Name: Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: Leer concurrerende genomische schermen van streepjescode gistbibliotheken voor gen-drug interactiestudies met Candida albicans. Deze methode maakt hoogdoorvoeranalyse van duizenden mutanten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Ron Davis, Adam Deutschbauer, en de hele HIP HOP laboratorium aan de Universiteit van Toronto voor discussies en advies. CN wordt ondersteund door subsidies van de National Human Genome Research Institute (Grant Number HG000205), RO1 HG003317, CIHR MOP-84305, en de Canadese Cancer Society (# 020380). JO werd gesteund door de Stanford Genome Training Program (Grant Aantal T32 HG00044 van de National Human Genome Research Institute) en de National Institutes of Health (Grant Number P01 GH000205). GG wordt ondersteund door de NHGRI RO1 HG003317 en de Canadese Cancer Society, Grant # 020380, TD en de Donnelly Sequencing Centre wordt gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de Canadese Stichting voor Innovatie aan Drs. Brenda Andrews en Jack Greenblatt. AMS wordt ondersteund door een universiteit van Toronto Open Fellowship.

<ol><li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li>
<li>Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0008-2006.0008 (2006).</li>
<li>Claus, H., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+hotspot+for+transformation+of+Neisseria+meningitidis+by+shuttle+mutagenesis+using+signature-tagged+transposons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of a hotspot for transformation of Neisseria meningitidis by shuttle mutagenesis using signature-tagged transposons.</a> Mol Gen Genet. 259, 363-371 (1998).</li>
<li>Hava, D. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+serotype+4+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors.</a> Molecular microbiology. 45, 1389-1406 (2002).</li>
<li>Costanzo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetic+Landscape+of+a+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genetic Landscape of a Cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Pan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+toolkit+for+functional+profiling+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">A robust toolkit for functional profiling of the yeast genome.</a> Molecular cell. 16, 487-496 (2004).</li>
<li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+Function+and+Organization+of+the+Yeast+Early+Secretory+Pathway+through+an+Epistatic+Miniarray+Profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the Function and Organization of the Yeast Early Secretory Pathway through an Epistatic Miniarray Profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Deutschbauer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+haploinsufficiency+revealed+by+genome-wide+profiling+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast.</a> Genetics. 169, 1915-1925 (2005).</li>
<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenomic+profiling%3A+identifying+the+functional+interactions+of+small+molecules+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemogenomic profiling: identifying the functional interactions of small molecules in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 793-798 (2004).</li>
<li>Lum, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li>
<li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+TagModule+collection+for+parallel+genetic+analysis+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">A universal TagModule collection for parallel genetic analysis of microorganisms.</a> Nucleic acids research. 38, e146-e146 (2010).</li>
<li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+annotation+and+drug+target+discovery+in+Candida+albicans+with+a+tagged+transposon+mutant+collection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Gene annotation and drug target discovery in Candida albicans with a tagged transposon mutant collection.</a> PLoS pathogens. 6, (2010).</li>
<li>Nislow, C., Giaever, G. Chapter 387. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNislow%2C+C+%22Yeast+Gene+Analysis%22">Yeast Gene Analysis</a>. Stark, I., Stansfields, M. J. R. , 2nd Edition, Elsevier Ltd. 387-414 (2007).</li>
<li>Pierce, S. E., Davis, R. W., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+barcoded+Saccharomyces+cerevisiae+gene-deletion+mutants+in+pooled+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of barcoded Saccharomyces cerevisiae gene-deletion mutants in pooled cultures.</a> Nature protocols. 2, 2958-2974 (2007).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. Cold Spring Harbor Laboratory. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd. edn, Cold Spring Harbor Laboratory. (2001).</li>
<li>Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phenotyping+via+deep+barcode+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative phenotyping via deep barcode sequencing.</a> Genome Res. , (2009).</li>
<li>Hamady, M., Walker, J. J., Harris, J. K., Gold, N. J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error-correcting+barcoded+primers+for+pyrosequencing+hundreds+of+samples+in+multiplex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Error-correcting barcoded primers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex.</a> Nature. 5, 235-237 (2008).</li>
<li>Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-Level+Analysis+of+Genes+and+Functions+Affecting+Survival+During+Nutrient+Starvation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">System-Level Analysis of Genes and Functions Affecting Survival During Nutrient Starvation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 187, 299-317 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Hier hebben we aangegeven een protocol dat, met een bescheiden wijziging, gemakkelijk kan worden aangepast aan een breed scala van bestaande collecties van de barcode mutant verzamelingen van verschillende micro-organismen om gecodeerde mutant collecties aan te maken. We benadrukken dat terwijl we hebben gemeld een protocol over de gelabelde transposon mutagenese voor de pathogene gist C. albicans, een zeer gelijkaardig protocol kan worden aangepast aan een breed scala van eencellige schimmels. Gewijzigd, dit protocol werkt goed in bacteriën 13, en momenteel collecties voor een aantal extra schimmel-en bacteriële genoom van zijn in aanbouw. Op dit moment is deze test biedt de enige uitgebreide, genoom-brede onpartijdige scherm voor gen-kleine molecule interacties. Een bijzonder aantrekkelijke eigenschap van de test is dat er geen voorkennis van het gen of kleine molecule is vereist. Despite de omvang en kracht van deze testen, is hun overdraagbaarheid naar andere laboratoria werden enigszins gehinderd door de investering en de informatica-instrumenten voor de analyse van de resultaten. Met de goedkeuring van een volgende generatie opeenvolging uitlezing in combinatie met krachtige tools voor analyse, verwachten we de goedkeuring ervan te verhogen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Antibiotica </td><td> Verkoper en catalogusnummers </td></tr><tr><td> Carbenicilline </td><td> Sigma, part # C1613 </td></tr><tr><td> Kanamycine </td><td> Sigma, part # K1876 </td></tr><tr><td> spectinomycine </td><td> Sigma, part # S0692 </td></tr><tr><td> Chlooramfenicol </td><td> Sigma, part # C0378 </td></tr><tr><td> DNA Clean-up en concentratie kits </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep Spin Miniprep Kit </td><td> Qiagen, onderdeel # 27106 </td></tr><tr><td> HiSpeed ​​Plasmid Maxi Kit </td><td> Qiagen, onderdeel # 12663 </td></tr><tr><td> QIAquick PCR Purification Kit </td><td> Qiagen, onderdeel # 28106 </td></tr><tr><td> QIAquick Gel Extraction Kit </td><td> Qiagen, onderdeel # 28704 </td></tr><tr><td> PCR en electroforese reagentia </td><td></td></tr><tr><td> Taq DNA-polymerase (Mg-vrij) Buffer </td><td> New England Biolabs, part # M0320L </td></tr><tr><td> Deoxynucleotide oplossing te mengen </td><td> New England Biolabs, part # N0447L </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl 2 </td><td> Sigma, part # 63036 </td></tr><tr><td> Agarose, laden kleurstof, en nucleïnezuur vlek die geschikt zijn voor gel-elektroforese </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> 10X TAE buffer </td><td> Sigma, part # T8280 </td></tr><tr><td> 1 Kb Plus DNA Ladder </td><td> Invitrogen, part # 10787026 </td></tr><tr><td> YPD bouillon </td><td></td></tr><tr><td> 10 g gistextract </td><td> Sigma, part # Y1625 </td></tr><tr><td> 20 g Bacto pepton </td><td> BD Biosciences, part # 211677 </td></tr><tr><td> 20 g dextrose </td><td> Sigma, part # D9434 </td></tr><tr><td> Labware </td><td></td></tr><tr><td> Meerkanaalspipetten (1000, 200, en 20 pi) </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> Wegwerp pipetteren reservoirs </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> 15 en 50 ml centrifugebuizen </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> 96 - en 384-Well Deep Well Platen </td><td> Axygen Scientific, part # P-2 ml-SQ-CS &amp; P-384240SQCS </td></tr><tr><td> 96-well-en 384-wells PCR-platen en afdichting film </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> Plaat roller voor het afdichten van multi-well platen </td><td> Sigma, part # R1275 </td></tr><tr><td> 30 ° C en 37 ° C schudden incubators voor het kweken van bacteriën en gist op platen en in tubes </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> In vitro transposon mutagenese </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Tn5 transposase </td><td> Epicentre Biotechnologie, part # TNP92110 </td></tr><tr><td> High-throughput transformatie </td><td></td></tr><tr><td> Seqprep 96 HT Plasmid Prep Kit </td><td> Edge Biosystems, onderdeel # 84359 </td></tr><tr><td> polyethyleenglycol, moleculair gewicht 3350 </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> lithium-acetaat </td><td> Sigma, part # 517992 </td></tr><tr><td> 6-well platen, steriel </td><td> Corning, part # 3335 </td></tr><tr><td> 50 mg / ml uridine </td><td> Sigma, part # U3750 </td></tr><tr><td> 100X Tris-EDTA-buffer-oplossing </td><td> Sigma, part # T9285 </td></tr><tr><td> 1X TE/0.1M LiOAc </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> zalm testis DNA </td><td> Sigma, part # 1626 </td></tr><tr><td> Groei van de barcode collecties </td><td></td></tr><tr><td> 48-wells-platen, als de groei culturen in platen </td><td> Greiner, part # M9437 </td></tr><tr><td> Zelfklevende plaat afdichtingen </td><td> ABgene, part # AB-0580 </td></tr><tr><td> 200 ml cultuur flessen </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> Spectrofotometer waarmee absorptie </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> Temperatuur-gecontroleerde shaker voor 250 ml flesjes of schudden spectrofotometer </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> Safe-Lock microcentrifugebuis, 2 mL </td><td> Eppendorf, part # 0030 120.094 </td></tr><tr><td> Hybridisatie apparatuur </td><td></td></tr><tr><td> Hybridisatie Oven 640 </td><td> Affymetrix, part # 800138 </td></tr><tr><td> GeneChip fluïde Station 450 </td><td> Affymetrix, part # 00-0079 </td></tr><tr><td> GeneArray Scanner 3000 </td><td> Affymetrix, part # 00-0212 </td></tr><tr><td> Bad met kokend water met drijvende rek </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> Hybridisatie verbruiksartikelen </td><td></td></tr><tr><td> Genflex Tag 16K Array v2 </td><td> Affymetrix, part # 511331 </td></tr><tr><td> Denhardt&#39;s Solution, 50x concentreren </td><td> Sigma, part # D2532 </td></tr><tr><td> Streptavidine, R-phycoerythrin conjugaat (SAPE) </td><td> Invitrogen, part # S866 </td></tr><tr><td> Safe-Lock microcentrifugebuis, 0,5 ml </td><td> Eppendorf, part # 0030 123.301 </td></tr><tr><td> Teeny Tough-Spots </td><td> Diversified Biotech, part # LTTM-1000 </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> BioRad, part # 161-0729 </td></tr><tr><td> 10% Tween </td><td> Sigma, part # T2700 </td></tr><tr><td> MES vrij zuur monohydraat </td><td> Sigma, part # M5287 </td></tr><tr><td> MES natriumzout </td><td> Sigma, part # M5057 </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> Sigma, part # 71386 </td></tr><tr><td> 20X SSPE </td><td> Sigma, part # S2015 </td></tr><tr><td> Moleculaire biologie kwaliteit water </td><td> Sigma, part # W4502 </td></tr><tr><td> Hybridisatie Primers </td><td> Verschillende leveranciers (standaard ontzouten) </td></tr><tr><td> Uptag </td><td> 5 &#39;GATGTCCACGAGGTCTCT 3&#39; </td></tr><tr><td> Buptagkanmx4 </td><td> 5 &#39;biotine-GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntag </td><td> 5 &#39;CGGTGTCGGTCTCGTAG 3&#39; </td></tr><tr><td> Bdntagkanmx4 </td><td> 5 &#39;biotine-GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3&#39; </td></tr><tr><td> B213 </td><td> 5 &#39;biotine-CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Uptagkanmx </td><td> 5 &#39;GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntagkanmx </td><td> 5&#39;GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Uptagcomp </td><td> 5&#39;AGAGACCTCGTGGACATC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dntagcomp </td><td> 5&#39;CTACGAGACCGACACCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Upkancomp </td><td> 5&#39;CGTACGCTGCAGGTCGAC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dnkancomp </td><td> 5&#39;CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Sequencing Primers: Illumina Platform </td><td> Diverse leveranciers </td></tr><tr><td> UpTag Forward (100um) </td><td> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA CTT GCT CCG ATC T GAT GTC CAC GAG GTC TCT 3&#39; </td></tr><tr><td> UpTag Reverse (100um) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CCG CTT ATC T NNNNN GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag Forward (100um) </td><td> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA CTT GCT CCG ATC T GAA AAC GAG CTC GAA TTC ATC G 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag Reverse (100um) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CCG CTT ATC T NNNNN CGG TGT CGG TCT CGT AG 3 ` </td></tr><tr><td> Lees een UP-tag seq primer (100um) </td><td> 5 &#39;GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Lees een DOWN-tag seq primer (100um) </td><td> 5 &#39;CGG TGT CGG TCT CGT AG 3&#39; </td></tr><tr><td> Lees 2 Index Sequencing primer (standaard Illumina R1 primer) (100um) </td><td> 5 &#39;AC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CCG CTT ATC T 3&#39; </td></tr><tr><td> Extra Sequencing Reagentia / Equipment </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute 96 UF PCR zuivering Kit </td><td> Qiagen, onderdeel # 29051 </td></tr><tr><td> Vacuümpomp </td><td> Elke leverancier </td></tr><tr><td> Macherey-Nagel Vacuum Manifold </td><td> Macherey-Nagel, een deel # 740 681 </td></tr><tr><td> Invitrogen Quant-iT dsDNA BR Assay Kit </td><td> Invitrogen, part # Q32853 </td></tr><tr><td> Invitrogen Qubit assay buizen </td><td> Invitrogen, part # Q32856 </td></tr><tr><td> 40% acrylamide plus 1% N, N&#39;-methyleen-bis-acrylamide, 37.5:1 </td><td> Bio Rad, part # 161-0148 </td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Sigma, part # T1503-1KG </td></tr><tr><td> Boorzuur </td><td> Sigma, part # B6768-500G </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA, pH 8,0 </td><td> Teknova, part # E0306 </td></tr><tr><td> Ammoniumpersulfaat </td><td> Sigma, part # A3678-25G </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Bioshop, part # TEM001.25 </td></tr><tr><td> Ethidiumbromide oplossing </td><td> Bioshop, part # ETB444.10 </td></tr><tr><td> 0,5 M Ammoniumacetaat </td><td> Teknova, part # A2000 </td></tr><tr><td> 10 mM magnesiumacetaat tetrahydraat </td><td> Sigma, part # M0631-100G </td></tr><tr><td> 1 mM EDTA, pH 8,0 </td><td> Zie 0,5 M EDTA, pH 8,0 </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> Natriumacetaat, pH 5,2 </td><td> Teknova, part # S0297 </td></tr><tr><td> Snelheid vacuum </td><td> Verschillende </td></tr><tr><td> Single-Lees Cluster Generation Kit </td><td> Illumina, part # GD-300-1001 </td></tr><tr><td> 36c Sequencing Kit v4 </td><td>Illumina, part # FC-104-4002 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table> 10X TBE recept <table border="1"><tbody><tr><td> Bedragen </td><td> Reagentia </td></tr><tr><td> 108 gram </td><td> Tris Base </td></tr><tr><td> 55 gram </td><td> Boorzuur </td></tr><tr><td> 40ml </td><td> 0,5 M EDTA (pH 8,0) </td></tr><tr><td colspan="2"> Voeg dH 2 O tot 1L markeren </td></tr></tbody></table> 12% polyacrylamide gel recept <table border="1"><tbody><tr><td> Volumes </td><td> Reagentia </td></tr><tr><td> 5,8 ml </td><td> 40% acrylamide plus 1% N, N&#39;-methyleen-bis-acrylamide, 37.5:1 </td></tr><tr><td> 12 ml </td><td> dH 2 O </td></tr><tr><td> 2 ml </td><td> 10X TBE </td></tr><tr><td> 140 ul </td><td> 10% ammoniumpersulfaat </td></tr><tr><td> Totaal volume: 20ml </td><td></td></tr></tbody></table> Uptag primer mix: Resuspendeer Uptag en Buptagkanmx4 elk in DDH 2 O bij 100 uM, meng in een verhouding van 1:1 voor een uiteindelijke concentratie van 50 uM elk. Bewaren bij -20 ° C. Downtag primer mix: Resuspendeer Dntag en Bdntagkanmx4 elk in DDH 2 O bij 100 uM, meng in een verhouding van 1:1 voor een uiteindelijke concentratie van 50 uM elk. Bewaren bij -20 ° C. Gemengde oligonucleotiden: Resuspendeer elk van de volgende acht oligo (standaard ontzout) in DDH 2 O bij 100 uM: Uptag, Dntag, Uptagkanmx, Dntagkanmx, Uptagcomp, Dntagcomp, Upkancomp, Dnkancomp. Meng een gelijk volume van de acht oligonucleotiden voor een uiteindelijke concentratie van 12,5 uM elk. 12X MES voorraad: Voor 10 ml en los op 0,7 g MES vrije zuur monohydraat en 1,93 g MES natriumzout in 8 ml moleculaire biologie kwaliteit water. Na het mengen goed, controleer de pH en pas als dat nodig is om een ​​pH 6,5-6,7. Voeg water toe tot een totaal volume van 10 ml. Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C beschermd tegen licht (bv, wikkel de buis in folie). Vervangen als oplossing wordt zichtbaar geel of na 6 maanden. 2X hybridisatiebuffer: Voor 50 ml, meng 8,3 ml van 12X MES voorraad (vanaf 2.9.14), 17,7 ml 5 M NaCl, 4,0 ml van 0,5 M EDTA, 0,1 ml 10% Tween 20 (vol / vol), en 19,9 ml gefilterd DDH 2 O. Filter steriliseren. Was A: Meng 300 ml 20X SSPE, 1 mL 10% Tween (vol / vol), 699 ml DDH 2 O. Filter steriliseren. Was B: Mix 150 ml 20X SSPE, 1 mL 10% Tween (vol / vol), 849 ml DDH 2 O. Filter steriliseren. Barcode sequencing primers In UP-tag primer sequenties van de 5 &#39;staart (vet) zijn Illumina specifieke adapter sequenties opgenomen in de F-en R-primer. De variabele sequentie (cursief) staat voor de 5-mer indexering tag gebruikt in de multiplexen / index read-out. De drie &#39;staart (onderstreept) vertegenwoordigt de gemeenschappelijke primer aan weerszijden van de uptag barcode en is nodig om de gist barcodes te versterken. In DOWN-tag primer sequenties van de 5 &#39;staart is identiek aan 5&#39; staart van UP-tag primers (Illumina specifieke volgorde), maar de drie &#39;staart (onderstreept) wordt vervangen door de gemeenschappelijke primers die worden gebruikt om het versterken DOWN- tag barcodes.

concurrerende genomische schermen van streepjescode gist bibliotheken

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

Op grond van ontwikkelingen in de next generation sequencing technologie, hebben we toegang tot nieuwe genoomsequenties bijna dagelijks. Het tempo van deze voorschotten aan het versnellen is, met de belofte een grotere diepte en breedte. In het licht van deze buitengewone ontwikkelingen, de behoefte aan snelle, parallel methoden om de functie van een gen te definiëren wordt steeds belangrijker. Collecties van genoom-brede deletiemutanten in gisten en E. coli hebben gediend als werkpaarden voor de functionele karakterisering van gen-functie, maar deze aanpak is niet schaalbaar, de huidige gen-deletie benaderingen vereisen elk van de duizenden genen die een genoom te worden verwijderd en gecontroleerd bestaan. Pas nadat dit werk voltooid is kunnen we nastreven high-throughput fenotypering. In de afgelopen tien jaar heeft ons laboratorium verfijnd een portfolio van concurrerende, geminiaturiseerde, high-throughput genoom-brede analyses die uitgevoerd kunnen worden in parallel. Dit parallellisatie is mogelijk door het opnemen van DNA &#39;tags&#39;, of &#39;barcodes,&#39; in elke mutant, met de barcode die als een proxy voor de mutatie en men kan de barcode overvloed maatregel mutant fitheid te beoordelen. In deze studie willen we de kloof tussen de DNA-sequentie en de streepjescode mutant collecties te vullen. Om dit te bereiken introduceren we een gecombineerde transposon verstoring-barcoding aanpak die zich opent parallel barcode assays voor nieuw gesequenced, maar slecht gekarakteriseerd microben. Ter illustratie van deze aanpak presenteren we een nieuw Candida albicans streepjescode verstoring van het verzamelen en beschrijven hoe zowel de microarray-gebaseerde en de volgende generatie sequencing-gebaseerde platforms kunnen worden gebruikt voor het verzamelen van 10.000 - 1000000 gen-gen en drug-gen interacties in een enkel experiment.

We hebben uitgebreide, onpartijdige genoom-brede schermen van gen-drugs-en gen-omgeving interacties te begrijpen. Methoden voor het screenen van deze mutant collecties worden gepresenteerd.

Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

Dankzij vorderingen in technologieën voor next-generation sequencing hebben we vrijwel dagelijks toegang tot nieuwe genoomsequenties. Het tempo van deze vorderingen is ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om genoombrede, gebarcodeerde microben collecties te gebruiken om gen-geneesmiddel- en gen-omgevingsinteracties op een sterk parallelle wijze te begrijpen. Dit wordt bereikt door de microben collectie te screenen gedurende vijf tot 20 generaties groei in de aanwezigheid van een geneesmiddel, waarbij robotica wordt ingezet om de cellen in de exponentiële groeifase te houden. Als tweede stap worden cellen verzameld, wat ons in staat stelt om gelijktijdig genomisch DNA uit 4.000 tot 6.000 individuen te extraheren.Vervolgens worden de PCR-producten die de geamplificeerde barcodes bevatten gekwantificeerd met behulp van microarray-hybridisatie of barcode-sequencing om de barcodes te kwantificeren en zo de abundantie van elke stam in een complex pool te bepalen. Uiteindelijk worden resultaten verkregen die laten zien welke gebarcodeerde mutanten gevoelig zijn voor behandelingen en daardoor uit de pool verdwijnen tijdens het experiment. Het belangrijkste voordeel van de techniek die we vandaag gaan bekijken, is dat we, in plaats van individuele stammen te behandelen als kolonies op platen of als afzonderlijke vloeibare culturen, tienduizenden of honderdduizenden verschillende stammen kunnen samenvoegen en deze als één enkele pool kunnen analyseren.Toen we ons bewust werden van de kracht van deze assay, wilden we deze automatiseren. Gelukkig werkte ik bij de Stanford Genome Technology sensor en werd ik omringd door ingenieurs die mij hielpen dit te realiseren. Andrew Smith, een senior promovendus in mijn laboratorium, zal vandaag het protocol demonstreren en alle stappen en bijbehorende procedures toelichten, samen met Tanya Durick, die ons zal laten zien hoe de sequencingsaspecten van het protocol worden uitgevoerd. Dit protocol maakt gebruik van een bibliotheek van Candida albicans-mutanten die zijn gegenereerd via transposon-mutagenese, waarbij elke mutant een barcode-tag draagt om individuele mutanten te combineren in één enkele pool. Een kopie van de bibliotheek wordt gerepliceerd op 3 84.Kweek de kolonies in wellplaten met medium bij 30 °C gedurende twee tot drie dagen totdat ze hun maximale grootte hebben bereikt. Werk vervolgens in een microbiologische omgeving met een brander en steriel laboratoriummateriaal; overspoel elke plaat met 5 tot 10 mL medium en laat dit vijf minuten weken. Resuspendeer de kolonies met een celspreider en giet de vloeistof inclusief cellen in een conische centrifugebuis van 50 mL.Voeg DMSO toe tot 7%. Pas de cellen aan naar een uiteindelijke OD 600 concentratie van 50 per milliliter met medium dat 7% DMSO bevat en verdeel deze vervolgens in aliquoten van 40 µL in PCR-stripbuisjes; gepoolde celaliquoten kunnen onbeperkt worden bewaard bij -80 °C. Om deze procedure te starten, worden de gepoolde celaliquoten op ijs ontdooid en direct voorzichtig verdund in medium met een drug of conditie naar keuze, waarbij wordt geïnoculeerd bij een OD 600 van 0,0625 in een totaal volume van 700 µL per well in een 48-well plaat. Voor de doeleinden van deze video worden triplicaten van twee condities voorbereid.Voeg ten minste één passende oplosmiddelcontrole toe aan de plaat. Verzegel de plaat met een plastic plaatafdichting en kweek de cellen in een spectrofotometer of een temperatuurgecontroleerde schudmachine bij 30 °C met een experimenteel bepaald schudschema. Schud bijvoorbeeld 14 minuten, lees de putjes gedurende één minuut uit en hervat vervolgens het schudden.Een deel van de celsuspensie kan door de robot worden geoogst en worden bewaard op een koelplaat op het robotdek. Dit gebeurt op door de gebruiker gedefinieerde tijdstippen van generatie, gewoonlijk na 5, 10, 15 en 20 generaties groei. Oogst voor elk monster en tijdstip minimaal twee od 600 aan cellen.Breng de geoogste celmonsters over naar safe-lock microcentrifugebuisjes. Deze cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor genomische DNA-extractie, wat in de volgende stap van deze procedure zal worden gedemonstreerd. Gezuiverd genomisch DNA uit cellen die op verschillende tijdstippen zijn geoogst met een yeast star kit.Elueer het DNA met 300 µL van 0,1 XTE, conform de instructies van de fabrikant met één aanpassing. Stel vervolgens voor elk monster twee PCR-reacties op: één voor de UPT-tags en één voor de down-tags.Controleer de resulterende PCR-producten op een gel. Voor ampliconen die worden gebruikt voor hybridisatie, zoals weergegeven in baan één en drie, wordt een product van 60 baseparen verwacht voor beide PCR's. In dit voorbeeld wordt voor ampliconen voor barcode-sequencing een product van 130 baseparen verwacht, zoals weergegeven in baan vijf en zeven.Op dit punt kunnen de PCR-producten, afhankelijk van welk PCR-product is gegenereerd, worden gebruikt voor microarray-analyse of directe barcode-sequencing. Om u voor te bereiden op de microarray-analyse, warmt u de hybridisatieoven voor tot 42 °C en stelt u een kokend waterbad en een ijsemmer met een mengsel van ijs en water klaar. Bevochtig de arrays vooraf door ze langzaam te vullen met 120 µL van één x hybridisatiebuffer.Incubeer de arrays in de hybridisatiebuffer bij 42 °C en 20 RPM gedurende 10 minuten. Terwijl de arrays incuberen, bereid lock-top buisjes van 0,5 mL voor met 120 µL hybridisatiemix per monster, plus één extra buisje als reserve. Voeg 30 µL uptake PCR en 30 µL down tag PCR toe aan de hybridisatiemix voor een totaalvolume van 150 µL.Kook gedurende twee minuten en plaats vervolgens gedurende ten minste twee minuten in ijswater. Centrifugeer de buisjes kort voordat u ze gebruikt. Verwijder de prehybridisatiebuffer van de arrays en voeg 120 µL hybridisatie PCR-mix toe om verdamping te voorkomen.Bedek de array-pakkingen met een tough spot, hybridiseer gedurende 16 uur bij 42 °C en 20 RPM. Verwijder de arrays uit de hybridisatieoven en verwijder de tough spots van de chips. Verwijder langzaam het hybridisatiemengsel van de arrays met een pipet en vul de arrays.Laad de arrays in de washer van het geprimede vloeistofstation met 120 µL van wasbuffer A. De arrays worden gewassen volgens het gene Flex SV 3 4 50 protocol met de volgende wijzigingen: één extra stap met wasbuffer A vóór de kleuring.Wasbeurt B, temperatuur van 42 °C in plaats van 40 °C en kleuring bij 42 °C op het fluidic station in plaats van bij 25 °C. Voer na de fluidica-operaties het fluidic station uit en sluit het 4-50 protocol af. Los de washer uit nadat is vastgesteld dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.Plaats de arrays in de scanner en scan bij een emissiegolflengte van 560 nanometers. Het 130 base paar PCR-product wordt gebruikt voor next generation barcode sequencing; om dit te bereiken, worden eerst 12 pool DNA-monsters gescheiden op een 12% page gel. Kleur vervolgens de gel met cyber green en snijd de gewenste gelband uit.Het uit de gel geëxtraheerde DNA wordt vervolgens gekwantificeerd via realtime PCR om clusters te genereren op een single read flow cell met behulp van de CBOT en de single read cluster generation kit. Plaats de flow cell in de sequencer en observeer de eerste base die wordt uitgelezen. De hier getoonde sequencer is representatief voor de data die op bepaalde punten van het protocol zijn verzameld.De pool van gemarkeerde mutanten werd gedurende 20 generaties gekweekt in de aanwezigheid van het antifungale middel clotrimazol en in DMSO als controle; voor elk gen werd een log2-ratio berekend en uitgezet. Alle stammen die significant gevoelig zijn voor clotrimazol-behandeling met een log2-ratio van twee zijn rood gemarkeerd. In dit voorbeeld worden vier stammen getoond: NCP1, ERG2 en twee onafhankelijke allelen van ERG11.De gevoeligheid van de bekende eiwitdoelen van het antischimmelmiddel clotrimazol van stammen die als gevoelig zijn gedetecteerd in een pooled screen, moet worden geverifieerd in individuele groeianalyses in de aanwezigheid van dezelfde drugconcentratie. De volgende grafiek toont hier de resultaten van een bevestigingsexperiment. De vier stammen die in het screen zijn gedetecteerd, vertoonden een verminderde groei ten opzichte van de wilde-type ouderstam.BWP 17 is in het zwart aangegeven. Deze individuele groeicurves benadrukken een belangrijk kenmerk van dergelijke gepoolde gene drug screens, namelijk dat de absolute rangschikking van een specifieke stam niet noodzakelijkerwijs het exacte gevoeligheidsniveau weerspiegelt. Bovendien tonen de resultaten de waarde van het hebben van meerdere allelen voor elk gen.In dit geval vertonen de twee ERG 11-disruptiemutanten een licht verschillende gevoeligheid voor het geneesmiddel. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze, mits correct uitgevoerd, in vijf dagen worden voltooid, vanaf de inoculatie van de screening tot aan de analyse van de gegevens. Hoewel elk individueel experiment biologisch onthullend is, ligt de werkelijke kracht in het uitvoeren van een groot aantal experimenten en het opbouwen van een database, waardoor u in staat bent om genfuncties en de werking van geneesmiddelen te voorspellen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u genoombrede, gebarcodeerde mutantcollecties voor poolscreening voorbereidt, en ook hoe u microarray's of sequencing gebruikt om genen van belang te identificeren na de ontwikkeling ervan. Deze techniek stelde onderzoekers in het veld van de functionele genomics in staat om de functie van elk van de 6.000 verschillende genen in het gistgenoom te onderzoeken.

competitive-genomic-screens-of-barcoded-yeast-libraries

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een plasmide overexpressie scherm...

High-throughput gist Plasmide Overexpressie Screen

Kwantitatieve Fitness Analyse (QFA) is een complementaire reeks van experimentele en computationele methoden voor het schatten van microbiële cultuur fitnesses. QFA schat het effect van genetische mutaties, drugs of andere toegepaste behandelingen microbe groei. Experimenten scaling van gerichte analyse van de afzonderlijke culturen tot duizenden parallelle culturen kan worden ontworpen.

Een kwantitatieve analyse Fitness Workflow

Barcode Enabled Sequencing van Tetrads (BEST) vervangt de handmatige processen te isoleren, verstoren en spacing tetraden. BESTE isolaten tetrads door fluorescentie-geactiveerde celsortering op agarplaten, scheidt de sporen door roeren met glaskralen, en bepaalt welke willekeurig bekleed kolonies afgeleid van dezelfde oorspronkelijke viertal behulp van moleculaire barcodes.

BEST: Barcode Enabled Sequencing van Tetrads

Hier presenteren we een kosteneffectieve methode voor het definiëren van chemisch-genetische interacties in knopgistende gist. De benadering is gebaseerd op fundamentele technieken in moleculaire biologie van gist en is zeer geschikt voor het mechanistische onderzoek van kleine tot middelgrote collecties chemicaliën en andere media-omgevingen.

Snelle identificatie van chemische Genetische Interacties in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

We presenteren een gedetailleerd protocol om mutantenbibliotheken te construeren en te screenen voor gerichte evolutiecampagnes in Saccharomyces cerevisiae.

Geregisseerd Evolution Method in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliotheek Creatie en Screening

Dit protocol beschrijft een high-throughput methodologie om functioneel scherm op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae.

High-throughput Screening op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae

Batch-verwerking van gist 2-hybrid schermen zorgt voor directe vergelijking van de profielen van de interactie van meerdere aas eiwitten met een zeer complexe verzameling prooi fusion eiwitten. We beschrijven hier, verfijnde methoden, nieuwe reagentia en het implementeren van het gebruik ervan voor dergelijke schermen.

Een gist 2-Hybrid scherm in Batch om te vergelijken eiwitinteractie

Diepe sequentiebepaling van gist bevolking geselecteerd voor positieve gist 2-hybrid interacties mogelijk levert een schat aan informatie over interacterende eiwitten van de partner. Hier beschrijven we de werking van specifieke bioinformatica tools en bijgewerkte software voor het analyseren van de reeks gegevens uit dergelijke schermen op maat.

Informatic analyse van sequencedata van Batch gist 2-Hybrid schermen

Dit artikel presenteert een paring gebaseerde methode om overexpressie screening in ontluikende gist met behulp van een gekleed plasmide-bibliotheek.

Paring gebaseerde overexpressie bibliotheek Screening in het gist

Wij presenteren een eenvoudige suppressor scherm protocol in kernsplijting gist. Deze methode is efficiënt, mutageen-vrije en selectieve voor mutaties die vaak bij een enkele genomic locus voorkomen.  Het protocol is geschikt voor het isoleren van suppressors die verlichten van gebreken van de groei in vloeibare cultuur die worden veroorzaakt door een mutatie of een drug.

Een Deep-sequencing-bijgewoonde, spontane Suppressor scherm in de kernsplijting gist Schizosaccharomyces pombe

Dit werk beschrijft een protocol voor een multicopy suppressor genetische screening in Schizosaccharomyces pombe. Dit scherm maakt gebruik van een genoombrede plasmidebibliotheek om suppressorkloon (en) van een functieverliesfenotype geassocieerd met een querymutantenstam te identificeren. Nieuwe genetische onderdrukkers van de ell1 null-mutant werden geïdentificeerd met behulp van dit scherm.

Genetische screening voor identificatie van multicopy suppressors in Schizosaccharomyces pombe

Leer concurrerende genomische schermen van streepjescode gistbibliotheken voor gen-drug interactiestudies met Candida albicans. Deze methode maakt hoogdoorvoeranalyse van duizenden mutanten mogelijk.

Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

Meer video's verkennen