Multi-foton Imaging van de tumorcel invasie in een orthotope Muis Model van Oral plaveiselcelcarcinoom

Het algemene doel van deze procedure is om een muismodel voor mondkanker te produceren waarmee de visualisatie en kwantificering van tumorinvasie in de tong mogelijk is. Dit wordt bereikt door eerst orale plaveccelcarcinoomcellen te genereren voor tweefoton-imaging via lentivirale infectie van life Act M cherry en stabiele clonale selectie. Vervolgens worden orthotope xenografttumoren geproduceerd in naaktmuizen door injectie van met life Act M cherry gelabelde cellen in de tongen van geanestheseerde muizen.

Vervolgens worden de tumoren in de tongen gevisualiseerd met tweefotonmicroscopie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een gekwantificeerde lokale orale tumorinvasie in de tongspier aantonen via tweefoton-imaging van vers tongweefsel en een daaropvolgende computergestuurde driedimensionale reconstructie van primaire tumoren en regionaal geïnvadeerde celgroepen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals immunohistochemie of bioluminescente imaging, is dat tumorcelinvasie kwantitatief in drie dimensies kan worden gemeten.

De implicaties van deze techniek reiken tot therapeutische interventies bij mondkanker, omdat het een modelsysteem biedt voor de analyse van proteïnen die betrokken zijn bij tumorinvasie, evenals voor de evaluatie van preklinische verbindingen voor anti-invasieve therapeutische strategieën. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze techniek moeite hebben, aangezien de injectie van de tumorcellen in de tong en de preparatie van de tong voor tweefotonmicroscopie technisch veeleisend zijn en vaardigheid en oefening vereisen. Visualisatie van deze methode is cruciaal, omdat de stappen voor tumorinjectie en tweefotonmicroscopie moeilijk aan te leren zijn en gespecialiseerde vaardigheden vereisen om met de kweek te beginnen.

Menselijke tumorcellijnen van hoofd en hals in compleet medium bestaande uit DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline-streptomycine en 1% niet-essentiële aminozuren. Om de LIFE Act mCherry-coatingserie in de PLL 7.0 lentivirale vector over te brengen, is eerst site-directed mutagenese vereist om drie stille mutaties in de SBF1-herkenningsplaats in de ouderlijke mCherry cDNA te introduceren. Vervolgens wordt de gemodificeerde Life Act mCherry-sequentie met flankerende EcoR1- en SBF1-plaatsen via PCR geamplificeerd en gesubkloneerd in de PLL 7.0. Om een PLL 7.0 LIFE Act mCherry-construct te genereren via een lentiviraal expressiesysteem, wordt de verpakkingscellijn 293T tot 17-40% confluentie in compleet medium gekweekt.

Transfecteer de cellen met CalFoss met de PLL 7.0 LIFE Act M cherry PS PACS twee en P-V-S-V-G vectoren in een verhouding van respectievelijk 3:2:1. Vervang na 24 uur het medium door vers, compleet medium, verzamel en vul het medium elke 12 uur aan gedurende 72 uur, en bewaar het verzamelde medium bij 4 °C om hoofd- en nekhulpcellijnen met stabiele LIFE Act M cherry-expressie te produceren. Centrifugeer het verzamelde medium bij 2000 RPM gedurende 10 minuten bij 4 °C en voeg 1 mL van het geklaarde medium dat het virus bevat toe aan de OSC 19- of US CCC 1-cellen voor 12 uur.

Spoel de cellen af en voeg vervolgens nog één milliliter virus toe voor een verdere periode van 12 uur. Kweek de cellen gedurende twee weken in medium dat 200 milligram per milliliter puromycine bevat om resistente kolonies te selecteren. Screen de overlevende kolonies visueel op mCherry-expressie middels fluorescentiemicroscopie. Trypsiniseer individuele positieve kolonies met steriele cloning discs van drie millimeter.

Houd de positieve cellen in medium met 200 mg/mL puromycine tot ze worden ingevroren of worden gebruikt voor orthotope injectie om een orthotoop tumorxenograft te genereren. Trypsiniseer de mCherry-expresserende tumorcellen, centrifugeer vervolgens de cultuur en resuspendeer ongeveer 2,5 × 10⁴ cellen in 50 µL volledig medium. Laad de tumorcellen in een spuit van 1 mL voorzien van een 27 gauge naald van een halve inch.

Anestheseer vervolgens een acht weken oude vrouwelijke athymische naakte muis met een combinatie van 80 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine. Zodra het dier stopt met bewegen, brengt u een oogsmeer aan en controleert u de reactiviteit door met een vingernagel in het voetkussentje te drukken.

Houd de muizen op een warmtemat tussen 37 en 40 °C. Pak met steriele pincetten voorzichtig de punt van de tong vast en trek deze uit de mondholte. Injecteer de cellen langzaam in één zijde van elke tong om een bolvormige massa in het centrum van de tong te creëren.

Injecteer de muizen met 2,1 milligram per kilogram yohimbine en plaats ze terug op het warmtekussen om hen te monitoren tijdens het herstel van de anesthesie. Plaats de muizen in steriele kooien met een zacht transgeen deegdieet. Weeg de muizen elke twee tot drie dagen en monitor hen visueel op het ontstaan van tumoren.

Om muizentongen voor ex vivo imaging voor te bereiden, worden muizen met tumoren op verschillende tijdstippen geëuthanaseerd. Haal de tongen na euthanasie via koolstofdioxide-inhalatie uit de muizen en spoel deze met 1XPBS. Gebruik vervolgens monofilament naaigaren van een lokale hobbywinkel en een naald van maat acht.

Bevestig de tong aan één zijde van een conventionele cassette voor paraffine-inbedding van weefsel. Zodra de tong is geïmmobiliseerd, wordt de gehele cassette-assemblage ondergedompeld in 1x PBS. Verwerk de tongen onmiddellijk met tweefotonmicroscopie om beelden van de tongen vast te leggen met tweefotonmicroscopie.

Dompel de tongcassettes onder in een schaal van 60 millimeter met XPBS. Bevestig de schaal in een op maat gemaakte houder op een uitschuifbare cantileverarm, gepositioneerd onder het objectief van de tweefotonmicroscoop. Plaats een water-dipping objectief met een numerische apertuur van 40 x 0,8 direct op of boven een zichtbare tumorlaesie.

Beeld de tong in met tweefotonenmicroscopie met de titanium-saffierlaser bij een intensiteit van 60 milliwatt en een inputgolflengte van 755 nanometer. Om het M-cherry-signaal te optimaliseren, worden seriële laser-scanbeelden verzameld met stappen van 1 micrometer over een totale weefseldiepte tussen 15 en 100 micrometer. Met deze configuratie kunnen tumoren tot een weefseldiepte van 1 millimeter worden geanalyseerd.

Gebruik scan image voor het vastleggen van beelden. Scan image genereert een tweekanaals output van raster-scanpatronen om de XY-galvanometrische scan-spiegels aan te sturen en legt tegelijkertijd een signaalinput van maximaal vier kanalen vast vanuit fotomultiplicatieruizen via een data-acquisitiebord. Scan image verzamelt Z-stack-beelden door de Z-as van het objectief aan te sturen en legt time-lapse-beelden vast in een enkelvoudige of cyclische modus.

Sla de beelden op in één enkel TIF-bestand met een bitdiepte van 16 bit. Render met behulp van de Amira-software de tumorbeeldstacks tot één driedimensionaal beeld door het TIF-bestand te openen dat de set Z-stackbeelden bevat. Gebruik de TEX-functie om een driedimensionale rendering te genereren.

In de gerenderde afbeelding zal waarschijnlijk een grote primaire tumor zichtbaar zijn, samen met enkele kleinere, losgekoppelde invasieve groepen of ig's. Om het tumorvolume te meten, definieert u de drempelwaarde voor het gebied van de primaire tumor en elke plak van de beeldstapel om achtergrondfluorescentie te corrigeren en te elimineren. Herhaal de drempelwaardeprocedure voor elke invasieve groep.

Zodra de primaire tumor en alle ig's zijn geselecteerd, wordt de volumemeting en de X-, Y- en Z-tumor OID-coördinaten voor de primaire tumor bepaald. Om de afstanden van de ig's vanaf het centrale tumorpunt te berekenen, wordt de tumorinvasieve index of ti berekend met de formule ti = NT × VT × dt. Hierbij is NT het totale aantal ig's in de afbeelding, VT het totale volume van alle ig's en DT de totale afstand die alle invasieve groepen vanaf het centrum van de primaire tumor hebben afgelegd.

Driedimensionale weergaven met meer topografische details kunnen worden gegenereerd door de oorspronkelijke 16-bit monochrome tipbestanden in Nikon NIS elements binnen de software te importeren. Maak een ND-bestand van een beeldstack. Kalibreer vervolgens het document handmatig om de pixelgrootte te specificeren voor weergaven van hogere kwaliteit.

Voeg extra coupes toe in het Z-vlak. Deze figuur toont een voorbeeld van de ruwe gegevens verkregen uit een tweefotonafbeelding met NIS elements of een mirror software. Deze software kan worden gebruikt om de ruwe gegevens van tongtumoren te reconstrueren, zoals in deze figuur wordt getoond.

Dit paneel toont een voorbeeld van de driedimensionale weergave met gebruik van de TEX-functie in de Amira-software. Hier is een voorbeeld van het drempelwaarde-instellen (thresholding) van een individuele tweefotonsectie uit de beeldstapel om invasieve groepen van de primaire tumor, evenals het centrum of de oïde van de primaire tumor, te identificeren. Nadat elke drempelwaarde-sectie is geanalyseerd, kwantificeert Amira het volume en de afgelegde afstand van elke invasieve groep vanaf het Centro.

Deze gegevens kunnen grafisch worden weergegeven en gebruikt om de numerieke waarde voor de volledige mate van tumorcelinvasie te bepalen. Wat betrekking heeft op de primaire locatie, zijn hier representatieve afbeeldingen van tumoren getoond zoals gevisualiseerd via conventionele pathologische immunohistochemische kleuring, vergeleken met een driedimensionale afbeelding van een soortgelijke tumor met behulp van het beschreven protocol. Zodra de techniek volledig onder de knie is, van de extractie van de tong tot de uiteindelijke 3D-rendering, kan deze procedure in ongeveer twee uur worden voltooid indien correct uitgevoerd. Let bij het uitvoeren van deze procedure op dat de tong niet met de naald wordt doorprikt, om te voorkomen dat tumorcellen verloren gaan en de tumoropname wordt belemmerd. Na deze procedure kan het testen van therapeutische verbindingen of cellen met gemanipuleerde eiwitniveaus worden uitgevoerd om hun effectiviteit op de invasie van mondkanker te bepalen.

In een in vivo setting dient u er rekening mee te houden dat het werken met menselijke tumorcellen die met lentivirus zijn gemodificeerd gevaarlijk is; er moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het gebruik van geschikte PBM en het werken in een BSL-2 gecertificeerde laminaire flowkast bij het werken met geïnjecteerde muizen.