Single Drosophila Ommatidium Dissection en Imaging
19 augustus 2011
De beperkende factor in het gebruik van de volwassen Drosophila Oog voor neurodegeneratie en celbiologie onderzoek is het moeilijk beeldvorming van intracellulaire processen. We beschrijven de ontleding van enkele ommatidia om een bonafide primaire neuronale cel-cultuur, die kan worden onderworpen aan medicamenteuze behandeling en geavanceerde imaging te genereren.
Het algemene doel van deze procedure is om enkelvoudige drosophila of matia te dissekeren en te beelden om intracellulaire gebeurtenissen in neurodegeneratiemodellen te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst de kop van de vlieg van de rest van het lichaam te scheiden en deze open te snijden.
Vervolgens worden de hersenen en andere weefsels uit de kop verwijderd. Daarna wordt de cuticula verwijderd en wordt elk netvlies in tweeën gesneden. De laatste stap van de procedure is het uitsteken van de O met een wolfraamnaald en het plaatsen hiervan op een objectglas.
Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die cytoplasmatische autofagische organellen aantonen via fluorescentie-confocale microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het celbiologische analyse met een hoge resolutie mogelijk maakt in drosophila-modellen voor neurodegeneratie, die tot nu toe alleen genetische inzichten in dit veld konden bieden, wat aantoont dat de procedure variabel zal zijn. Een promovendus uit mijn laboratorium met de hulp van Daniel Mackay, een histologie- en microscopietechnicus aan het centrum.
Vul ter begin één putje van een glazen objectglas met drie putjes met fosfaatgebufferde zoutoplossing en anesthetiseer vervolgens de vliegen met kooldioxide. Zodra de vliegen zijn geanesthetiseerd, pakt u met een pincet één enkele vlieg op en plaatst u deze in het kleine schaaltje met PBS. Knijp onder een dissectiemicroscoop met een pincet in de proboscis en scheid vervolgens de kop van het lichaam door de nek door te snijden.
Gebruik een tweede set pincetten om de kop van de vlieg bij de proboscis vast te houden en knip de kop met microschaartjes langs de laterale rostrale middellijn doormidden. Om de hersenen bloot te leggen, gebruikt u een afgeknipt pipetpuntje om de kop op te pakken, bevestig de retina en breng deze over naar een andere put die gevuld is met Schneider-medium. Verwijder het grootste deel van de kopcuticula met een pincet en neem vervolgens de hersenen uit.
Houd het netvlies ingeklemd tussen het lamella en het hoornvlies. Breng het netvlies vervolgens over naar een druppel van 50 µL vers Schneider-medium. Plaats dit direct op een glazen objectglas en pak met een pincet of microschaar ofwel het meest dorsale of het meest ventrale uiteinde van het netvlies vast.
Snijd het netvlies langs de dorsoventrale middellijn doormidden om de AMIA in het midden van het oog bloot te leggen. Blijf het netvlies zo vasthouden dat het hoornvlies naar beneden is gericht en de lamina naar boven. Los met een fijne wolfraamnaald eerst de oia van de lamina en vervolgens van het hoornvlies.
Enkelvoudige oia en groepen OIA zullen zich verzamelen op de bodem van het putje of het objectglas. Verwijder eventuele grotere debris die zich mogelijk hebben verzameld voordat u verdergaat. Om autofagie te analyseren, verdunt u LysoTracker 1:1000 in een druppel Schneider-medium, mengt u dit en wacht u 10 seconden.
Verwijder het overtollige vloeistof van het objectglas, waarbij zorgvuldig wordt gewaakt dat de AMIA achterblijft. Voeg een druppel vector shield toe om de AMIA te bedekken.
Breng een dekglas aan en verzegel dit met nagellak. Met behulp van confocale microscopie kunnen zowel fagosomen, gemarkeerd met GFP-ATG8, als lysosomen, gemarkeerd met LysoTracker, worden gevisualiseerd in een enkel tedium dat is gedisseceerd uit een vlieg die een mutante vorm van atropine tot expressie brengt. Het brightfield-paneel rechtsboven toont de bijna intacte structuur van het tedium, en het kader geeft het gescande gebied aan. Hier markeert rood de lysosomen en markeert groen het autofagosoom.
De autolysosomen, die ontstaan uit de fusie van de twee organellen, verschijnen geel. Na deze procedures kunnen andere methoden, zoals het kweken van materiaal en het toedienen van geneesmiddelen, worden uitgevoerd om verschillende vragen te beantwoorden. Zoals de effectieve verbindingen op de autofagie-indicatoren in neuronen met verschillende genetische achtergronden.
Het combineren van de voordelen van drosophila-genetica met geavanceerde celbiologische analyses die mogelijk zijn in celkweek.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een procedure voor het dissekeren en afbeelden van enkelvoudige Drosophila ommatidia om intracellulaire gebeurtenissen in modellen voor neurodegeneratie te bestuderen. De methode maakt het mogelijk om primaire neuronale celculturen te genereren die kunnen worden onderworpen aan medicamenteuze behandeling en geavanceerde beeldvormingstechnieken.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Neurodegeneratie
Achtergrond
- Het in beeld brengen van intracellulaire processen in volwassen Drosophila is uitdagend.
- Dissectie van enkelvoudige ommatidia biedt een oplossing voor het bestuderen van cellulaire mechanismen.
- Primaire neuronale culturen maken medicamenteuze behandeling en geavanceerde beeldvorming mogelijk.
- Deze benadering vergroot het begrip van neurodegeneratie.
Doel van de studie
- Om Drosophila-ommatidia te dissecteren voor cellulaire analyse.
- Om beeldvorming van intracellulaire processen te vergemakkelijken.
- Om een platform te creëren voor studies naar medicamenteuze behandelingen.
Gebruikte methoden
- Bevestig de kop van de vlieg en snijd deze open.
- Verwijder de hersenen en andere interne weefsels.
- Snijd het netvlies doormidden nadat de cuticula is verwijderd.
- Snij de ommatidia uit met een wolfraaminaald en breng deze over op een objectglas.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle dissectie van individuele ommatidia.
- Creatie van bona-fide primaire neuronale celculturen.
- Vermogen om medicumentsbehandelingen uit te voeren op gecultiveerde cellen.
- Geavanceerde imagingtechnieken toegepast voor het bestuderen van intracellulaire processen.
Conclusies
- De methode biedt een waardevolle tool voor het bestuderen van neurodegeneratie.
- Dissectie van individuele ommatidia verbetert de mogelijkheden voor cellulaire beeldvorming.
- Deze benadering kan leiden tot nieuwe inzichten in de neurobiologie.
Veelgestelde Vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dissectie en beeldvorming van een enkel ommatidium in Drosophila maakt hoogresolutieanalyse mogelijk van intracellulaire gebeurtenissen die relevant zijn voor neurodegeneratie, waardoor de beperkingen van autofluorescentie van het gehele oog worden overwonnen. Deze techniek ondersteunt mechanistische risicoreductie en targetvalidatie in vroege discovery-fasen door directe visualisatie van autofagische processen en drugrespons in genetisch gedefinieerde neurale cellen mogelijk te maken. De aanpasbaarheid voor live-imaging en toediening van verbindingen positioneert deze methode als een herbruikbaar platform voor onderzoekslijnen naar neurodegeneratie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe analyse van autofagie en intracellulair transport in ziekterelateerde neuronale cellen mogelijk.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door subcellulaire reacties op genetische of farmacologische verstoringen te visualiseren.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door celautonome effecten in mozaïekachtige genetische achtergronden te onderscheiden.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gevalideerd ex vivo systeem voor kwantitatieve beeldvorming van autofagische en lysosomale markers.
- Maakt reproduceerbare preparatie van single-cell monsters mogelijk voor gestandaardiseerde verbindingstests.
- Ondersteunt de schaalbaarheid van de assay en het hergebruik van het platform voor screening van middelen die neurodegeneratie modificeren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante pathways door autofagische dysfunctie te modelleren in een genetisch hanteerbaar systeem.
- Maakt continuïteit mogelijk van genetische ontdekking tot preklinische evaluatie van verbindingen in neuronale cellen.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door voorspellende cellulaire read-outs te leveren voor targets bij neurodegeneratie.
Integratie van pipeline & workflow
Deze methode slaat een brug tussen vroege ontdekking en preklinisch onderzoek door hypothese-gestuurd testen van intracellulaire mechanismen en compound-effecten in een genetisch gedefinieerde neuronale context mogelijk te maken.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van autofagie- en neurodegeneratiepaden in individuele ommatidia.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare imaging-resultaten voor de evaluatie van verbindingen.
- Analyse: Biedt op confocale microscopie gebaseerde metingen van autofagosomen, lysosomen en hun fusieproducten.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert de afstemming van cellulaire fenotypes met ziektemodellen en de ontwikkeling van biomarkers.
- Bedrijfsuitbreiding: Biedt een modulair platform dat aanpasbaar is aan diverse genetische achtergronden en bibliotheken van verbindingen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij doelwitvalidatie en mechanistische studies naar neurodegeneratie.
- Operationele waarde: Standardiseert workflows voor enkelceldissectie en imaging voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door direct cellulair bewijs te leveren van target engagement en de werkzaamheid van verbindingen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritisering van neurodegeneratiedoelwitten en therapeutische kandidaten mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in Drosophila-dissectie en confocale beeldvormingstechnieken.
- Toegang tot fluorescentiemicroscopie en celkweekinfrastructuur is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor monstervoorbereiding en beeldvormingsprotocollen.
- Aanpasbaar aan verschillende genetische achtergronden met behulp van technieken voor mozaïekanalyse.
- Beperkt tot ex vivo analyse; in vivo validatie kan nodig zijn voor translationele continuïteit.
