Name: Single Drosophila Ommatidium Dissection en Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Leer hoe u enkele Drosophila ommatidia dissecteert en beeldt om intracellulaire processen in neurodegeneratiemodellen te bestuderen. Deze methode maakt hoogwaardige celbiologische analyse mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Bernard Charroux voor discussies. Dit werk werd gefinancierd door de KCL Biomedical School.

1. Dissectie van de Drosophila netvlies <ol><li> Vul een een goed van een 3-Well glasplaatje met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS 1X) en vervolgens vliegt verdoven door CO 2. Zowel mannen als vrouwen kan worden gebruikt voor dit experiment. </li><li> Zodra de vliegen worden verdoofd, pick-up een enkel vliegen met behulp van een tang en zet het in de kleine schotel van PBS. </li><li> Onder een ontleding scope, neem de snuit met een tang, en dan maak de kop van het lichaam door de nek doorsnijden met behulp van een tweede set van de tang. </li><li> Houd de vlieg hoofd van de proboscis, doormidden gesneden aan de links / rechts midline de vlieg hoofd met microscissors naar de hersenen zichtbaar te maken. </li><li> Gebruik een afgezaagd pipettip op te halen het netvlies, en een tweede put van de 3-Well glasplaatje gevuld met Schneider medium transfer. </li><li> Eerste schil weg het grootste deel van het hoofd cuticula en verwijder de hersenen met een tang. Houd het netvlies ingeklemd tussen de lamina en het hoornvlies. </li><li> Vervolgens overdracht van de retina naar een druppel (50 ul) van verse Schnieder medium geplaatst direct van het glas dia. </li></ol> 2. Dissectie van de ommatidia <ol><li> Afhankelijk van de uiteindelijke doel van de dissectie (of onmiddellijke imaging of cultuur) en de optiek van de tl-microscoop (direct of omgekeerd), kan deze stap te geschieden op een microscoopglaasje of in een 24-well plaat. Voor het uiteindelijke doel van deze dissectie, zal de ommatidia direct worden ontleed op het glaasje. </li><li> Pak een van de meest dorsale of ventrale einde van het netvlies met een tang. Met behulp van microscissors, snijd het netvlies in half langs de dorsale / ventrale mediaanlijn aan de ommatidia bloot in het midden van het oog. </li><li> Nog steeds aan het netvlies, zodat het hoornvlies is naar beneden en de lamina is naar boven te begrijpen. Met behulp van een fijne wolfraam naald, maak de ommatidia uit de lamina en het hoornvlies. </li><li> Single ommatidia en groepen van ommatidia zal verzamelen op de bodem van de put of dia. Verwijder alle grotere vuil dat hebben verzameld voordat u verder gaat. </li></ol> 3. Behandeling, vlekken en imaging <ol><li> Voor het analyseren van autofagie, verdunnen 1:1000 Lysotracker in de Schneider druppel (eerste verdunnen 1:10 in Schneider en vervolgens 0,5 ul toe te voegen aan de druppel op de dia), meng en wacht 10 seconden. </li><li> Verwijder de overtollige vloeistof uit de slide, let daarbij goed op de ommatidia achter te laten. Dit gebeurt best met een fijne gel laad-tip. </li><li> Voeg een druppel Vectashield aan de ommatidia te dekken, breng een dekglaasje aan en afdichting met nagellak. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: De goede uitvoering van het protocol moet laten een aantal alleenstaande ommatidia en van de kleine groepen van ommatidia bij elkaar gehouden door fragmenten van lamina maar mooi gescheiden op het hoornvlies kant. Deze kunnen worden afgebeeld zoals in dit voorbeeld om Atg8 visualiseren: GFP en Lysotracker, waarin autofagosomen, lysosomen en autophagolysosomes (afb. 3). De methode kan gebruikt worden voor live-imaging, maar in dit geval dient te worden opgemerkt dat de autofluorescentie van medium de Schneider zal het moeilijk maken om lage intensiteit fluorescerende signalen te onderscheiden. Een bijkomend probleem is dat de pigmentkorrels die gehecht blijven aan de fotoreceptoren zijn intens fluorescent, vooral in het rode kanaal. Een helderveld beeld kan nodig zijn om ze te onderscheiden van echte organellen. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Stroomdiagram van de dissectie procedure om enkele ommatidia of kleine groepen van ommatidia te verkrijgen van de vlieg netvlies. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Mogelijke variaties van het eenvoudige protocol hier te beschrijven die gepaard vliegen de genetica en de vergrijzing stroomopwaarts van de dissectie en vlekken of kweken tot 24 uur en Drug Administration stroomafwaarts van de dissectie. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3 Confocale scan van autofagosomen en lysosomen in een enkele ommatidium ontleed van AW, GMR-Gal4, UAS-Atro75QN, UAS-GFP:.: Atg8 / + vliegen, uiten van een polyglutamine Atrophin mutant en de leeftijd van 12 dagen bij 29 ° C. De helderveld paneel (rechts boven) toont de bijna intact structuur van de ommatidium en het frame geeft het gescande gebied. Rode vlekken Lysosomen, groen de autofagosomen, auto-lysosomen, waardoor door de fusie van de twee organellen, verschijnen geel. De pijlpunten geven aan twee lopende fusie gebeurtenissen tussen autofagosomen en lysosomen.

<ol><li>Marsh, J. L., Thompson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+in+the+study+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila in the study of neurodegenerative disease.</a> Neuron. 52, 169-178 (2006).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li>
<li>Nisoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+by+polyglutamine+Atrophin+is+not+rescued+by+induction+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration by polyglutamine Atrophin is not rescued by induction of autophagy.</a> Cell Death Differ. 17, 1577-1587 (2010).</li>
<li>Charroux, B., Fanto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+line+between+waste+disposal+and+recycling%3A+DRPLA+fly+models+illustrate+the+importance+of+completing+the+autophagy+cycle+for+rescuing+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The fine line between waste disposal and recycling: DRPLA fly models illustrate the importance of completing the autophagy cycle for rescuing neurodegeneration.</a> Autophagy. 6, 667-669 (2010).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+potassium+channels+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive potassium channels in Drosophila photoreceptors.</a> J Neurosci. 11, 3079-3095 (1991).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in neurosciences. 24, 251-254 (2001).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li>
<li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Dev Biol. 351, 128-1234 (2011).</li>
<li>Napoletano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+Atrophin+provokes+neurodegeneration+in+Drosophila+by+repressing+fat%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine Atrophin provokes neurodegeneration in Drosophila by repressing fat.</a> The EMBO journal. 30, 945-958 (2011).</li>
<li>Ravikumar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mTOR+induces+autophagy+and+reduces+toxicity+of+polyglutamine+expansions+in+fly+and+mouse+models+of+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease.</a> Nature. 36, 585-595 (2004).</li>
<li>Zou, S., Meadows, S., Sharp, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+study+of+aging+and+oxidative+stress+response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide study of aging and oxidative stress response in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13726-13731 (2000).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De single ommatidium dissectie hier gepresenteerde maakt collectie van diepere celbiologische informatie over processen, zoals neurodegeneratie, toen gemodelleerd in het Drosophila oog. De fotoreceptor neuronen zijn gemakkelijker toegankelijk dan andere neuronen en ze cytoplasma is bijzonder groot, en dus geschikt om blaasje dynamiek studie, in de zeer bekwaam dezelfde cellen gebruikt in tal van modellen om neurodegeneratie in vivo te kwantificeren. De kritische aspect van de dissectie is vooral de mog...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> Draagbare CO2 Dispenser </td><td> Flystuff </td><td> 59-150 </td><td> Vullingen ook beschikbaar </td></tr><tr><td> DUMONT Tweezer nr. 5 </td><td> AGAR Wetenschappelijke </td><td> T5034 </td><td></td></tr><tr><td> 3-Well glasplaatje </td><td> EMS </td><td> 71561-01 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-schaar </td><td> VWR </td><td> HAMMHSB516-09 </td><td></td></tr><tr><td> Schneider&#39;s Medium </td><td> VWR </td><td> 733-1663 </td><td></td></tr><tr><td> LysoTracker Red DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L7528 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost Slides </td><td> VWR </td><td> 631-0108 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield met DAPI </td><td> Vector Labs </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> VWR </td><td> 631-1336 </td><td></td></tr></tbody></table>

single drosophila ommatidium dissection en imaging

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

De fruitvlieg Drosophila melanogaster heeft waardevolle bijdragen aan neurowetenschappelijk onderzoek en is op grote schaal gebruikt als een model voor neurodegeneratieve ziekten als gevolg van de krachtige genetica 1. De vlieg oog in het bijzonder is het orgaan van de keuze voor neurodegeneratie onderzoek, zijnde de meest toegankelijke en leven overbodig onderdeel van het Drosophila zenuwstelsel. Maar de belangrijkste waarschuwing van intacte ogen is de moeilijkheid, vanwege de intense autofluorescentie van het pigment, in beeldvorming intracellulaire evenementen, zoals autofagie dynamiek 2, die van cruciaal belang voor het begrijpen van neurodegeneratie. We hebben recent gebruikte de dissectie en de cultuur van enkele ommatidia 3, dat is van essentieel belang geweest voor ons begrip van Autofagie disfuncties in een vlieg model van Dentatorubro-Pallidoluysian Atrofie (DRPLA) 3, 4. We hebben nu rapport een uitgebreide beschrijving van deze techniek (figuur 1), aangepast van elektrofysiologische studies 5, die waarschijnlijk drastisch uit te breiden de mogelijkheid van vliegen modellen voor neurodegeneratie. Deze methode kan worden aangepast om de afbeelding te leven subcellulaire evenementen en effectieve toediening van het geneesmiddel te controleren op fotoreceptorcellen (afb. 2). Indien gebruikt in combinatie met mozaïek technieken 6-8, kunnen de reacties van genetisch verschillende cellen worden getest in parallel (afb. 2).

De beperkende factor in het gebruik van de volwassen<em&gt; Drosophila</em&gt; Oog voor neurodegeneratie en celbiologie onderzoek is het moeilijk beeldvorming van intracellulaire processen. We beschrijven de ontleding van enkele ommatidia om een ​​bonafide primaire neuronale cel-cultuur, die kan worden onderworpen aan medicamenteuze behandeling en geavanceerde imaging te genereren.

Single Drosophila Ommatidium Dissection en Imaging

De fruitvlieg Drosophila melanogaster heeft onschatbare bijdragen geleverd aan het neurowetenschappelijk onderzoek en is op grote schaal gebruikt als model voor neurodegeneratieve ...

Het algemene doel van deze procedure is om enkelvoudige drosophila of matia te dissekeren en te beelden om intracellulaire gebeurtenissen in neurodegeneratiemodellen te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst de kop van de vlieg van de rest van het lichaam te scheiden en deze open te snijden.Vervolgens worden de hersenen en andere weefsels uit de kop verwijderd. Daarna wordt de cuticula verwijderd en wordt elk netvlies in tweeën gesneden. De laatste stap van de procedure is het uitsteken van de O met een wolfraamnaald en het plaatsen hiervan op een objectglas.Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die cytoplasmatische autofagische organellen aantonen via fluorescentie-confocale microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het celbiologische analyse met een hoge resolutie mogelijk maakt in drosophila-modellen voor neurodegeneratie, die tot nu toe alleen genetische inzichten in dit veld konden bieden, wat aantoont dat de procedure variabel zal zijn. Een promovendus uit mijn laboratorium met de hulp van Daniel Mackay, een histologie- en microscopietechnicus aan het centrum.Vul ter begin één putje van een glazen objectglas met drie putjes met fosfaatgebufferde zoutoplossing en anesthetiseer vervolgens de vliegen met kooldioxide. Zodra de vliegen zijn geanesthetiseerd, pakt u met een pincet één enkele vlieg op en plaatst u deze in het kleine schaaltje met PBS. Knijp onder een dissectiemicroscoop met een pincet in de proboscis en scheid vervolgens de kop van het lichaam door de nek door te snijden.Gebruik een tweede set pincetten om de kop van de vlieg bij de proboscis vast te houden en knip de kop met microschaartjes langs de laterale rostrale middellijn doormidden. Om de hersenen bloot te leggen, gebruikt u een afgeknipt pipetpuntje om de kop op te pakken, bevestig de retina en breng deze over naar een andere put die gevuld is met Schneider-medium. Verwijder het grootste deel van de kopcuticula met een pincet en neem vervolgens de hersenen uit.Houd het netvlies ingeklemd tussen het lamella en het hoornvlies. Breng het netvlies vervolgens over naar een druppel van 50 µL vers Schneider-medium. Plaats dit direct op een glazen objectglas en pak met een pincet of microschaar ofwel het meest dorsale of het meest ventrale uiteinde van het netvlies vast.Snijd het netvlies langs de dorsoventrale middellijn doormidden om de AMIA in het midden van het oog bloot te leggen. Blijf het netvlies zo vasthouden dat het hoornvlies naar beneden is gericht en de lamina naar boven. Los met een fijne wolfraamnaald eerst de oia van de lamina en vervolgens van het hoornvlies.Enkelvoudige oia en groepen OIA zullen zich verzamelen op de bodem van het putje of het objectglas. Verwijder eventuele grotere debris die zich mogelijk hebben verzameld voordat u verdergaat. Om autofagie te analyseren, verdunt u LysoTracker 1:1000 in een druppel Schneider-medium, mengt u dit en wacht u 10 seconden.Verwijder het overtollige vloeistof van het objectglas, waarbij zorgvuldig wordt gewaakt dat de AMIA achterblijft. Voeg een druppel vector shield toe om de AMIA te bedekken.Breng een dekglas aan en verzegel dit met nagellak. Met behulp van confocale microscopie kunnen zowel fagosomen, gemarkeerd met GFP-ATG8, als lysosomen, gemarkeerd met LysoTracker, worden gevisualiseerd in een enkel tedium dat is gedisseceerd uit een vlieg die een mutante vorm van atropine tot expressie brengt. Het brightfield-paneel rechtsboven toont de bijna intacte structuur van het tedium, en het kader geeft het gescande gebied aan. Hier markeert rood de lysosomen en markeert groen het autofagosoom.De autolysosomen, die ontstaan uit de fusie van de twee organellen, verschijnen geel. Na deze procedures kunnen andere methoden, zoals het kweken van materiaal en het toedienen van geneesmiddelen, worden uitgevoerd om verschillende vragen te beantwoorden. Zoals de effectieve verbindingen op de autofagie-indicatoren in neuronen met verschillende genetische achtergronden.Het combineren van de voordelen van drosophila-genetica met geavanceerde celbiologische analyses die mogelijk zijn in celkweek.

single-drosophila-ommatidium-dissection-and-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Bij insecten, het oenocytes produceren cuticulair koolwaterstofverbindingen. Deze verbindingen te beschermen tegen uitdroging en vergemakkelijken chemische communicatie. Hier laten we zien een dissectie techniek die gebruikt wordt om de oenocytes isoleren van...

Dissectie van Oenocytes tegen Adult Drosophila melanogaster</em

Een standaard aanpak voor volwassenen voor te...

De voorbereiding van Adult Drosophila Ogen voor Thin Sectioning en microscopisch onderzoek

De rechtopstaande beeldvormingsmethode die in dit protocol wordt beschreven, maakt de gedetailleerde visualisatie mogelijk van de polen van een zich ontwikkelend Drosophila melanogaster -ei. Deze uiteinden-op-weergave biedt een nieuw perspectief op de arrangementen en morfologieën van meerdere celtypen in het folliculaire epitheel.

Rechtop Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

De Drosophila eierstok is een uitstekende modelsysteem voor het bestuderen van de stamcel niche ontwikkeling. Hoewel de methoden voor het ontleden van larvale en volwassen eierstokken zijn gepubliceerd, vereisen pop eierstok dissecties verschillende technieken die niet zijn gepubliceerd in detail. Hier duidelijk naar voren komt een protocol voor ontleden, kleuring en montage van de pop eierstokken.

Dissectie en kleuring van Drosophila pop eierstokken

Dit protocol is ontworpen voor de beeldvorming en analyse van de dynamiek van celoriëntatie en weefselgroei in de Drosophila abdominale epithelia terwijl de fruitvlieg een metamorfose ondergaat. De hier beschreven methodologie kan worden toegepast op de studie van verschillende ontwikkelingsstadia, weefsels en subcellulaire structuren in Drosophila of andere modelorganismen.

Beeldvorming en analyse van weefseloriëntatie en groeidynamiek in de ontwikkeling van Drosophila Epithelia tijdens pupale stadia

Er wordt een protocol gepresenteerd dat de visualisatie van intacte Drosophila melanogaster in elk stadium van ontwikkeling mogelijk maakt met behulp van microcomputed tomografie.

Whole Animal Imaging van Drosophila melanogaster met behulp van Microcomputed Tomography

Hier bieden we een dissectieprotocol dat nodig is om de late embryonale Drosophila mannelijke geslachtsklier live in beeld te brengen. Dit protocol zal observatie van dynamische cellulaire processen onder normale omstandigheden of na transgene of farmacologische manipulatie mogelijk maken.

Dissectie en live-imaging van de late embryonale drosophila gonad

In Drosophilaondergaat de oöcytkern microtubuli-afhankelijke migratie tijdens oogenese. Hier beschrijven we een protocol dat is ontwikkeld om de migratie te volgen door live beeldvorming uit te voeren op eierkamers ex-vivo. Onze procedure houdt de eierkamers 12 uur in leven om multi-position 3D time-lapse films te verkrijgen met behulp van spinning-disk confocale microscopie.

Nucleaire migratie in de Drosophila Oocyte

Hier bieden we een gedetailleerd protocol om live beeldvorming uit te voeren van de asymmetrische deling van germinale stamcellen (GSC's) in de Drosophila ovarium-niche. We gebruiken een transgene lijn die ubiquitair een groen fluorescent eiwit (GFP) tot expressie brengt, een fusie van het spectrosoom-eiwit Par-1.

Uitgebreide live beeldvorming van vrouwelijke Drosophila melanogaster kiembaanstammecellen niches

Hier presenteren we een snelle, goedkope workflow voor beeldvorming met hoge resolutie van volwassen Drosophila-ogen om patronen en groeidefecten te kwantificeren. We beschrijven ons protocol voor monstervoorbereiding door middel van puntmontage, beeldacquisitie met hoge resolutie en beeldanalyse.

Een snelle, eenvoudige workflow voor het kwantificeren van externe volwassen Drosophila-structuren

Leer hoe u enkele Drosophila ommatidia dissecteert en beeldt om intracellulaire processen in neurodegeneratiemodellen te bestuderen. Deze methode maakt hoogwaardige celbiologische analyse mogelijk.

Single Drosophila Ommatidium Dissection en Imaging

Meer video's verkennen