><li> Was cellen worden getransplanteerd 3 keer in HBSS in een 50 ml conische flacon. Tel het aantal cellen voor de laatste spin. </li><li> Na de laatste spin down, giet HBSS en laat injectieflacon ondersteboven positie om druppels te voorkomen dat het bereiken van de pellet. </li><li> Droge binnenmuren met een UV-bestraald, steriele Kimwipe. Sta niet toe dat de pellet drogen. </li><li> Houd de tube rechtop, langzaam en heel subtiel de cellen opnieuw in suspensie in de helft van het uiteindelijke gewenste volume van HBSS. </li><li> Meet het totale volume door pipetteren de meerderheid van de suspensie in een pipetpunt en vervolgens het aanpassen van de draaiknop op de pipetter tot de hele ophanging is in de pipetpunt. Dit zal u vertellen hoeveel meer HBSS is nodig voor de gewenste concentratie. </li><li> Breng het volume op de gewenste hoeveelheid door het toevoegen van HBSS. </li><li> Plaats terug op het ijs. Controleer levensvatbaarheid van de cellen als ze moeten op het ijs te zijn voor langer dan 2 uur. </li></ol> 3. De voorbereiding van muizen voor chirurgie en transplantatie <ol><li> Verdoven van de muis door intraperitoneale injectie van ketamine (100mg/kg) en xylazine (10mg/kg) in ~ 100 ul doses of een gelijkwaardige verdoving. De gehele procedure van chirurgische prep te hechten duurt 30-40 minuten. </li><li> (Optioneel: van toepassing zijn genummerd, gekleurde tape om de staart van elke muis om identificatie te garanderen) </li><li> Shave op het ruggedeelte van de muis van de lage rug naar de nek, en de uitbreiding 2 cm bilaterale van de middellijn, met elektrische tondeuse. Het haar moet worden geknipt zo dicht mogelijk (het kan nodig zijn om te gaan over het gebied meerdere malen). </li><li> Voor het verwijderen van de resterende haren, een dunne laag van ontharingscrème (Nair) toe te passen met een gaasje tip applicator. </li><li> Na 1-2 minuten, veeg Nair af met gaas, licht bevochtigd met water en zeep. De bereide gebied moet schoon blote huid zonder enige verdwaalde stukjes van haar dat zou kunnen in de wond te krijgen tijdens de daaropvolgende chirurgische ingreep. Steriliseer de geprepareerde gebied met jodide-oplossing. </li></ol> 4. Laminectomie <ol><li> Regelmatig te veranderen en / of handschoenen steriliseren tijdens de gehele procedure. Plaats de muis dorsale zijde naar boven met het hoofd wijzend naar links (als je rechts bent overhandigd). Draperen dier om steriliteit te waarborgen en dat alleen het geschoren gebied wordt blootgesteld. Maak een verticale incisie (~ 1,3 cm) over de laminecomy website spanning van ongeveer borstwervels T8 naar T12. </li><li> Met de Graefe tang gehouden in de linkerhand, stevig vast de wervelkolom bij T9 (Figuur 1A) en til de muis tot aan de wervelkolom kromming overdrijven. </li><li> Gebruik de scalpel op de kruising tussen de T10 en T11, de ruimte tussen de twee stekelige uitsteeksels score. Verder bloot te leggen van de kruising door het zorgvuldig slopen van de spierlaag weg tot op het bot bloot te leggen (zie figuur 1B, C). </li><li> Gebruik de schaar om duidelijke spieren verder weg van de lamina en rond de pedikel met kleine knipt. Dit opent een kleine ruimte tussen de wervels. Langzaam en voorzichtig steek een blad van de schaar in dit gat en knip de pedikel. Zorg ervoor dat de kromming van de schaar is altijd lateraal geplaatst, uit de buurt van het snoer. Herhaal dit aan de andere kant. (Zie figuur 1D, E) </li><li> Til de lamina aan het snoer bloot te leggen en zorgvuldig knip het uit. Zorg ervoor dat u niet achter te laten een gratis of gekartelde botfragmenten. (Zie Figuur 1F) </li><li> Voorafgaand aan de injectie, weg te reinigen geen bloed met een steriele wattenstaafjes. </li></ol> 5. Injectie van cellen <ol><li> Bevestig de naald met naald moer op de Hamilton spuit en maak ze schoon door te spoelen meerdere malen met water, vervolgens 70% ethanol, en uiteindelijk HBSS. Plaats zuiger na elk vullen met water, 70% ethanol, of HBSS. </li><li> Bereid de Hamilton spuit cel laden door het verwijderen van de zuiger en losmaken van de naald moer en trek de naald uit de buurt van de spuit om tegendruk te voorkomen. Zorg ervoor dat de zorgvuldige behandeling van de naald en moer zijn gedaan met steriele handschoenen. </li><li> Load 15μl van cellen in pipetpunt en strak druk op de tip in de achterkant van de spuit om de cellen te laden in de spuit. </li><li> Plaats de zuiger ongeveer 5 mm en draai de naald moer. </li><li> Druk zuiger until een deel van de celsuspensie wordt gezien het verlaten van de naald. </li><li> Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit en leg de spuit in de horizontale positie om de cellen te voorkomen van het maken van een helling door de zwaartekracht. </li><li> Pakken de laminectomized muis door de spinalis dorsi spier het aansluiten van de stekels van T8 en T9 (figuur 2B, C). </li><li> Klem de hemostaat naar links (verticaal) micromanipulator arm, zodat de muis voorpootjes in de lucht en zijn achterste poten lichtjes aanraken van een platform van steriele papieren handdoeken in de figuren 2A en 2B. </li><li> Bevestig de spuit aan de rechterkant micromanipulator arm (bij een 70 ° hoek) en schuif de spuit in de laagste stand mogelijk voor klemmen. </li><li> Het stabiliseren van de muis door pinnen zijn staart tegen het papier handdoeken en langzaam de spuit (figuur 2B). </li><li> Laat de naald naar het snoer en steek de naald 1 mm in de tegenovergestelde hemisfeer via de dorsale middellijn (figuur 2C). De tip van de naald moet in de grijze stof dicht bij het centraal kanaal. </li><li> Injecteer langzaam 2.5μl van cellen. Injecteren met een snelheid van 1μl / 5 seconden. Na het injecteren van de cellen, wacht een 10 seconden en schuif de naald een tiende van een beurt in een tijd elke 10 seconden totdat de naald uit de koord. Besteed aandacht aan mogelijke uitstroom van celsuspensie. </li><li> Snel trekken de spuit en verwijder deze uit de micromanipulator arm. Leg de spuit neer horizontaal. </li><li> Laat de muisknop los en overdracht aan hechten tafel. </li><li> Herhaal stap 5.7-5.14 voor elke muis totdat de spuit leeg is. Steriliseer instrumenten (in de sterilisator) en de naald (door te vegen met ethanol), tussen de dieren. Gooi cellen en reload als klonteren zichtbaar is. </li><li> Reinig de spuit als in stap 5.1 tussen de verschillende vrachten. </li></ol> 6. Hechtingen en post-op zorg <ol><li> Hechting van de incisie. Hechtdraad naald wordt ingevoegd in de oppervlakkige fascia aan beide zijden van de incisie. De draad wordt gespannen door, trekken oppervlakkige fascia samen (figuur 3A), waardoor met betrekking tot het blootgestelde ruggenmerg op de site van de verwijderde lamina. Geen hechting van de huid spier aan de huid of de skeletspieren van de rug. Trek de hele draad door, waardoor ongeveer 1 / 2 ". Met de naaldhouder, drie knopen worden gevormd en draad is bijgesneden zo dicht mogelijk bij de knoop mogelijk te maken. </li><li> Sluit de incisie door het toepassen van twee tot drie nietjes (afhankelijk van de grootte van de incisie) naar de huid (Figuur 3B). Trek de huid weg van de muis om te voorkomen dat nieten van de onderliggende spier. </li><li> Met behulp van een 26G3 / 8 naald te injecteren 0,5 ml Ringers lactaat subcutaan in de lage rug uit de buurt van de incisie. </li><li> Plaats de muis terug in zijn kooi. Om ervoor te zorgen dat in staat is om comfortabel te ademen tijdens het onder narcose, de muis moet worden gelegd op zijn kant in de kooi, het vermijden van contact tussen plaats van de operatie en de kooi beddengoed. Kooien moeten worden geplaatst bij verhitting pads. </li><li> Muizen zijn gecontroleerd na verdoving is uitgewerkt om ervoor te zorgen bloeden afneemt, hechtingen gesloten blijven, en dat muizen terug te keren naar pre-operatie mobiliteit. </li><li> Behandel muizen een keer met de pijnstillende buprenorfine (0,05-0,1 mg / kg) na de operatie. </li><li> Zorg ervoor dat verminderde muizen hebben voldoende toegang tot voedsel en water: water flessen zijn voorzien van uitgebreide 3,5-inch uitlopen en muizen die niet in staat zijn om te zijn met de hand gevoed water en / of calorierijke voedingssupplement (Nutri-Cal, Tomlyn) lopen. </li></ol> 7. Representatieve resultaten: Gewenste resultaten zullen te herkennen zijn door het gebrek aan efflux van de celsuspensie tijdens de injectie en door de intacte verschijning van het ruggenmerg na de procedure. Daartoe is het belangrijk om helder en directe verlichting op de rug van de muis hebben tijdens de laminectomie en tijdens de injectie. Optimale belichting wordt vergemakkelijkt door glasvezel verlichting (Figuur 2A). <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1 - laminectomie (A) Zodra wervel T9 is stevig gehouden met de Graefe tang, (B, C) ​​de score van de wervelkolom met scalpel tussen T10 en T11 om het invoeren van de micro-schaar te vergemakkelijken.. (D) Schuif de micro schaar door de ruimte tussen de T10 en T11 (pijlen en inzet, E) en snijd de steeltjes aan elke kant (streepjes, E) aan de dorsale lamina gratis. (F) Flip de lamina up rostraal en knip het uit. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Injectie van NSCs. (A) De algemene opzet van de micromanipulator met de hemostaat houdt de muis aan de linkerarm en de Hamilton spuit op de rechter arm bij een 70 hoek. (B) De hemostat houden de spinalis dorsi spier het aansluiten van de stekels van T8 en T9. (C) De naald wordt verlaagd door middel van tHij middellijn en in de grijze stof aan de andere halfrond, proximaal van de centrale kanaal. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Hechtingen en wondsluiting. (A) hechtingen worden toegepast op de oppervlakkige fascia aan beide zijden van de incisie. (B) De incisie wordt gesloten met 2-3 nietjes als nodig is (een nietje getoond op een wond nodig 3).

<ol><li>Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronavirus+infection+of+the+central+nervous+system%3A+host-virus+stand-off%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).</li>
<li>Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+multiple+sclerosis%3A+how+do+we+cure+a+chronic+heterogeneous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">The challenge of multiple sclerosis: how do we cure a chronic heterogeneous disease.</a> Ann Neurol. 65, 239-248 (2009).</li>
<li>Fleming, J. O., Trousdale, M. D., Bradbury, J., Stohlman, S. A., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+demyelination+induced+by+coronavirus+JHM+%28MHV-4%29%3A+molecular+identification+of+a+viral+determinant+of+paralytic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Experimental demyelination induced by coronavirus JHM (MHV-4): molecular identification of a viral determinant of paralytic disease.</a> Microb Pathog. 3, 9-20 (1987).</li>
<li>Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination%2C+axonal+sparing%2C+and+locomotor+recovery+following+transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+the+MHV+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis.</a> Exp Neurol. 187, 254-265 (2004).</li>
<li>Carbajal, K. S., Schaumburg, C., Strieter, R., Kane, J., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+engrafted+neural+stem+cells+is+mediated+by+CXCL12+signaling+through+CXCR4+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Migration of engrafted neural stem cells is mediated by CXCL12 signaling through CXCR4 in a viral model of multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 11068-11073 (2010).</li>
<li>Hardison, J. L., Nistor, G., Gonzalez, R., Keirstead, H. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+a+viral+model+of+multiple+sclerosis+induces+remyelination+in+the+absence+of+an+attenuated+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of glial-committed progenitor cells into a viral model of multiple sclerosis induces remyelination in the absence of an attenuated inflammatory response.</a> Exp Neurol. 197, 420-429 (2006).</li>
<li>Blakemore, W. F., Crang, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlakemore%2C+WF+%22Transplantation+of+glial+cells+into+areas+of+demyelination+in+the+adult+rat+spinal+cord%22">Transplantation of glial cells into areas of demyelination in the adult rat spinal cord</a>. , Oxford UP. Oxford. (1992).</li>
<li>Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+differentiate+into+oligodendrocytes+and+myelinate+in+culture+and+after+spinal+cord+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 6126-6131 (2000).</li>
<li>Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+oligodendrocyte+progenitor+cell+transplants+remyelinate+and+restore+locomotion+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury.</a> J Neurosci. 25, 4694-4705 (2005).</li>
<li>Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+patient+enters+trial+to+test+safety+of+stem+cells+in+spinal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">First patient enters trial to test safety of stem cells in spinal injury.</a> BMJ. 341, c5724-c5724 (2010).</li>
</ol>

Een goed uitgevoerde transplantatie zal vooral afhangen van de zorgvuldige laminectomie en de injectie van de cellen. De primaire valkuil om te voorkomen dat tijdens een laminectomie is de beschadiging van het ruggenmerg. Dit kan gebeuren tijdens de procedure zelf of door de schade veroorzaakt door scherpe botsplinters links achter het volgen van de procedure. Om te voorkomen dat deze, ervoor te zorgen dat de punten van de gebogen micro schaar altijd worden geconfronteerd met uit de buurt van het snoer en zorgvuldig onderzoekt de laminectomized ruggengraat om ervoor te zorgen dat alle botfragmenten worden gewist en dat de resterende vertebrale structuur niet openlijk uitpuilende of gekartelde randen. Zoals eerder vermeld, zal de detectie van de uitstroom mogelijk als het licht is fel en direct schijnen op de blootgelegde ruggenmerg tijdens de injectie. Efflux is het meest waarschijnlijk gebeuren met 30 gauge naalden (versus 33 gauge) en als de injectie te snel wordt gedaan. Hoewel dit protocol heeft ons goede resultaten, anderen hebben meer gemeld wachttijden (tot 5 minuten) voordat het terugtrekken van de naald na de injectie 8,9. Ook kleinere gauge naalden zijn voorkeur, maar we hebben geconstateerd dat sommige cellen zijn te gemakkelijk gelyseerd toen gepasseerd 33 gauge naalden. Voor een maximale efficiëntie, een transplantatie team bemannen van de vier verschillende stations (muis prep, laminectomie, injectie, en hechtingen) is wenselijk. Bovendien moet de timing voor elke procedure worden geoptimaliseerd om de tijd de cellen zitten te wachten op ijs te minimaliseren. Zo hebben we onze muizen transplantatie in groepen van vier (het aantal doses in elke lading van de spuit), de persoon die het injecteren van de cellen begint het laden van de spuit na de derde muis is laminectomized en de persoon die de voorbereiding van de muizen zou moeten verdoven van de volgende groep na de tweede muis van de vorige groep is laminectomized. Op deze manier kunnen we transplantatie-cellen (of controle media) in 40 muizen in ongeveer 3 uur, ook al elke muis zal ongeveer 30-40 minuten te nemen. Celvervangingstherapieën voor de behandeling van sommige aandoeningen CNS bevinden zich momenteel in klinische studies 10. Er is geen substituut voor in vivo modellen van NSC transplantatie en onze protocol voor de innesteling van NSCs in het ruggenmerg van muizen met virale geïnduceerde demyelinisatie vergemakkelijkt het gebruik van een belangrijk model van MS en kan ook gemakkelijk worden aangepast aan andere modellen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens / apparatuur </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> Ketaject </td><td> Phoenix Parmaceuticals </td><td> NDC 57319-542-02 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine hydrochloride </td><td> MP Biomedicals </td><td> 158307 </td><td></td></tr><tr><td> Nair </td><td> Church &amp; Dwight Co </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10  ul Hamilton spuit w / verwisselbare naald </td><td> Hamilton Company </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton Naalden, 30G of 33 G, ½ inch, 30 ° schuine </td><td> Hamilton Company </td><td> 7803-077803-05 </td><td> Test de levensvatbaarheid van uw cellen volgende passage door naalden om de beste graadmeter om te gebruiken te identificeren </td></tr><tr><td> Micro Schaar </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> 555500S </td><td></td></tr><tr><td> Kleine Graefe Forceps </td><td> FST </td><td> 11053-10 </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaxische </td><td> KOPF Instrumenten </td><td> Model 1772 Universele Houder </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaxische </td><td> KOPF Instrumenten </td><td> Model 1773 Electrode Holder </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaxische </td><td> KOPF Instrumenten </td><td> Model 902 kleine dieren stereotaxische </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaxische </td><td> KOPF Instrumenten </td><td> Model 960 links elektrode carrier </td><td></td></tr><tr><td> Hechtingen </td><td> Ethicon </td><td> 95057-064 </td><td></td></tr><tr><td> Lactaat Ringers </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-7953-03 </td><td></td></tr><tr><td> Staples </td><td> Fijn Wetenschap </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Hemostat </td><td> FST </td><td> 13010-12 </td><td></td></tr><tr><td> Scalpels, maten 10,11 </td><td> Visser </td><td> 268878, 268879 </td><td></td></tr><tr><td> Hechtingen </td><td> ETHICON </td><td> 1676G </td><td> grootte 5-0, 3 / 8 &quot;cirkel, 19mm naald, 45cm gevlochten draad </td></tr><tr><td> Reflex 7 wond clip applicator </td><td> FST </td><td> 12031-07 </td><td></td></tr><tr><td> 7mm Reflex wond clips </td><td> FST </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Olsen-Hegar naaldhouder </td><td> FST </td><td> 12502-12 </td><td></td></tr></tbody></table>

chirurgische transplantatie van mouse neurale stamcellen in het ruggenmerg van muizen geïnfecteerd met neurotrope mouse hepatitis virus

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Muizen die besmet zijn met de neurotrope JHM stam van muizen hepatitis virus (MHV) ontwikkelen pathologische en klinische uitkomsten vergelijkbaar met patiënten met de demyeliniserende ziekte Multiple Sclerose (MS). We hebben aangetoond dat transplantatie van NSC in het ruggenmerg van zieke muizen resulteert in een significante verbetering van zowel remyelinisatie en in de klinische uitkomst. Celvervangingstherapieën voor de behandeling van chronische neurologische ziekten zijn nu een realiteit en in vivo modellen zijn essentieel in het begrijpen van de interacties tussen de cellen en geënt gastheerweefsel micro-omgeving. Deze presentatie geeft een aangepaste methode voor het transplanteren van cellen in het ruggenmerg van JHMV-geïnfecteerde muizen. Kortom, we voorzien in een procedure voor i) de voorbereiding van NSCs voorafgaand aan de transplantatie, ii) de pre-operatieve zorg van muizen, iii) blootstelling van het ruggenmerg via laminectomie, iv) stereotactische injectie van NSCs, en iv) post-operatieve zorg .

De transplantatie van muis neurale stamcellen (NSCs) in het ruggenmerg van muizen met gevestigde demyelinisatie is gedetailleerd. De voorbereiding van NSCs, is de laminectomie van de thoracale wervel 9 (T9), en de transplantatie van NSCs geschetst, samen met de pre-en post-operatieve zorg van de muizen.

Chirurgische Transplantatie van Mouse neurale stamcellen in het ruggenmerg van muizen geïnfecteerd met neurotrope Mouse Hepatitis Virus

Muizen die zijn geïnfecteerd met de neurotrope JHM-stam van het muizenhepatitisvirus (MHV) ontwikkelen pathologische en klinische symptomen die vergelijkbaar zijn met die van patiënten met de ...

Het algemene doel van deze procedure is om remyelinisatie en klinische verbetering te bevorderen bij dieren met een vastgestelde demyelinisatie via transplantatie van neurale stamcellen in het ruggenmerg van JHMV-geïnfecteerde muizen. Dit wordt bereikt door eerst het dier voor te bereiden. De tweede stap van de procedure is het uitvoeren van een laminectomie bij de thoracale wervels.Vervolgens worden 10 cellen in het blootgestelde ruggenmerg geïnjecteerd. Na een succesvolle injectie wordt de wond gesloten. Uiteindelijk is er sprake van de aanwezigheid van neurale stamcellen van muizen in het ruggenmerg.Parenchym kan worden gevisualiseerd met methoden zoals fluorescentiemicroscopie, Neuro stamceltransplantatie in het ruggenmerg van JHMB. Geïnfecteerde muizen kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van celvervangingstherapieën voor de behandeling van demyeliniserende ziekten, zoals de wijze waarop de cellen migreren, prolifereren en differentiëren, en hoe de cellen het centrale zenuwstelsel beïnvloeden. Daarnaast kan worden onderzocht of we de cellen of de omgeving van het ruggenmerg waarin ze worden getransplanteerd kunnen modificeren om hun therapeutische voordelen te verbeteren.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in celvervangingstherapie in een viraal model van demyelinisatie, kan deze ook worden toegepast op andere modellen van demyelinisatie en letsel, zoals experimentele auto-immune encefalomyelitis, EAE, en dwarslaesies.Bereid het operatiegebied voor en stel de micromanipulator in om de cellen voor transplantatie voor te bereiden met trypsine, en resuspendeer deze in een conische buis van 50 milliliter. Was de te transplanteren cellen drie keer in HBSS. Tel de cellen vóór de laatste centrifugatiestap.Na de laatste centrifugatiestap wordt het HBSS afgegoten en wordt het flacon ondersteboven gelaten om te voorkomen dat druppels het pellet bereiken. Droog de binnenwanden met een UV-bestraalde steriele Kim wipe. Laat het pellet niet uitdrogen.Houd de buis langzaam en zeer voorzichtig rechtop. Resuspendeer de cellen in de helft van het gewenste uiteindelijke volume HBSS. Uiteindelijk moeten de cellen een concentratie hebben van 100.000 cellen per microliter.Meet het totale volume door de suspensie in een pipetpunt te pipetteren en vervolgens aan de draaiknop van de pipet te draaien totdat de volledige suspensie in de pipetpunt zit. Hiermee kunt u bepalen hoeveel extra HBSS nodig is voor de gewenste concentratie. Vul de cellen aan tot het gewenste volume.Voeg HBSS toe. De cellen kunnen vervolgens worden overgebracht naar een eppendorfbuisje. Plaats ze opnieuw op ijs.Controleer de levensvatbaarheid van de cellen als ze langer dan twee uur op ijs moeten blijven. Om de chirurgische procedure te starten, bevestig dan het juiste niveau van anesthesie via de teenknijpreflex. Gebruik een elektrische scheermachine om het dorsale gebied van de muis te scheren, van de onderrug tot aan de nek.Zodra het gebied is geschoren, brengt u een dunne laag ontharingscrème aan om eventueel resterend haar te verwijderen. Veeg het gebied na één tot twee minuten schoon met droog gaas en vervolgens met gaas dat licht is gedrenkt in zeepwater. Het chirurgische gebied moet nu haarloos zijn.Steriliseer tot slot het voorbereide gebied met Betadine-oplossing en breng zalf aan op de ogen. Om uitdroging te voorkomen, wordt de muis in rugligging geplaatst. Maak een incisie boven de plek van de laminectomie, beginnend vanaf ongeveer de thoracische wervels.T 8 tot T 11. Vergroot de kromming van de wervelkolom en lokaliseer T 10. Dit is de eerste wervel met een plat proces en bevindt zich over het algemeen twee wervels rostraal van het apexpunt van de kromming van de wervelkolom.Zet de wervelkolom stevig vast met de grijze pincet. Maak bij T 9 met een scalpel een inkeping in de ruimte tussen de twee doornuitsteeksels van T 10 en T 11. Schraap vervolgens de spierlaag weg om het onderliggende bot bloot te leggen, waarbij u erop let dat de kromming van de schaar van het ruggenmerg af is gericht.Steek langzaam één blad van de schaar tussen T 10 en T 11. Schuif het blad tussen het ruggenmerg en de pedikel van T 10 en knip de pedikel door. Herhaal dit aan de andere zijde. Til de lamina op om het onderliggende ruggenmerg bloot te leggen en knip dit voorzichtig af.Zorg ervoor dat er geen losse of grillige botfragmenten achterblijven. Zodra alle botfragmenten zijn verwijderd, veegt u eventueel bloed weg met steriele wattenstaafjes. Bereid vervolgens de Hamilton-spuit voor door de naald met de naaldmoer te bevestigen.Plaats de zuiger en spoel meerdere keren met water. Spoel na het reinigen één keer met 70% ethanol en HBSS. Verwijder de zuiger en draai de naaimoer los.Trek de naald weg van de spuit om tegendruk te voorkomen. Laad bij het vullen 15 µL cellen in de spuit door de pipetpunt stevig tegen de achterkant van de spuit te drukken. Schuif de zuiger ongeveer vijf millimeter in en draai vervolgens de naaldmoer vast.Druk de zuiger in totdat er wat van de celсусpensie uit de naald komt. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit zitten en leg de spuit horizontaal neer om te voorkomen dat de cellen door zwaartekracht een gradiënt vormen. Ga terug naar het dier en gebruik hemostaten om de m. spinae dorsi vast te pakken.Het verbinden van de doornuitsteeksels van T8 en T9. Klem de hemostaat aan de linker micromanipulatorarm zodat de voorpoten van de muis in de lucht zijn en de achterpoten lichtjes een platform van steriele papieren handdoeken raken.Bevestig de spuit in een hoek van 70 graden aan de rechter micromanipulatorarm en schuif de spuit naar de laagst mogelijke positie voordat u deze vastklemt. Stabiliseer de muis door de staart tegen de papieren handdoeken te pinnen. Breng de naald langzaam naar het ruggenmerg.Voer de tip één millimeter in de tegenoverliggende hemisfeer in via de dorsale middellijn. De punt van de naald moet zich in de grijze stof bevinden of dicht bij, maar niet in het centrale kanaal. Injecteer langzaam 2,5 µL cellen met een snelheid van één µL per vijf seconden.Wacht na het injecteren van de cellen 10 seconden en trek de naald terug. Draai een tiende slag. Trek in dit tempo elke 10 seconden terug totdat de naald uit het navelstrengweefsel is.Wanneer de cellen te snel worden geïnjecteerd of de naald te snel wordt verwijderd, kan er terugstroom van de celсусpensie optreden. Als dit gebeurt, dient de muis uit de studie te worden verwijderd. Trek de naald direct na verwijdering uit het snoer snel terug en koppel de spuit los van de arm van de micromanipulator.Leg de muis opnieuw horizontaal neer. Laat de muis los en verplaats deze naar een hechttafel. Herhaal deze procedure voor elke muis totdat de spuit leeg is.Gooi de cellen weg en laad deze opnieuw als er klontering zichtbaar is, waarbij de spuit tussen de ladingen wordt doorgespoeld en gereinigd. Na de injectie wordt het dier naar een aparte locatie overgebracht om te worden gehecht. Steek de hechtnaald door de oppervlakkige fascie aan beide zijden van de incisie.Trek de hechtdraad door om de fascia samen te brengen en het blootgelegde ruggenmerg op de plaats van de verwijderde lamina te bedekken. Gebruik een naaldhouder en pincet om drie knopen te leggen en knip zoveel mogelijk van de draad weg. Eén hechting is gewoonlijk voldoende terwijl de huid van de muis wordt weggetrokken.Om te voorkomen dat de onderliggende spier wordt getackerd, sluit u de incisie met twee tot drie nietjes. Zodra de wond is gesloten, injecteert u 0,5 milliliters lactaat-ringeroplossing subcutaan in de onderrug, maar uit de buurt van de incisie. Plaats de muis op zijn zij in de kooi en zorg ervoor dat de operatieplek het kooi-bodemmateriaal niet raakt.Houd de dieren in de gaten tot ze volledig zijn hersteld. Deze afbeelding toont succesvol getransplanteerde GFP-gelabelde neurale stamcellen van muizen in een coronale sectie van het ruggenmerg. 21 dagen na transplantatie.Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u neurale stamcellen kunt transplanteren in het ruggenmerg van JHMV-geïnfecteerde muizen. Zodra deze techniek beheerst is, is het mogelijk om deze bij ongeveer 40 muizen in circa drie uur uit te voeren.

surgical-transplantation-mouse-neural-stem-cells-into-spinal-cords

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Neurale voorloper transplantatie is een veelbelovende strategie voor de bescherming en / of vervangen van verloren / disfunctionele cervicale diafragma motorische neuronen in het ruggenmerg letsel (SCI) en de motor neuron ziekte, amyotrofe laterale sclerose (ALS). Wij bieden een protocol voor de cel levering aan cervicale ruggenmerg ventrale hoorn in knaagdiermodellen van ALS en SCI.

Intraspinale Cel Transplantatie voor Targeting Cervicale ventrale hoorn van Amyotrofische Lateraal Sclerose en traumatisch ruggenmergletsel

Source: Weber, R. Z., et al. Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the stereotaxic transplantation of genetically modified human neural progenitor cells (NPCs) into the mouse brain. Researchers inject NPCs expressing luciferase and fluorescent proteins, enabling in vivo bioluminescence imaging and post-mortem fluorescence microscopy to study cell survival, migration, and...

Transplantation of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain

Source: Furmanski, O., et al. Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells. J. Vis. Exp. (2019)In this video, human-induced pluripotent stem cell-derived neural cells are stereotaxically injected into the gray matter-white matter border of the deep cortex in a mouse model of traumatic brain injury. The transplanted cells integrate into the tissue, promoting functional recovery and circuit...

Stereotaxic Transplantation of Neural Cell Suspension into a Mouse with Traumatic Brain Injury

This video demonstrates the intranasal delivery of oncolytic virus loaded therapeutic neural stem cells into a brain-tumor bearing mouse model. The non-invasive intranasal administration of stem cells bypasses the blood brain barrier, facilitating their delivery to the tumor site in the brain for therapeutic applications.

Intranasal Delivery of Therapeutic Neural Stem Cells (NSCs) in Murine Model: A Procedure for Tumor-targeted Delivery of Oncolytic Virus Loaded NSCs into Brain Tumor Bearing Mouse Model

Source: Parajuli, B., et.al. Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the trans-nasal transplantation of induced pluripotent stem cell-derived human microglia (iPSMG) cells into a mouse brain. Hyaluronidase is applied to the nostrils of a microglial-depleted mouse to enhance permeability. iPSMG suspension is administered intranasally, and the mouse is...

Transnasal Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Human Microglial Cells into the Mouse Brain

Hier presenteren we een nieuw model van een gehumaniseerde muizenlever, gegenereerd in Alb-toxinereceptor-gemedieerde cel-knockout (TRECK)/SCID-muizen na de transplantatie van onvolgroeide en uitbreidbare menselijke hepatische stamcellen.

Genereren van een gehumaniseerd muis lever met behulp van menselijke lever stamcellen

Stamcellen zijn veelbelovende therapeutische dragers om hersentumoren te behandelen als gevolg van hun intrinsieke tumor tropisme. Niet-invasieve intranasale stamcelafgifte omzeilt de bloedbreinbarrière en toont een sterk potentieel voor klinische vertaling. In dit artikel worden de basisprincipes van intranasale stamcellen in een muismodel van glioma samengevat.

Intranasale Levering van Therapeutische Stamcellen aan Glioblastoma in een Muis Model

We hebben een protocol voor het uitvoeren van gedeeltelijke hepatectomy (PHx) en cel transplantatie via milt in KNIPOOG beschreven. SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/j) muizen. In dit protocol wordt een incisie gemaakt bloot en resect de linker kwab van de lever, gevolgd door een andere snede voor intrasplenic transplantatie van cellen.

Intrasplenic transplantatie van hepatocyten na gedeeltelijke Hepatectomy in KNIPOOG. SCID muizen

We beschrijven de intraparenchymale transplantatie van menselijke neurale voorlopercellen getransduceerd met een dual reporter vector die luciferase-groen fluorescerend eiwit (GFP) in de hersenen van muizen tot expressie brengt. Na transplantatie wordt het luciferasesignaal herhaaldelijk gemeten met behulp van in vivo bioluminescentie en GFP-tot expressie brengende getransplanteerde cellen geïdentificeerd in hersensecties met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Intracerebrale transplantatie en in vivo bioluminescentie tracking van menselijke neurale voorlopercellen in de hersenen van de muis

Het hier gepresenteerde protocol maakt de transplantatie van geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide menselijke microglia (iPSMG) in de hersenen mogelijk via een transnasale route bij immunocompetente muizen. De methode voor de bereiding en transnasale transplantatie van cellen en de toediening van cytokinemengsel voor het onderhoud van iPSMG wordt getoond.

Transplantatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide microglia in immunocompetente muizenhersenen via niet-invasieve transnasale route

Het huidige protocol beschrijft de ontwikkeling van een reproduceerbaar muizenmodel van ruggenmergglioom door tumorcellen in de tussenwervelruimte te injecteren, wat een effectievere en minder invasieve benadering biedt voor onderzoek en therapeutische ontwikkeling.

Chirurgische transplantatie van tumorcellen in het ruggenmerg van muizen

Leer neurale stamceltransplantatie in het ruggenmerg van JHMV-geïnfecteerde muizen voor remyelinisatieonderzoek. Deze methode ondersteunt studies naar celvervangingstherapieën voor demyeliniserende ziekten zoals MS.

Chirurgische Transplantatie van Mouse neurale stamcellen in het ruggenmerg van muizen geïnfecteerd met neurotrope Mouse Hepatitis Virus (Video) | JoVE Journal

Chirurgische Transplantatie van Mouse neurale stamcellen in het ruggenmerg van muizen geïnfecteerd met neurotrope Mouse Hepatitis Virus

Meer video's verkennen