Name: Ex Vivo Infectie van levend weefsel met oncolytische Virussen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Leer ex vivo infectie van vers weefsel met oncolytische vaccinia virus om infecteerbaarheid te beoordelen. Deze methode omvat viabiliteitsmeting en monitoring van virale replicatie via fluorescentie en bioluminescentie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag Dr Hesham Abdelbary bedanken voor het aanbieden van menselijke chirurgische exemplaren voor de gegevens die in figuur 2.

1. Tissue verwerking <ol><li> Voor de beste resultaten, moet dit protocol worden uitgevoerd met vers geïsoleerde tissue gedeponeerd in DMEM medium met 10% FBS, 1% Pennicilin / Streptomycine oplossing, en 0,1% Amphothericin B-oplossing onmiddellijk na een operatie voorafgaand aan de verwerking. Indien dit niet mogelijk is, kunnen weefsels 's nachts worden gelaten in dit medium bij 4 graden voorafgaand aan de verwerking. </li><li> Voorafgaand aan de verwerking van het monster, steriliseren metalen tang en disposable messen door het storten van hen in een 70% ethanol-oplossing gedurende minstens 5 minuten. Ook voorbereiden een 24-wells plaat met 2 ml DMEM medium met 10% FBS, 1% Pennicilin / Streptomycine oplossing, en 0,1% Amphothericin B. </li><li> Verzamel het weefsel monster in een laminaire stroming celkweek kap met behulp van gesteriliseerde pincet en stort het weefsel in een lege 15 cm petrischaal, het houden van de deksel aan de zijkant, steriele kant naar boven. </li><li> In de celkweek kap, gebruik dan een 2 mm biopsie punch om verschillende kernen te verkrijgen uit verschillende regio's binnen het weefsel zoals in figuur 1. Deponeren van de kernen in het deksel van de 15 cm petri met de hulp van de tang, waardoor er voldoende ruimte tussen elke kern, zodat ze gemakkelijk kunnen worden afgesneden langs de horizontale as. </li><li> Split elke kern in de vier kwartalen zelfs met behulp van een gesteriliseerd scheermesje zoals in figuur 1. </li><li> Met behulp van een pipet tip, zet elke kern kwartaal van een bepaalde kern in een ander goed van A1 tot A4 als in figuur 1, die reeds met 1,5 ml DMEM met 10% FBS, 1% Pennicilin / Streptomycine oplossing, en 0,1% Amphothericin B-oplossing . Herhaal dit voor elke kern. Dit moet het mogelijk maken een representatieve steekproef van de tumor, terwijl het minimaliseren van bias in een gegeven goed / conditie. Voor een betere vertegenwoordiging, toename van het aantal cores. </li></ol> 2. Beoordeling van de levensvatbaarheid van het weefsel <ol><li> Na de verwerking van weefsel, toe te voegen 25μl Alamar blauw goed # A1 en A2 # zoals weergegeven in figuur 1 en incubeer gedurende 1 uur bij 37 graden in een vochtige incubator met 5% CO 2. </li><li> Na incubatie met Alamar blauw, verwijder dan 3 maal 100 pi van elk A1 en A2 goed en transfer naar 6 verschillende wells van een 96-wells plaat. Lees het signaal met behulp van een fluorescentie plate reader (530 excitatie, 590 emissie) en bewaar de gegevens voor uw eigen administratie. </li><li> Na Alamar blauwe signaal is gelezen, overdracht alle stukjes weefsel met behulp van een pipet tip, uit goed A1 naar C1 dat bevat DMEM, 10% FBS + PS + AmphoB. Wees voorzichtig dat u een overmatige hoeveelheid media overdracht van goed A1. </li><li> Respectievelijk infecteren putten A3 en A4 met 10 6 PFU van GFP-expressie en de luciferase-expressie vaccinia virus verdund in 25 ul van de media. Goed A2 kunnen worden geïnfecteerd met een virus dat elk transgen drukt ook helemaal geen. </li><li> 72 uur later, voeg 25 ul Alamar blauw om putten C1 en D1 en herhaal stap 2.2 </li></ol> 3. Visualisatie van GFP transgen expressie door bloei microscopie <ol><li> Verwijder alle celcultuur media die het weefsel stukken om een ​​goede fluorescentie foto's te maken. </li><li> Met behulp van een fluorescentie-microscoop in staat is dissectie, eerst een fase contrast beeld op een geschikte resolutie </li><li> Schakel over naar fluorescentie-modus en maak een foto met de juiste filter op het transgen van belang te visualiseren, in dit geval GFP. </li><li> Gebruik een fluorescentie-filter voor een andere golflengte zo ver mogelijk een van die van het transgen van belang (zoals RFP) om een ​​beeld te krijgen van achtergrond fluorescentie te nemen </li></ol> 4. Visualisatie van luciferase expressie met behulp van een in vivo beeldvorming System (IVIS) <ol><li> Zorg ervoor dat de IVIS is geïnitialiseerd voordat u begint. </li><li> In putten A4 en B4, voeg 5 pl luciferine substraat 10 mg / ml, goed mengen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Stel de IVIS belichtingstijd tot 5 seconden en neem een ​​foto van uw putten. Als het beeld verzadigd is, herhaal dan met een lagere belichtingstijd. Als er geen signaal, verhoging van de belichtingstijd. </li><li> Met behulp van de IVIS imaging software, kunt u verwijderen achtergrond met behulp van het signaal van goed B4 en selecteer de regio van belang zijn voor de luminescentiesignaal kwantificeren. </li></ol> 5. Het beoordelen van virale titers door plaque assay <ol><li> Voorafgaand aan het kwantificeren van virale titers, moet eerst worden gehomogeniseerd weefsel aan virale deeltjes vrij te geven. Dit kan enkele maanden later worden gedaan in het geïnfecteerde weefsel monsters worden bewaard bij -80 </li><li> Weeg het monster dat moet worden gehomogeniseerd met behulp van een analytische schaal. In dit geval zullen we gebruik maken van de monster van goed A2. </li><li> Leg het weefsel is in een 5 ml polystyreen ronde bodem falcon buis en voeg 1 ml PBS. Homogeniseer de weefsel met behulp van een tissue homogenisator. Indien nodig, op te slaan de homogenaat bij -80 voor de beoordeling van de virale titers op een later tijdstip. </li><li> Om titer vaccinia virus, eerste plaat miljoen U2OS cellen in een 6-wells plaat en overnachting in een 37 graden incubeer 5% CO 2 vochtigeified incubator zodanig dat ze ongeveer 95% confluentie bereikt de volgende dag. </li><li> Gebruik serum vrije media op de seriële verdunningen van het virus te doen, zorg ervoor dat u tips tussen elke verdunning stap te wijzigen. Normaal gesproken doen we 1 op de 10 verdunningen en gebruik van 100 ul om te zetten in 900 ui. Hoeveel verdunningen worden gemaakt hangt af van de te verwachten opbrengst virus. </li><li> Na het maken van de verdunningen, verwijder de media die de vergulde U20S cellen dan 500 ul van de verwaterde virus voorraad (voor elke verdunning) toe te voegen aan de U2OS cellen te infecteren. Incubeer de cellen gedurende 1 uur minuten bij 37 graden Celsius in een 5% CO 2 bevochtigde incubator. </li><li> Gedurende deze tijd, warming-up van de 2 X geconcentreerde DMEM met 20% FBS, en de 3% CMC-oplossing in een 37 graden water bad. </li><li> Na 1 uur incubatie, verwijder de media die geïnfecteerde U2OS cellen. Samen 2X DMEM, 20% FBS en gebruik 2 ml van dit mengsel aan elke well van de geïnfecteerde cellen U2OS cover: mix 1:01 volumes van 3% CMC. </li><li> Leg cellen in een 37 graden 5% CO 2 vochtige incubator voor een ander 48 uur. </li><li> Na 48 uur, voeg 2 ml methanol-azijnzuur fixatief op de top van de CMC overlay in elk putje en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in een celcultuur kap. </li><li> Gooi de vaste overlay en was rest off van de putten gebruik van leidingwater. </li><li> Vlekken op de vaste U2OS cellen met 2 ml van een Coomassie blauwe oplossing per putje en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op lage snelheid op een bord shaker. </li><li> Haal de Coomassie vlek van de putten en spoel de platen met behulp van leidingwater. Laten drogen met deksel af voor ongeveer een uur. </li><li> De resulterende virale plaques kan eenvoudig worden gevisualiseerd in figuur 2C. Platen kunnen onbeperkt worden bewaard in dit stadium. </li><li> Tel plaques op de verdunning stap waar tussen 10 en 100 plaques zichtbaar zijn. </li><li> Vermenigvuldig het aantal plaques geteld door de gebruikte verdunning en vermenigvuldig het resulterende getal met 2 tot een titer in PFU / ml te geven. Bijvoorbeeld, als 25 plaques worden meegeteld in de put, waar een miljoen-voudige verdunning werd gebruikt, de titer van de initiële onverdunde monster wordt 25 vermenigvuldigd met 1 miljoen vermenigvuldigd met 2 of 50 miljoen PFU / ml. Verder dit nummer in eerste instantie te delen door het gewicht te meten om het monster titers rapport PFU / g </li></ol> 6. Representatieve resultaten: Om nauwkeurig te kunnen bepalen of een chirurgisch verkregen normaal / tumorweefsel monster is of niet is geïnfecteerd met een virus, moet men eerst voor zorgen dat het weefsel monster wordt op zijn minst levensvatbaar is. Fig. 1A laat zien dat levensvatbaarheid ervan kan worden beoordeeld met behulp van een metabole kleurstof (Alamar blauw) en dat zowel de normale en tumor weefsel kan metabolisch actief blijven gedurende een periode van ten minste 72 uur. Dit suggereert dat weefsel gekweekte ex vivo kunnen ondersteunen virale replicatie. Een belangrijk voordeel van oncolytische virussen is dat ze kunnen worden gemanipuleerd om therapeutische of imaging transgenen uit te drukken. Fig. 2D-E laat zien dat GFP of Luciferase kan worden gedetecteerd uit de weefsels geïnfecteerd ex vivo, verder ondersteunen dat deze weefsels zijn levensvatbaar en ook geïnfecteerd. Hoewel de verhoogde transgen expressie is over het algemeen geassocieerd met virale replicatie, is het niet noodzakelijkerwijs gelijk aan een productieve virale levenscyclus die leidt tot zelf-versterking en de verspreiding, waarvan men denkt belangrijk te zijn voor therapeutische activiteit. Om deze reden is het noodzakelijk om te bepalen of meer virus wordt geproduceerd dan wat werd gebruikt om in eerste instantie infecteren het weefsel. Fig 2B toont dat bij virale kwantificering van plaque assay, meer virus wordt verkregen na 72 uur infectie dan weefsel verzameld direct na de infectie. Het geheel genomen, deze gegevens laten zien dat chirurgisch weggesneden tumor weefsel kan mogelijk blijven in cel cultuur voor een periode van ten minste 72 uren, gedurende welke tijd de virale replicatie kan worden ondersteund. <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Overzicht van de weefsel bemonstering / snijden protocol. Weefsel wordt verwerkt door het verwijderen van een aantal 2 mm cores die vervolgens zijn onderverdeeld in vier kwart, die willekeurig zijn verdeeld in putten A1-A4. De kleurcodes geven de reagentia die worden gebruikt in elk putje. De grijs-schaduwrijke pleinen binnen de putjes zijn elk kwartaal van de zes afgebeelde afzonderlijke kernen. Het weefsel in een goed A1 wordt overgedragen aan een nieuwe put (C1) met de media na de eerste Alamar blauwe lezen. Een tweede lezing wordt gedaan aan het eind van de 72 uur incubatie met virussen. Wells A4 en B4 worden aangevuld met Luciferine na de 72 uur incubatie post-infectie <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Levensvatbaarheid en infectability van de patiënt weefselmonsters. A) Tissue levensvatbaarheid zoals gemeten door Alamar blauw signaal op 2 uur en 72 uur na collectie. Y-as staat voor de blanco gecorrigeerde Alamar blauw signaal. B) titer van vaccinia virusverzameld per gram van weefselmonsters 2 en 72 uur na de infectie. C) Voorbeeld van vaccinia virus plaques op U2OS cellen na Coomassie kleuring. D) luminescentiesignaal verkregen van de patiënt VV-luciferase-geïnfecteerd weefsel beeld gebracht met behulp van IVIS. E) Fluorescentie microscopie foto's van de patiënt weefselmonster geïnfecteerd met VV-GFP.

<ol><li>Parato, K. A., Senger, D., Forsyth, P. A., Bell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+battle+between+oncolytic+viruses+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the battle between oncolytic viruses and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 5, 965-976 (2005).</li>
<li>Renouf, L. C., Thway, K., Sibtain, A., McNeish, I. A., Newbold, K. L., Goldsweig, H., Coffin, R., Nutting, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I%2FII+study+of+oncolytic+HSV+GM-CSF+in+combination+with+radiotherapy+and+cisplatin+in+untreated+stage+III%2FIV+squamous+cell+cancer+of+the+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Phase I/II study of oncolytic HSV GM-CSF in combination with radiotherapy and cisplatin in untreated stage III/IV squamous cell cancer of the head and neck.</a> Clin Cancer Res. 16, 4005-4015 (2010).</li>
<li>Lal, R., Harris, D., Postel-Vinay, S., de Bono, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reovirus%3A+Rationale+and+clinical+trial+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Reovirus: Rationale and clinical trial update.</a> Curr Opin Mol Ther. 11, 532-539 (2009).</li>
<li>Park, B. H., Hwang, T., Liu, T. C., Sze, D. Y., Kim, J. S., Kwon, H. C., Oh, S. Y., Han, S. Y., Yoon, J. H., Hong, S. H., Moon, A., Speth, K., Park, C., Ahn, Y. J., Daneshmand, M., Rhee, B. G., Pinedo, H. M., Bell, J. C., Kirn, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+targeted+oncolytic+poxvirus%2C+JX-594%2C+in+patients+with+refractory+primary+or+metastatic+liver+cancer%3A+a+phase+I+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial.</a> Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).</li>
<li>Breitbach, C. J., Reid, T., Burke, J., Bell, J. C., Kirn, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+the+clinical+development+landscape+for+oncolytic+viruses+and+other+cancer+therapeutics%3A+no+shortcuts+on+the+road+to+approval.+Cytokine+Growth+Factor+Rev%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Navigating the clinical development landscape for oncolytic viruses and other cancer therapeutics: no shortcuts on the road to approval. Cytokine Growth Factor Rev.</a> 21, 85-89 (2010).</li>
<li>Boeuf, F. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+interaction+between+oncolytic+viruses+augments+tumor+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Synergistic interaction between oncolytic viruses augments tumor killing.</a> Mol Ther. 18, 888-895 (2010).</li>
<li>Silva, N. D. e, Atkins, H., Kirn, D. H., Bell, J. C., Breitbach, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+trouble+for+tumours%3A+exploiting+the+tumour+microenvironment+to+enhance+anticancer+effect+of+oncolytic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Double trouble for tumours: exploiting the tumour microenvironment to enhance anticancer effect of oncolytic viruses.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21, 135-141 (2010).</li>
<li>Diallo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+pharmacoviral+approach+identifies+novel+oncolytic+virus+sensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers.</a> Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).</li>
<li>Cooke, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-tumour+genetic+heterogeneity+and+poor+chemoradiotherapy+response+in+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intra-tumour genetic heterogeneity and poor chemoradiotherapy response in cervical cancer.</a> Br J Cancer. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Pennington, K., Chu, Q. D., Curiel, D. T., Li, B. D. L., Mathis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Utility+of+a+Tissue+Slice+Model+System+to+Determine+Breast+Cancer+Infectivity+by+Oncolytic+Adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">The Utility of a Tissue Slice Model System to Determine Breast Cancer Infectivity by Oncolytic Adenoviruses.</a> J Surg Res. , 1-6 (2010).</li>
<li>Hochberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropism+of+herpes+simplex+virus+type+1+to+non-melanoma+skin+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Tropism of herpes simplex virus type 1 to non-melanoma skin cancers.</a> Br J Dermatol. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Kuip, H. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> BMC Cancer. 6, 86-86 (2006).</li>
</ol>

Een van de kritische stappen in dit protocol is het verkrijgen van verse weefselmonster. Als het monster wordt in celcultuur na een lange wachttijd op de operatiekamer in een ongeschikte media (bijv. PBS), kan dit compromis levensvatbaarheid van het weefsel en het voorkomen van infectability. Van de nota, normale weefsel is inherent gevoeliger voor deze effecten dan de tumor weefsel. Een ander kritisch punt is hoeveel cores worden gebruikt om het weefsel en de consistentie van hun grootte steekproef. Inconsistenties in omvang zal leiden tot variabiliteit tussen patiënten monsters, omdat factoren zoals weefselhypoxie en infectectable oppervlakte zal fluctueren afhankelijk van de grootte van de kernen en de kern kwartalen. Hoewel dit kan gedeeltelijk worden opgelost door met behulp van weefsel snijmachines, een voordeel van de hier gepresenteerde methode is dat het relatief eenvoudig is, minder vatbaar voor besmetting, en breed toepasbaar op een verscheidenheid van weefsels soorten, waaronder zachte of viskeuze weefsels die niet gemakkelijk vatbaar aan weefsel snijden. Met name kan het aantal cores worden verhoogd om een ​​betere vertegenwoordiging weefsel te krijgen. Ook kan de kernen worden gesneden in meer stukken (bijv. 5-8) naar andere potentiële assays geschikt voor parallel worden uitgevoerd, zoals DNA, RNA of eiwit extractie. Echter, het aantal stuks, waarin de kernen kan worden teruggebracht tot reproduceerbare maten zijn afhankelijk van de werkelijke grootte van de kernen, die kan worden aangepast door gebruik te maken van verschillende grootte corers. Optioneel, een manier om hulp te verkrijgen reproduceerbaar grote weefsel stukken is om zelfs de lengte van de kernen met behulp van een liniaal voorafgaand aan verdere onderverdeling ze in kleinere stukken. Het protocol kan natuurlijk aangepast worden om andere virussen te vangen en we hebben gemerkt dat weefsels kunnen levensvatbaar is en de ondersteuning replicatie voor maximaal 6 dagen. Het protocol kan verder worden uitgebreid tot metingen van andere viraal uitgedrukt transgenen inclusief cytrokines. Na infectie, kunnen weefsels ook worden ingebed in paraffine voor verdere snijden en vlekken door immunohistochemische methoden, die zorgt voor een verdere verfijning van het weefsel histologie en de manier waarop deze betrekking heeft op virale infectie 10-12.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> Hoge glucose DMEM </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td> NorthBio Inc </td><td> NBSF-701 </td><td></td></tr><tr><td> Amphothericin B-oplossing </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A2942 </td><td> Gebruik op 0,1% </td></tr><tr><td> Pennicilin-Streptomycine </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P4333 </td><td> Gebruik bij 1% </td></tr><tr><td> Alamar Blue </td><td> Invitrogen </td><td> DAL1025 </td><td></td></tr><tr><td> D-Luciferine kaliumzout </td><td> Molecular Imaging Products </td><td> D-Luciferine kaliumzout 1g </td><td> Resuspendeer in PBS bij 10 mg / ml en filter op 0,22 urn filter </td></tr><tr><td> MEM poeder </td><td> Gibco </td><td> # 41500018 </td><td> Maak in de helft van de voorgestelde volume 2X MEM en filter voor te maken op 0,22 um filter te gebruiken </td></tr><tr><td> Carboxymethylcellulose (CMC) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C9481 </td><td> Maak een oplossing van 3% in gedeïoniseerd water en autoclaaf. Merk op dat poeder kan enige tijd opnieuw in suspensie te nemen </td></tr><tr><td> Coomassie Brilliant Blue R </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B7920 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mm Biopsie punch </td><td> Miltex </td><td> MX-33-31 </td><td></td></tr><tr><td> Double Edge Prep Blades </td><td> Personna Medical Care </td><td> 74-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescentie disection Microscoop </td><td> Leica </td><td> model M205 FA </td><td></td></tr><tr><td> In vivo beeldvorming systeem (IVIS) </td><td> Remklauw Life Sciences </td><td> IVIS ® 200-serie </td><td></td></tr><tr><td> Tissue Tearor </td><td> Biospec producten </td><td> model 985370-395 </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo infectie van levend weefsel met oncolytische virussen

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytische Virussen (OVS) zijn nieuwe therapieën die selectief repliceren in en doden tumorcellen 1. Verschillende klinische studies ter beoordeling van de effectiviteit van een verscheidenheid van platforms, waaronder oncolytische HSV, reovirus, en Vaccinia OVS als behandeling voor kanker zijn momenteel 2-5. Een belangrijk kenmerk van oncolytische virussen is dat ze kunnen genetisch worden gemodificeerd om reporter transgenen die het mogelijk maakt te visualiseren de infectie van weefsels door microscopie of bio-luminescentie beeldvorming 6,7 uit te drukken. Dit biedt een uniek voordeel, omdat het mogelijk is om weefsels van patiënten ex vivo te infecteren voorafgaand aan de behandeling om de kans op een succesvolle oncolytische virotherapy 8 vast te stellen. Daartoe is het essentieel om adequaat te weefselmonster om te compenseren voor weefsel heterogeniteit en beoordelen van levensvatbaarheid van het weefsel, in het bijzonder voorafgaand aan de infectie 9. Het is ook belangrijk om te volgen met behulp van virale replicatie reporter transgenen als uitgedrukt door de oncolytische platform alsmede door directe titratie van weefsels na homogenisatie om onderscheid te maken tussen mislukte en productieve infectie. Het doel van dit protocol is het aanpakken van deze kwesties en hierin beschrijft een. De bemonstering en de bereiding van de tumor weefsel voor celkweek 2. De beoordeling van de levensvatbaarheid van het weefsel met behulp van de metabole kleurstof Alamar blauw 3. Ex vivo infectie van gekweekte weefsels met vaccinia virus dat zich GFP of vuurvliegluciferase 4. Detectie van transgenexpressie door middel van fluorescentie microscopie of met behulp van een in vivo Imaging System (IVIS) 5. Kwantificering van het virus door plaque assay. Deze uitgebreide methode biedt diverse voordelen, waaronder het gemak van de verwerking van weefsel, de vergoeding voor weefsel heterogeniteit, controle van de levensvatbaarheid van het weefsel, en discriminatie tussen de mislukte besmetting en het bot fide virale replicatie.

Oncolytische virussen zijn veelbelovend voor kankertherapieën. De mogelijkheid om de infectability van levende weefselmonsters van patiënten voorafgaand aan de behandeling vast te stellen is een uniek voordeel van deze therapeutische aanpak. Dit protocol beschrijft hoe te verwerken weefsels voor<em&gt; Ex vivo</em&gt; Infectie met oncolytische virus en de daaropvolgende virale kwantificering.

Ex Vivo Infectie van levend weefsel met oncolytische Virussen

Oncolytische virussen (OV's) zijn nieuwe therapeutica die selectief repliceren in tumorcellen en deze doden1. Verschillende klinische studies die de effectiviteit evalueren ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het observeren van de replicatie van het oncolytische vacciniavirus in verse weefsels die na een chirurgische ingreep zijn verkregen. Dit wordt bereikt door weefselmonsters te nemen voor celkweek om bias door weefselheterogeniteit te minimaliseren. Als tweede stap wordt de levensvatbaarheid van het weefsel beoordeeld, wat de kwaliteit van het startmateriaal waarborgt voorafgaand aan de infectie met het virus.Vervolgens wordt de genexpressie van de virale trend gemonitord en worden de virale titers bepaald. Om vast te stellen of het levende chirurgische specimen een productieve vaccinia-infectie kan ondersteunen, worden resultaten verkregen die vaccinia-replicatie in weefsels aantonen op basis van de observatie van fluorescent eiwit- of bioluminescentie-reporterexpressie en een toename van de virale titer in de loop van de tijd.Hallo, ik ben Jean Simone Diallo. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van kanker, omdat ze kunnen leiden tot de identificatie van patiënten die mogelijk zeer geschikt zijn voor een behandeling met oncolytische virussen. Hallo, ik ben Naomi.Deze methode kan inzicht bieden in de infectiecapaciteit van tumorweefsels met behulp van het oncolytische vacciniavirus. Het kan ook worden toegepast op andere oncolytische virussen, zoals het vesicular stomatitis virus, en waarschijnlijk ook op andere virussen zoals het herpes simplex virus, adenovirus en Rio-virus met kleine aanpassingen. Hallo, ik ben Dominic.Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het weefsel lastig reproduceerbaar te ponsen kan zijn en het snijden van de cilinders in kleine, gelijkmatige stukjes een uitdaging kan vormen. Hallo, ik ben John Bell. De procedure van vandaag zal worden gedemonstreerd door twee bekwame promovendi in mijn lab, Naomi DeSilva en Dominic Wa. Zij worden bijgestaan door Derek Butterwick, een AIOS van het Ottawa Hospital. Werk in de laminaire flowcel-kweekkap. Gebruik een biopsiepunch van 2 mm om weefselcilinders te verkrijgen uit verschillende regio's van het weefselmonster.Plaats elke kern met behulp van een pipet in het deksel van een omgekeerde Petrischaal met PBS en gebruik een pincet om het monster indien nodig bij te stellen. Laat voldoende ruimte tussen elke kern zodat deze gemakkelijk langs de horizontale as gesneden kunnen worden. Gebruik een gesteriliseerd scheermesje om elke weefselkern in vier gelijke kwartieren te splitsen.Gebruik vervolgens een pipetpunt om elk kwart in vier afzonderlijke putjes van een 24-wells plaat te plaatsen die twee milliliters medium bevatten. Herhaal dit proces voor elk kwart van een tweede kern en plaats deze kwarten in dezelfde vier putjes van de 24-wells plaat. Ga op deze wijze verder totdat alle weefselkernen zijn geplaatst.Zodra alle weefselbiopten in de putjes zijn geplaatst, voegt u 25 µL alamar blue toe aan een van de putjes met weefsel en aan een controleputje, en incubeert u dit gedurende ten minste één uur bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Nadat de incubatietijd is verstreken, neemt u drie aliquoten van 100 µL uit elk met alamar blue behandeld putje en plaatst u deze in afzonderlijke putjes van een 96-wells plaat. Herhaal dit met nog twee aliquoten van 100 µL uit dezelfde putjes.Lees het alamar blue-signaal af met een fluorescentieplaatlezer en noteer de gegevens. Gebruik een pipetpunt om elk stuk weefsel vanuit de wells die behandeld zijn met alamar blue over te brengen naar een clean media containing well van de 24-wellplaat. Vermijd het overdragen van grote hoeveelheden medium samen met het monster.Infect vervolgens een van de putjes met weefsel door zes plaque-vormende eenheden van GFP-expresserend vacciniavirus, gedilueerd in 25 µL medium, toe te voegen. Infecteer vervolgens een ander putje met zes plaque-vormende eenheden van luciferase-expresserend vacciniavirus. Incubeer de plaat 72 uur na infectie bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.Voeg 25 µL alamar blue toe aan het eerder geanalyseerde monster. Incubeer gedurende één uur bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Neem vervolgens drie monsters van 100 µL en analyseer deze met een fluorescentieplaatlezer zoals eerder beschreven.Aspireer eerst het medium uit de putjes die behandeld zijn met het GFP-expresserende vacciniavirus en was deze tweemaal met PBS direct in het putje. Maak vervolgens met een dissectiemicroscoop met fluorescentiemogelijkheid een fasecontrastopname van het weefselstuk bij een geschikte resolutie van 40x.Schakel vervolgens over naar de fluorescentiemodus en gebruik een filter dat geschikt is voor GFP. Visualiseer de GFP-expressie in het met GFP getransduceerde weefsel. Gebruik tot slot een fluorescentiefilter voor een andere golflengte die zo ver mogelijk verwijderd is van die van het transgene product van belang.Maak vervolgens een foto van de achtergrondfluorescentie. Verzamel daarna de weefselstukjes met behulp van pipetpunten. Weeg het weefsel.Deze meting zal worden gebruikt om de titer van het virus in vormende eenheden per gram aan het einde van de procedure te berekenen. Bewaar het weefsel bij -80 °C voor toekomstige titering. Pipetteer 5 µL van een 10 mg/mL Lucifer-substraat in de well die is getransduceerd met luciferase-expresserend vacciniavirus en in een well die alleen weefselkweekmedium bevat. Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Plaats de plaat in het in vivo beeldsysteem en stel de belichtingstijd in op vijf seconden. Maak een foto van de wells die zijn getransduceerd met het luciferase-expresserende vacciniavirus. Herhaal de procedure met een kortere belichtingstijd als het beeld verzadigd lijkt, of gebruik een langere belichtingstijd als er geen signaal wordt waargenomen.Bereid een plaat met zes wells voor met 1 miljoen levende U2 OS-cellen per well in volledig medium en incubeer deze overnight in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% carbon dioxide, zodat de wells de volgende dag een confluentie van 95% bereiken. Pak de eerder gewogen geïnfecteerde weefselmonsters erbij. Breng de monsters over naar een polystyreen centrifugebuis met een ronde bodem van vijf milliliter en voeg één milliliter PBS toe.Gebruik een weefselhomogenisator om het weefsel te homogeniseren en de virusdeeltjes vrij te maken. Maak vervolgens seriële verdunningen 1 op 10 van de virale suspensie van het weefselhomogenaat in serumvrij medium door 100 µL van de virale suspensie van het weefselhomogenaat over te brengen naar 900 µL serumvrij medium en dit indien nodig te herhalen. Aspireer vervolgens het medium uit de six-wellplaat met de U2 OS-cellen.Pipetteer 500 µL van elke seriële verdunning in een well van de plaat. Plaats de plaat gedurende één uur terug in de weefselkweekincubator en schud de platen elke 15 minuten voorzichtig om uitdroging van de cellen tijdens de incubatie te voorkomen. Warm een fles 2× DMEM met 20% FBS en een aliquot 3% CMC-oplossing op in een waterbad van 37 °C. Maak na het opwarmen een één-op-één mengsel van 3% CMC en 2× DMEM plus 20% FBS om een uiteindelijke concentratie van 1,5% CMC en 10% FBS te bereiken.Na de incubatie wordt het medium van de U2 OS-cellen afgezogen en vervangen door twee milliliters van het 1,5%CMC 10%F-B-S-D-M-E-M-mengsel per well; plaats de plaat vervolgens voor nog eens 48 uur terug in de weefselkweekincubator. Na 48 uur worden twee milliliters methanol-azijnzuurfixeerder toegevoegd aan het CMC-mediummengsel in elke well, waarna de plaat 10 minuten bij kamertemperatuur in de weefselkweekkap wordt geïncubeerd.Zodra de incubatietijd is verstreken, wordt de oplossing uit elke put afgezogen. Spoel elke put met kraanwater om eventuele resterende fixeerder te verwijderen. Pipetteer vervolgens twee milliliters kumasi blue-oplossing in elke put.Plaats de plaat vervolgens op een schudplatform en incubeer deze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur terwijl er op lage snelheid wordt geschud. Aspireer de Coomassie Blue-oplossing uit de putjes en spoel deze af met kraanwater. Laat de onafgedekte plaat ongeveer een uur in de zuigkast drogen. Tel de virale plaques bij de verdunningsstap waarbij tussen de 10 en 100 plaques zichtbaar zijn.Vermenigvuldig het aantal getelde plaques met de gebruikte verdunningsfactor en vermenigvuldig het resulterende getal vervolgens met twee om een titer in plaque-vormende eenheden per milliliter te verkrijgen. Deel dit getal vervolgens door het aanvankelijk gemeten gewicht van het monster om dit uit te drukken in plaque-vormende eenheden per gram. Deze grafiek illustreert de weefsellevensvatbaarheid, gemeten aan de hand van de signaalintensiteit van alma blue na twee uur en 72 uur na afname, en laat zien dat zowel normaal weefsel als tumorweefsel gedurende een periode van ten minste 72 uur metabolisch actief kan blijven.Deze representatieve gegevens tonen de hoeveelheid vacciniavirus verzameld per gram weefselmonster op twee en 72 uur na infectie. Dit geeft aan dat het virus een productieve virale levenscyclus doorloopt die leidt tot zelfamplificatie en verspreiding. Deze afbeelding illustreert een typisch luminescentiesignaal verkregen van vacciniavirus van een patiënt.Met luciferase geïnfecteerde weefselmonsters afgebeeld met behulp van het in vivo beeldsysteem. Gebieden met intense luminescentie verschijnen rood volgens de luminescentieschaalbalk aan de rechterkant; een vergelijking van de fasecontrast- en GFP-kanaal fluorescentiemicroscopiebeelden demonstreert de proportie van het weefsel die is getransduceerd door vaccinia virus GFP. De afwezigheid van signaal in het rode kanaal duidt op de specificiteit van het fluorescentiesignaal.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om vers weefsel te gebruiken en, na deze procedure, zo representatief mogelijke gebieden ervan te bemonsteren. Andere methoden, zoals weefselfixatie, immunohistochemie en DNA- of RNA-extracties, kunnen in plaats van titreren worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals: welke specifieke weefselstructuren worden door het virus geïnfecteerd en wat is de impact van het virus op de genexpressie? Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe we monsters verwerken voor ex vivo infecties met het vacciniavirus en hoe we de verspreiding van het virus volgen via de expressie van GFP- of luciferase-transgenen.En tot slot: hoe we een virus uit procesmonsters titreren. Vergeet niet dat het werken met levende virussen gevaarlijk kan zijn, afhankelijk van de stam, en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen tijdens deze procedure, zoals het dragen van handschoenen en het werken in een geschikte laminaire flow-kast.

ex-vivo-infection-of-live-tissue-with-oncolytic-viruses

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Dit artikel beschrijft de cultuur van de patiënt weefsel plakjes voor genafgifte studies en daaropvolgende analyse van genexpressie met behulp van IVIS bioluminescentie beeldvorming.

Ex Vivo Cultuur van de patiënt Tissue &amp; Onderzoek van Gene Delivery

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the propagation and harvesting of oncolytic herpes simplex virus in mammalian cell cultures, highlighting viral entry, replication, and the recovery of virus-loaded cells. It further shows methods for preserving infected cells for downstream processing.

Propagation and Harvesting of Oncolytic Herpes Simplex Virus in Mammalian Cells

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the purification of an oncolytic virus from infected mammalian cell cultures using nuclease treatment, sequential centrifugation, membrane filtration, and sucrose cushion centrifugation.

 Oncolytic Virus Purification from Infected Mammalian Cells 

Opgericht kanker cellijnen en xenograften hebben de steunpilaar van het onderzoek naar kanker in de afgelopen paar decennia. Echter, recente gegevens blijkt dat de therapeutische respons sterk wordt beïnvloed door de tumorcel micromilieu. Daarom hebben wij een ex vivo analyse van de primaire tumor specimens geneesmiddelontwikkeling doeleinden ontwikkeld.

Ex vivo behandeling Reactie van primaire tumoren en / of geassocieerde Metastasen voor preklinische en klinische ontwikkeling van Therapeutics

Kattestaartje zijn uiterst prikkelbaar en hebben een sterke vlucht-of-vechtreactie. Er wordt een hanteringsmethode beschreven die is geoptimaliseerd om de stress van de dieren te verminderen, waardoor kattestaartje toegankelijker worden als preklinisch model.

Het hanteren van de Cotton Rat in Studies voor de Pre-klinische evaluatie van Oncolytic Virussen

Oncolytische virotherapieën zijn in ontwikkeling als nieuwe therapieën voor de behandeling van hepatocellulair carcinoom (HCC). Hier beschrijven we een methode voor locoregionale therapie van HCC via hepatische arteriële toediening van oncolytisch virus.

Transarterial Toediening van Oncolytic Virussen voor Locoregionale Therapie van Orthotope HCC in Ratten

Hier beschrijven we een protocol voor de toepassing van high-throughput RNAi screening te ontdekken van de doelen van de gastheer die kunnen worden gemanipuleerd om het verbeteren van oncolytische virus therapie, specifiek rhabodvirus en vaccinia virus therapie, maar het kan gemakkelijk aangepast worden aan andere oncolytische virus platformen of voor het ontdekken van host-genen die virus replicatie in het algemeen moduleren.

Genoom-brede RNAi Screening factoren te identificeren Host die moduleren van oncolytische Virus therapie

Infectie van menselijke weefsels met humaan immunodeficiëntie virus (HIV) ex vivo biedt een waardevolle 3D-model van virus pathogenese. Hier beschrijven we een protocol voor het verwerken en infecteren van weefsel monsters van menselijke amandelen en vrouwelijke genitale mucosae met HIV-1 en onderhouden ze in cultuur in de vloeistof-lucht-interface.

Ex Vivo Infectie van menselijke lymfoïde weefsels en vrouwelijke genitale Mucosa met Humaan Immunodeficiëntie Virus 1 en Histoculture

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde workflow voor de generatie en ex vivo karakterisering van oncolytische virussen voor expressie van immunomodulators, met behulp van mazelen virussen bispecifieke T cel engagers codering als een voorbeeld. Toepassing en aanpassing aan andere vector platforms en transgenen zal de ontwikkeling van nieuwe immunovirotherapeutics voor klinische vertaling versnellen.

Paramyxovirussen voor Tumor-gerichte immunomodulatie: ontwerp en evaluatie Ex Vivo

Dit protocol beschrijft het proces van het genereren en karakteriseren van muis urotheliale organoïden die deleties in genen van belang herbergen. De methoden omvatten het oogsten van muizenurotheelcellen, ex vivo transductie met adenovirus dat Cre-expressie drijft met een CMV-promotor, en zowel in vitro als in vivo karakterisering.

Ex Vivo Organoïde model van Adenovirus-Cre gemedieerde gendeleties in muizen urotheelcellen

Leer ex vivo infectie van vers weefsel met oncolytische vaccinia virus om infecteerbaarheid te beoordelen. Deze methode omvat viabiliteitsmeting en monitoring van virale replicatie via fluorescentie en bioluminescentie.

Ex Vivo Infectie van levend weefsel met oncolytische Virussen

Meer video's verkennen