Name: Multi-foton Imaging van de tumorcel invasie in een orthotope Muis Model van Oral plaveiselcelcarcinoom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Leer multi-foton microscopie voor kwantitatieve beeldvorming van tumorinvasie in een orthotopisch muismodel van oraal plaveiselcelcarcinoom. Deze methode ondersteunt de evaluatie van anti-invasieve therapeutische verbindingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ondersteund door een deelproject van het NIH subsidie ​​P20 RR16440 en een brug subsidie ​​van de West Virginia University Office of Research en Graduate Onderwijs om S. Weed. Technische bijstand van L. Lopez-Skinner tijdens de vroege fasen van projectontwikkeling is dankbaar erkend. De auteurs zijn ook dankbaar voor technische bijstand en OSC19 cellen van J. en M. Myers Younes (Department of Head and Neck Surgery, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX), P. Turner en K. Secrest (Universiteit van West Virginia Department of pathologie Tissue Bank) voor de histologische verwerking en procedures, R. Wysolmerski (West Virginia University, Department of Neurobiologie en Anatomie) voor de LifeAct-mCherry construeren en J. Beer (Universiteit van North Carolina) voor de pLL7.0 lentivirale vector. Het gebruik van de West Virginia University Microscopie Imaging Facility (ondersteund door NIH subsidie ​​P20 RR16440 en de Maria Babb Randolph Cancer Center) en de niet-lineaire optische microscopie laboratorium (NLOM, ondersteund door een gezamenlijke samenwerking tussen de West Virginia University Center for Neuroscience en de Universiteit van West Virginia Department of Physics / West Virginia Nanoscience Initiative) is ook dankbaar erkend. De NLOM wordt gedeeltelijk ondersteund door de NIH subsidie ​​P30 RR031155 aan het Center for Neuroscience.

1. Cellijnen, Vector Constructie en Productie Lentivirale <ol><li> Menselijk hoofd en nek tumorcellen lijnen (OSC19 of UMSCC1) werden gekweekt in volledige media bestaande uit DMEM (Cellgro cat # 50-003-PB) aangevuld met 10% foetaal runderserum FBS (Hyclone cat # SH30070.03), 1% penicilline / streptomycine (Cellgro cat # 30-002-CI), en 1% niet-essentiële aminozuren (Cellgro cat # 25-025-CI). </li><li> Voor de overdracht van het LifeAct-mCherry coderende sequentie in de pLL7.0 lentivirale vector, was de Sbf1 herkenningsplaats in de bovenliggende mCherry cDNA veranderd door de invoering van drie stille mutaties in de herkenningssequentie met behulp van plaats-gerichte mutagenese (Stratagene cat # 200518-5). De resulterende gewijzigde LifeAct-mCherry sequentie werd vervolgens PCR geamplificeerd met begeleidende EcoR1/Sbf1 sites en gesubkloneerd in pLL7.0 aan de pLL7.0-LifeAct-mCherry bouwen genereren. </li></ol> 2. pLL7.0-LifeAct-mCherry Virus Production <ol><li> Virale productie werd uitgevoerd volgens de Lentivirale Expression Systems handleiding (System bio-versie 2-051018). </li><li> De verpakking cellijn 293T/17 cellen (ATCC CRL-cat # 11268) was gegroeid naar 40% confluentie in dezelfde volledige media die worden gebruikt voor SCCHH lijnen. </li><li> Cellen werden getransfecteerd met de pLL7.0-LifeAct-mCherry, psPAX2, en pVSV-G vectoren in een verhouding 03:02:01, respectievelijk met behulp van CalPhos (Clontech cat # 631312). </li><li> Na 24 uur werd de eerste media uit de transfectie vervangen door verse media. </li><li> Media werd dan verzameld en aangevuld om de 12 uur gedurende 72 uur en bewaard bij 4 ° C. </li></ol> 3. De productie van hoofd en hals cellijnen met Stable LifeAct-mCherry Expression <ol><li> De verzamelde media werd gesponnen bij 2000 rpm gedurende 10 minuten bij 4 ° C. </li><li> Een ml verduidelijkt media met virus werd direct toegevoegd aan OSC19 of UMSCC1 cellen voor 12 uur. Cellen werden vervolgens gespoeld, en een extra mL van het virus werd toegevoegd voor een periode van 12 uur. </li><li> Cellen werden behandeld met media die 200mg/ml puromycine voor twee weken naar resistente kolonies te selecteren. </li><li> Overleven klonen werden visueel gescreend op LifeAct-mCherry expressie door fluorescentie microscopie. Individuele positieve kolonies werden typsinized met behulp van steriele 3mm klonen schijven (Fisher cat # 0790710A). </li><li> Positieve cellen werden aangehouden in media die 200mg/ml puromycine tot bevroren terug of worden gebruikt voor orthotope injectie. </li></ol> 4. Orthotope Tumor xenograft Formation <ol><li> Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met een protocol (09 tot 0821), goedgekeurd door de Universiteit van West Virginia Dierverzorging en gebruik Comite. </li><li> LifeAct-mCherry expressie tumorcellen werden getrypsiniseerd, gecentrifugeerd en 2,5 x 10 4 cellen werden opnieuw gesuspendeerd in 50 uL complete media. </li><li> Tumorcellen werden geladen in een een ml injectiespuit bevestigd aan een 27 ½ gauge naald. </li><li> Vrouw athymische Fox1 nu / nu muizen leeftijd van 8 weken (Harlan Laboratories) werden verdoofd met een combinatie van 80mg/kg ketamine en xylazine 10mg/kg. Verdoofde muizen werden gehouden tussen 37-40 ° C op een verwarmingselement. </li><li> Met behulp van steriel pincet, was het puntje van de tong zachtjes pakte en voorzichtig getrokken uit de mondholte. </li><li> Cellen werden langzaam geïnjecteerd in een zijde van elke tong een bolvormige massa te creëren in de tong centrum, het vermijden van de linguale slagaders. </li><li> Muizen werden geïnjecteerd met 2.1mg/kg yohimbine en keerde terug naar de verwarming pad waar ze werden voor de 2-3 uur gecontroleerd tijdens het herstel van anesthesie. </li><li> Een keer nieuw leven ingeblazen, werden muizen geplaatst in steriele kooien met een zachte deeg transgene voeding (Bioserve cat # S3472). </li><li> Muizen werden gewogen om de 2-3 dagen en visueel gecontroleerd te worden op tumor ontstaan. </li></ol> 5. Voorbereiding van de muis Tongen voor Ex-vivo Imaging <ol><li> Muizen herbergen tumoren op verschillende tijdstippen (meestal 2-4 weken post-injectie) werden gedood door de kooldioxide inademing. </li><li> Tongen werden geëxtraheerd, gespoeld met 1X PBS en verbonden aan een kant van een conventionele paraffine tissue inbedding cassette (StatLab Cat # H104,) met behulp van monofilament naaigaren van een lokale hobby winkel en een maat 8 naald. </li><li> Nadat de tongen werden geïmmobiliseerd, werd de hele cassette montage geplaatst in een 30mm weefselkweek schotel en ondergedompeld in 1X PBS. </li><li> Verwerkte tongen werden meteen gebruikt voor twee-foton excitatie microscopie. </li></ol> 6. Beeldvorming van tumoren Tongue met twee-foton microscopie <ol><li> Tong cassettes werden ondergedompeld in een 60mm schotel met 1X PBS vastgezet in een speciaal ontworpen houder op een intrekbare cantilever arm (kamer naar het vliegveld, Siskiyou instrumenten) gepositioneerd onder de doelstelling van een rechtopstaande microscoop (Verplaatsbare Microscoop (MOM); Sutter Instruments). </li><li> Een 40X/0.8NA water te dompelen objectief werd direct die op of over zichtbare Tumof letsels. Tongen werden afgebeeld door twee-foton microscopie met de Ti: saffier laser (Mira, Coherent) intensiteit van 60 mW en input golflengte van 755 nm tot de mCherry signaal te optimaliseren. </li><li> Serial 1mm laser scanning beelden werden verzameld op een micrometer incrementele diepte over een totale weefsel diepte tussen 15 en 100 micrometer (afhankelijk van de tumor volume). Beelden werden vastgelegd met behulp van scanimage, een open source-programma op basis van de MATLAB-platform dat werd ontwikkeld door de Karel Svoboda laboratorium (Janelia Farms, HHMI). Scanimage genereert een twee-kanaals output van raster-scan patronen op de x / y galvanometrische scan spiegels controle, en tegelijkertijd legt een maximum vier-kanaals signaal ingang gelijktijdig uit fotomultiplicatorbuizen (PMT&#39;s) door middel van een data-acquisitie board (PCI-6610S , National Instruments). De PMT signalen worden versterkt door een laag geluidsniveau huidige voorversterkers (SR570, Stanford Research System) voordat wordt ingevoerd in de NI-DAQ board voor weergave op het beeldscherm. Scanimage verzamelt z-stack beelden door het beheersen van de z-as van de objectieve en verzamelt time-lapse beelden in een enkele of cyclus mode. Beelden werden opgeslagen in een enkel TIFF-bestand met 16 bit diepte. </li></ol> 7. Beeldanalyse met behulp van Amira Software <ol><li> Amira beeldvorming voor tumor kwantificering: In Aimra software, open het TIFF-bestand bevat de set van de z-stack beelden. </li><li> Markeer de bestandsnaam, selecteren en toepassen van de Voltex functie om een ​​driedimensionale weergave te genereren. Een grote primaire tumor afbeelding met een aantal kleinere, los invasieve groepen (IG) van collectief vielen cellen is meestal zichtbaar in de gerenderde afbeelding (zie figuur 6A). </li><li> Het selecteren van de primaire tumor massa, selecteert u &quot;Open Data&quot;, dan &quot;etikettering&quot;, vervolgens &quot;Label Field&quot;. </li><li> Drempeling de primaire tumor-selecteer alle z-stack afbeeldingen en bladert u door de beelden in de z-vlak aan de opname van alleen de primaire tumor massa te bereiken binnen de drie dimensies. Dit is meestal het grootste formaat afbeelding in het veld en staat deze vaak gesegmenteerd als de verbeelde wordt doorkruist door de z-vlak. </li><li> Gebruik de toverstaf / drempel functie op de achtergrond fluorescentie te corrigeren en te elimineren uit het beeld zonder waarbij een eventueel van de tumor signaal. Markeer de &quot;Inside File&quot; label en klik op de knop ⊕. Selecteer de &quot;alle segmenten&quot; in. Dit levert een gekleurde rand rond de thresholded primaire tumor gebied in ieder z-stack te verhogen. </li><li> Te selecteren GR, kies dan de &quot;New&quot;-functie. Selecteer een IG en zorg dat is niet geassocieerd met de primaire tumor door te bladeren door de z-vlak. </li><li> Selecteer &quot;Alle Slices &#39;en klik op de knop ⊕. Hernoem het bestand (ex: IG 1) </li><li> Herhaal de drempelmethode procedure in 7.4 en de accentuering stap in 7.5 voor de vastgestelde IG. Kies een kleur anders is dan de kleur die wordt gebruikt om de primaire tumor massa aan te duiden. </li><li> Herhalen als nodig is voor elke extra IG het hele beeld, scannen via het z-vlak te zorgen dat alle GR worden aangeduid. Met behulp van verschillende kleuren voor elk geïdentificeerd IG helpt in de toekomst identificatie op de afbeelding. </li><li> Zodra de primaire tumor en alle GR zijn geselecteerd, &quot;Segmentation&quot; uit het pulldown menu te selecteren, selecteer dan &quot;Material Statistics&quot;. Dit zorgt voor het volume meet als de X, Y en X tumor kern coördinaten voor de primaire tumor, om afstanden van GR te berekenen van het centrale tumor punt. </li><li> Met de volumes berekend, bepalen van de afstand voor elke IG van de centrale kern van de primaire tumor. Selecteer &quot;Segmentatie&quot; en vervolgens &quot;Materiaal Statistics&quot;. Deze stap berekent alle afmetingen in pixels. Om te zetten pixels tot micrometers op basis van de kalibratie van de microscoop doelstelling en eventuele extra stijgingen van vergroting (dat wil zeggen; zoom functies). Voor de microscoop en de instellingen gebruikt in deze experimenten werd de 40X objectief gebruikt zonder zoom, het geven van een kalibratie van 1 pixel = 0,298 micrometer. Gegevens importeren in een Excel spreadsheet, welke parameters geeft voor de primaire tumor in drie dimensies (X1, Y1, Z1) en voor elke IG (ex: X2, Y2, Z2 voor de eerste IG). </li><li> De binnengevallen afstand in microns voor elke IG van het centrum van de primaire tumor wordt berekend met de formule √ ((X2-X1) 2 + (Y2-Y1) 2 + (Z2-Z1) 2). </li><li> De tumor invasieve index (T I) wordt berekend volgens de formule T I = N T x V T x D T, waarbij N T = het totaal aantal GR in het beeld, V T = het totale volume van alle GR, D T = totale afgelegde afstand van alle invasieve groepen uit het centrum van de primaire tumor. </li></ol> 8. Drie dimensionale renderings met Nikon NIS-Elements-software <ol><li> Drie dimensionale renderings met meer topografische details kunnen worden gegenereerd door het importeren van de oorspronkelijke 16-bits monochrome TIFF-bestanden van de gehele tumor afbeelding in de Nikon NIS-Elements-softwarepakket (Nikon, Melville, NY). Selecteer &quot;File&quot;, dan &quot;ND&quot;, dan &quot;Create ND bestand van File Sequence&quot;. Selecteer de TIFF z-series image stack en geef de juiste stapgrootte. </li><li> Kalibreer de ND document in het xy-vlak. Geef de grootte van een pixel met behulp van een handmatige kalibratie. </li><li> Kies de &quot;Volume View&quot;. Gebruik de &quot;HQ&quot; functie om extra sneetjes in de z-vlak te berekenen voor een hogere kwaliteit. In de &quot;3D Renderer Settings&quot;, gebruik dan de &quot;Advanced Renderer&quot; met een kwaliteit van de &quot;Ultra High Details&quot; en &quot;Full Resolution&quot;. Kies &quot;Alpha Blending&quot; het accentueren van de tumor oppervlakken. </li><li> Optimaliseer de drie-dimensionale afbeelding voor een presentatie. Zoom in op de tumor en de bijbehorende GR en gewas als nodig is. Draai het beeld in de xyz vliegtuigen en pas de Luts. </li><li> Leg de afbeelding voor een presentatie. Selecteer &quot;Bewerken-Weergave maken Snapshot (8 bit RGB)&quot;. Naam en dienovereenkomstig te slaan bestand. </li></ol> 9. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Algemene schematische illustreren belangrijke stappen in orthotope tong tumor de productie en de in situ twee foton beeldvorming. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Injectie van LifeAct-mCherry expressie OSC19 cellen die in de muis tong. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3 resectie tumor-bevattende muis tong voorbereid voor twee photon imaging. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. Oriëntatie van een tumor-bevattende tong in positie op een twee foton microscopie klaar voor de beeldvorming. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig5.jpg" alt="Figuur 5" /> Figuur 5. Vertegenwoordiger schermafdruk van scanimage tonen ruwe data-acquisitie van de eerste twee-foton beeld. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig6.jpg" alt="Figuur 6" /> Figuur 6. Image analyse en kwantificering van tumor invasie in een orthotope OSC19 tumor. Vertegenwoordiger screen shot beelden van Amira Voltex rendering (A) en een enkele thresholded z-sectie (B) met de primaire primaire tumor beschreven in het paars, invasieve groep 1 (IG-1) die in blauw, IG-2 die in rood en IG -3 geschetst in het groen als een voorbeeld van de identificatie procedure. Pijlpunten duiden GR in (A) en (B). C. Plots van het volume ten opzichte van binnengevallen afstand voor acht afzonderlijke GR gebruikt om de tumor invasie index (Ti) te berekenen. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig7.jpg" alt="Figuur 7" /> Figuur 7. Vertegenwoordiger beelden van tumoren en tumoren groepen binnengevallen van dit protocol vergeleken met beelden van een conventionele IHC aanpak. A. paraffine deel van een hele muis tong drager zijn van een UMSCC1 orthotope tumor. Immunohistochemische kleuring werd uitgevoerd met behulp van conventionele procedures, met een primair antilichaam tegen de SCCHH-specifieke cel marker emmprin (Zymed; cat # 34 tot 5.600) op 1:1000 verdunning en gevisualiseerd met behulp van de OmniMap DAB anti-Rb detectie kit (Ventana cat # 760 -149), gevolgd door ijzer hematoxyline kleuring. Beelden omvat de totale oppervlakte tong werden individueel verzameld op 4x vergroting op een Olympus ZX70 Provis microscoop met een Optronics MicroFire CCD-camera en gereconstrueerd met behulp van de StereoINvestigator imaging-pakket (MBF Bioscience). De tumor is duidelijk op de tong tip. Een vergrote streek met aanduiding van de invasieve front en de individuele tumorcel groepen (pijlpunten) wordt getoond in (B). C. Nikon NIS-Elementen weergave van een vertegenwoordiger OSC19 tumor. Verbeterde contour detail en duidelijke visualisatie van de GR (pijlpunten), is evident. Bars in alle beelden = 100 micrometer.

<ol><li>Sano, D., Myers, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenograft+models+of+head+and+neck+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck+Oncol%22%5BJournal%5D)">Xenograft models of head and neck cancers.</a> Head Neck Oncol. 1, 32-32 (2009).</li>
<li>Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+cancer+in+the+head+and+neck+region%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Animal models of cancer in the head and neck region.</a> Clin Exp Otorhinolaryngol. 2, 55-60 (2009).</li>
<li>Myers, J. N., Holsinger, F. C., Jasser, S. A., Bekele, B. N., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+nude+mouse+model+of+oral+tongue+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An orthotopic nude mouse model of oral tongue squamous cell carcinoma.</a> Clin Cancer Res. 8, 293-298 (2002).</li>
<li>Sano, D., Myers, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+of+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+tongue%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Metastasis of squamous cell carcinoma of the oral tongue.</a> Cancer Metastasis Rev. 26, 645-662 (2007).</li>
<li>Sano, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+combination+anti-endothelial+growth+factor+receptor+and+anti-vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+targeted+therapy+on+lymph+node+metastasis%3A+a+study+in+an+orthotopic+nude+mouse+model+of+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+tongue%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">The effect of combination anti-endothelial growth factor receptor and anti-vascular endothelial growth factor receptor 2 targeted therapy on lymph node metastasis: a study in an orthotopic nude mouse model of squamous cell carcinoma of the oral tongue.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 135, 411-420 (2009).</li>
<li>Kupferman, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrkB+induces+EMT+and+has+a+key+role+in+invasion+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">TrkB induces EMT and has a key role in invasion of head and neck squamous cell carcinoma.</a> Oncogene. 29, 2047-2059 (2010).</li>
<li>Ammer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saracatinib+Impairs+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Invasion+by+Disrupting+Invadopodia+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Sci+Ther%22%5BJournal%5D)">Saracatinib Impairs Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Invasion by Disrupting Invadopodia Function.</a> J Cancer Sci Ther. 1, 52-61 (2009).</li>
<li>Rosenthal, E. L., Kulbersh, B. D., King, T., Chaudhuri, T. R., Zinn, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescent+labeled+anti-epidermal+growth+factor+receptor+antibody+to+image+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescent labeled anti-epidermal growth factor receptor antibody to image head and neck squamous cell carcinoma xenografts.</a> Mol Cancer Ther. 6, 1230-1238 (2007).</li>
<li>Gleysteen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeled+anti-EGFR+antibody+for+identification+of+regional+and+distant+metastasis+in+a+preclinical+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeled anti-EGFR antibody for identification of regional and distant metastasis in a preclinical xenograft model.</a> Head Neck. 30, 782-789 (2008).</li>
<li>Bhirde, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+killing+of+cancer+cells+in+vivo+and+in+vitro+with+EGF-directed+carbon+nanotube-based+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Targeted killing of cancer cells in vivo and in vitro with EGF-directed carbon nanotube-based drug delivery.</a> ACS Nano. 3, 307-316 (2009).</li>
</ol>

Orthotope muismodellen nuttig zijn gebleken voor het bestuderen van vele aspecten van hoofd-en halskanker 1,2. We hebben samen een gevestigde orthotope systeem van SCOT 3 met twee-foton microscopie beeldvorming van mCherry-gemerkte cellen als een systeem om het begin van de gebeurtenissen van hoofd en nek tumorcel invasie te bestuderen. In deze procedure hebben we geconstateerd dat cellen kan lekken van de plaats van de tumor injectie, vooral bij muizen zes weken of jonger wegens onvoldoende tong grootte. We maken gebruik van oudere muizen om dit probleem te voorkomen. De grotere tong grootte met oudere muizen helpt ook bij het vermijden van breuk van een linguale slagader en overmatige bloedingen uit de tong. Tumor te nemen is sterk verbeterd wanneer de tong zwelt dramatisch op de plaats van eerste injectie. Deze zwelling verdwijnt binnen een uur of twee als de ingespoten vloeistof is geabsorbeerd. Groei van de tumor lijkt evident een tot twee weken na de injectie met het aangegeven geïnjecteerde cel nummer als een kleine witte bult op de tong oppervlak. We stellen ook vast dat bij de 40X objectief gebruikt in onze studies hier gepresenteerd, kunnen we niet individuele tumorcellen te onderscheiden maar GR identificeren als invasieve cel clusters die de typische wijze van SCCHH invasie samenvatten. Tot op heden dit model wordt veelvuldig gebruikt voor het testen van de rol van specifieke moleculen evenals verscheidene anti-tumor drugs op SCOT groei van een invasie, met de werkzaamheid gemeten door cervicale lymfe gecontroleerd knooppunt metastasering met behulp van IHC-of bioluminescente methoden 4-7. Tumoren gevormd in dit systeem manifest dicht bij de tong oppervlak (Figuur 7), die de toepassing van twee-foton microscopie op het beeld gehele tumoren in situ als invasief multi-cellulaire clusters. De procedure kan ook worden gebruikt om tumor invasie te visualiseren met cellulaire resolutie. Twee-foton microscopie is eerder gebruikt om experimentele behandelingen voor hoofd-hals kanker in orthotope 8,9 en 8,10 xenograft modellen te bestuderen. Er zijn echter twee belangrijke verschillen tussen deze rapporten en onze protocol. De eerste, deze studies maken gebruik van extracellulaire labels te richten / hoofd en de nek tumor cellen te identificeren, mogelijk beperken detectie alleen tumorcellen met ruime toegang tot de circulatie. Ten tweede invasie van tumorcellen dicht bij de primaire plaats die waarschijnlijk recapituleert vroeg uitgezaaide activiteit niet was beoordeeld als een experimentele parameter. Ons protocol biedt de mogelijkheid om tumorcel invasie rechtstreeks te kwantificeren op enig moment tijdens de progressie van de tumor in de muis tongen. Terwijl de hier beschreven methode beschrijft de procedure met behulp van ontleed tongen, we zijn op dit moment in het proces van aanpassing van deze methode om de afbeelding tumor invasie in levende muizen voor gebruik in combinatie met bioluminescentie gelijktijdig te volgen begin van de invasie, de lokale betrokkenheid van de lymfeklieren en metastasen op afstand in de hetzelfde dier. Wijzigingen in het protocol voor in vivo beeldvorming vereisen het ontwerpen van een passend tijdstip voor het plaatsen en onderhouden van muizen tijdens beeldvorming, evenals een praktisch systeem om de mondholte van verdoofde muizen goed spoelen tijdens de beeldvorming procedure. Eenmaal geoptimaliseerd, zullen deze aanpassingen bieden de mogelijkheid om de rol van de potentiële pro-invasieve moleculen en het testen van anti-invasieve verbindingen op de lokale invasie en nog veel meer op afstand uitgezaaide betrokkenheid bij dieren gedurende langere perioden te bestuderen.

multi-foton imaging van de tumorcel invasie in een orthotope muis model van oral plaveiselcelcarcinoom

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regionale invasie van hoofd-en halskanker is gekoppeld aan uitgezaaide risico en presenteert een moeilijke uitdaging in het ontwerpen en implementeren van behandeling van de patiënt strategieën. Orthotope muismodellen van orale kanker zijn ontwikkeld om de studie van de factoren die invloed te vergemakkelijken invasie en als modelsysteem voor het evalueren van anti-tumor geneesmiddelen dienen. In deze systemen, is de visualisatie van uitgezaaide tumorcellen in mondholte weefsels meestal uitgevoerd door een conventionele histologie, of met in vivo bioluminescente methoden. Een van de belangrijkste nadeel van deze technieken is de inherente onvermogen om nauwkeurig te visualiseren en te kwantificeren vroege tumorcel invasie die voortvloeien uit de primaire locatie in drie dimensies. Hier beschrijven we een protocol dat een uitgewerkt model voor het plaveiselcelcarcinoom van de tong (SCOT) met twee-foton beeldvorming om multi-lingual vectorial visualisatie van tumor zich laten combineert. Het OSC-19 hoofd en de nek tumor cellijn werd stabiel ontworpen om de F-actine bindende peptide LifeAct gefuseerd met het mCherry fluorescerend eiwit (LifeAct-mCherry) te drukken. Fox1 nu / nu muizen geïnjecteerd met deze cellen vormen een betrouwbare tumoren die het mogelijk maken de tong te worden gevisualiseerd door ex-vivo toepassing van twee-foton microscopie. Deze techniek maakt het mogelijk om orthotope visualisatie van de tumormassa en lokaal binnendringende cellen in tongen weggesneden zonder onderbreking van de regionale tumor micro-omgeving. Daarnaast, dit systeem zorgt voor de kwantificering van de tumorcel invasie door het berekenen van afstanden die cellen verplaatsen binnengevallen van de primaire tumor site. Algemene deze procedure voorziet een verbeterde model systeem voor het analyseren van factoren die bijdragen aan SCOT invasie en therapeutische behandelingen afgestemd op de lokale invasie en verre metastatische verspreiding te voorkomen. Deze methode heeft ook de potentie om uiteindelijk te combineren met andere beeldvormende modaliteiten in een in vivo setting.

Een uitgebreid overzicht van de technieken die betrokken zijn bij het genereren van een muismodel van orale kanker en kwantitatieve controle van de tumor invasie in de tong door middel van multi-foton microscopie van gelabelde cellen wordt gepresenteerd. Dit systeem kan dienen als een nuttig platform voor de moleculaire beoordeling en werkzaamheid van het geneesmiddel van anti-invasieve verbindingen.

Multi-foton Imaging van de tumorcel invasie in een orthotope Muis Model van Oral plaveiselcelcarcinoom

Locoregionale invasie bij hoofd-halskanker is gekoppeld aan het risico op metastasering en vormt een aanzienlijke uitdaging bij het ontwerpen en implementeren van patiënt...

Het algemene doel van deze procedure is om een muismodel voor mondkanker te produceren waarmee de visualisatie en kwantificering van tumorinvasie in de tong mogelijk is. Dit wordt bereikt door eerst orale plaveccelcarcinoomcellen te genereren voor tweefoton-imaging via lentivirale infectie van life Act M cherry en stabiele clonale selectie. Vervolgens worden orthotope xenografttumoren geproduceerd in naaktmuizen door injectie van met life Act M cherry gelabelde cellen in de tongen van geanestheseerde muizen.Vervolgens worden de tumoren in de tongen gevisualiseerd met tweefotonmicroscopie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een gekwantificeerde lokale orale tumorinvasie in de tongspier aantonen via tweefoton-imaging van vers tongweefsel en een daaropvolgende computergestuurde driedimensionale reconstructie van primaire tumoren en regionaal geïnvadeerde celgroepen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals immunohistochemie of bioluminescente imaging, is dat tumorcelinvasie kwantitatief in drie dimensies kan worden gemeten.De implicaties van deze techniek reiken tot therapeutische interventies bij mondkanker, omdat het een modelsysteem biedt voor de analyse van proteïnen die betrokken zijn bij tumorinvasie, evenals voor de evaluatie van preklinische verbindingen voor anti-invasieve therapeutische strategieën. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze techniek moeite hebben, aangezien de injectie van de tumorcellen in de tong en de preparatie van de tong voor tweefotonmicroscopie technisch veeleisend zijn en vaardigheid en oefening vereisen. Visualisatie van deze methode is cruciaal, omdat de stappen voor tumorinjectie en tweefotonmicroscopie moeilijk aan te leren zijn en gespecialiseerde vaardigheden vereisen om met de kweek te beginnen.Menselijke tumorcellijnen van hoofd en hals in compleet medium bestaande uit DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline-streptomycine en 1% niet-essentiële aminozuren. Om de LIFE Act mCherry-coatingserie in de PLL 7.0 lentivirale vector over te brengen, is eerst site-directed mutagenese vereist om drie stille mutaties in de SBF1-herkenningsplaats in de ouderlijke mCherry cDNA te introduceren. Vervolgens wordt de gemodificeerde Life Act mCherry-sequentie met flankerende EcoR1- en SBF1-plaatsen via PCR geamplificeerd en gesubkloneerd in de PLL 7.0. Om een PLL 7.0 LIFE Act mCherry-construct te genereren via een lentiviraal expressiesysteem, wordt de verpakkingscellijn 293T tot 17-40% confluentie in compleet medium gekweekt.Transfecteer de cellen met CalFoss met de PLL 7.0 LIFE Act M cherry PS PACS twee en P-V-S-V-G vectoren in een verhouding van respectievelijk 3:2:1. Vervang na 24 uur het medium door vers, compleet medium, verzamel en vul het medium elke 12 uur aan gedurende 72 uur, en bewaar het verzamelde medium bij 4 °C om hoofd- en nekhulpcellijnen met stabiele LIFE Act M cherry-expressie te produceren. Centrifugeer het verzamelde medium bij 2000 RPM gedurende 10 minuten bij 4 °C en voeg 1 mL van het geklaarde medium dat het virus bevat toe aan de OSC 19- of US CCC 1-cellen voor 12 uur.Spoel de cellen af en voeg vervolgens nog één milliliter virus toe voor een verdere periode van 12 uur. Kweek de cellen gedurende twee weken in medium dat 200 milligram per milliliter puromycine bevat om resistente kolonies te selecteren. Screen de overlevende kolonies visueel op mCherry-expressie middels fluorescentiemicroscopie. Trypsiniseer individuele positieve kolonies met steriele cloning discs van drie millimeter.Houd de positieve cellen in medium met 200 mg/mL puromycine tot ze worden ingevroren of worden gebruikt voor orthotope injectie om een orthotoop tumorxenograft te genereren. Trypsiniseer de mCherry-expresserende tumorcellen, centrifugeer vervolgens de cultuur en resuspendeer ongeveer 2,5 × 10⁴ cellen in 50 µL volledig medium. Laad de tumorcellen in een spuit van 1 mL voorzien van een 27 gauge naald van een halve inch.Anestheseer vervolgens een acht weken oude vrouwelijke athymische naakte muis met een combinatie van 80 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine. Zodra het dier stopt met bewegen, brengt u een oogsmeer aan en controleert u de reactiviteit door met een vingernagel in het voetkussentje te drukken.Houd de muizen op een warmtemat tussen 37 en 40 °C. Pak met steriele pincetten voorzichtig de punt van de tong vast en trek deze uit de mondholte. Injecteer de cellen langzaam in één zijde van elke tong om een bolvormige massa in het centrum van de tong te creëren.Injecteer de muizen met 2,1 milligram per kilogram yohimbine en plaats ze terug op het warmtekussen om hen te monitoren tijdens het herstel van de anesthesie. Plaats de muizen in steriele kooien met een zacht transgeen deegdieet. Weeg de muizen elke twee tot drie dagen en monitor hen visueel op het ontstaan van tumoren.Om muizentongen voor ex vivo imaging voor te bereiden, worden muizen met tumoren op verschillende tijdstippen geëuthanaseerd. Haal de tongen na euthanasie via koolstofdioxide-inhalatie uit de muizen en spoel deze met 1XPBS. Gebruik vervolgens monofilament naaigaren van een lokale hobbywinkel en een naald van maat acht.Bevestig de tong aan één zijde van een conventionele cassette voor paraffine-inbedding van weefsel. Zodra de tong is geïmmobiliseerd, wordt de gehele cassette-assemblage ondergedompeld in 1x PBS. Verwerk de tongen onmiddellijk met tweefotonmicroscopie om beelden van de tongen vast te leggen met tweefotonmicroscopie.Dompel de tongcassettes onder in een schaal van 60 millimeter met XPBS. Bevestig de schaal in een op maat gemaakte houder op een uitschuifbare cantileverarm, gepositioneerd onder het objectief van de tweefotonmicroscoop. Plaats een water-dipping objectief met een numerische apertuur van 40 x 0,8 direct op of boven een zichtbare tumorlaesie.Beeld de tong in met tweefotonenmicroscopie met de titanium-saffierlaser bij een intensiteit van 60 milliwatt en een inputgolflengte van 755 nanometer. Om het M-cherry-signaal te optimaliseren, worden seriële laser-scanbeelden verzameld met stappen van 1 micrometer over een totale weefseldiepte tussen 15 en 100 micrometer. Met deze configuratie kunnen tumoren tot een weefseldiepte van 1 millimeter worden geanalyseerd.Gebruik scan image voor het vastleggen van beelden. Scan image genereert een tweekanaals output van raster-scanpatronen om de XY-galvanometrische scan-spiegels aan te sturen en legt tegelijkertijd een signaalinput van maximaal vier kanalen vast vanuit fotomultiplicatieruizen via een data-acquisitiebord. Scan image verzamelt Z-stack-beelden door de Z-as van het objectief aan te sturen en legt time-lapse-beelden vast in een enkelvoudige of cyclische modus.Sla de beelden op in één enkel TIF-bestand met een bitdiepte van 16 bit. Render met behulp van de Amira-software de tumorbeeldstacks tot één driedimensionaal beeld door het TIF-bestand te openen dat de set Z-stackbeelden bevat. Gebruik de TEX-functie om een driedimensionale rendering te genereren.In de gerenderde afbeelding zal waarschijnlijk een grote primaire tumor zichtbaar zijn, samen met enkele kleinere, losgekoppelde invasieve groepen of ig's. Om het tumorvolume te meten, definieert u de drempelwaarde voor het gebied van de primaire tumor en elke plak van de beeldstapel om achtergrondfluorescentie te corrigeren en te elimineren. Herhaal de drempelwaardeprocedure voor elke invasieve groep.Zodra de primaire tumor en alle ig's zijn geselecteerd, wordt de volumemeting en de X-, Y- en Z-tumor OID-coördinaten voor de primaire tumor bepaald. Om de afstanden van de ig's vanaf het centrale tumorpunt te berekenen, wordt de tumorinvasieve index of ti berekend met de formule ti = NT × VT × dt. Hierbij is NT het totale aantal ig's in de afbeelding, VT het totale volume van alle ig's en DT de totale afstand die alle invasieve groepen vanaf het centrum van de primaire tumor hebben afgelegd.Driedimensionale weergaven met meer topografische details kunnen worden gegenereerd door de oorspronkelijke 16-bit monochrome tipbestanden in Nikon NIS elements binnen de software te importeren. Maak een ND-bestand van een beeldstack. Kalibreer vervolgens het document handmatig om de pixelgrootte te specificeren voor weergaven van hogere kwaliteit.Voeg extra coupes toe in het Z-vlak. Deze figuur toont een voorbeeld van de ruwe gegevens verkregen uit een tweefotonafbeelding met NIS elements of een mirror software. Deze software kan worden gebruikt om de ruwe gegevens van tongtumoren te reconstrueren, zoals in deze figuur wordt getoond.Dit paneel toont een voorbeeld van de driedimensionale weergave met gebruik van de TEX-functie in de Amira-software. Hier is een voorbeeld van het drempelwaarde-instellen (thresholding) van een individuele tweefotonsectie uit de beeldstapel om invasieve groepen van de primaire tumor, evenals het centrum of de oïde van de primaire tumor, te identificeren. Nadat elke drempelwaarde-sectie is geanalyseerd, kwantificeert Amira het volume en de afgelegde afstand van elke invasieve groep vanaf het Centro.Deze gegevens kunnen grafisch worden weergegeven en gebruikt om de numerieke waarde voor de volledige mate van tumorcelinvasie te bepalen. Wat betrekking heeft op de primaire locatie, zijn hier representatieve afbeeldingen van tumoren getoond zoals gevisualiseerd via conventionele pathologische immunohistochemische kleuring, vergeleken met een driedimensionale afbeelding van een soortgelijke tumor met behulp van het beschreven protocol. Zodra de techniek volledig onder de knie is, van de extractie van de tong tot de uiteindelijke 3D-rendering, kan deze procedure in ongeveer twee uur worden voltooid indien correct uitgevoerd. Let bij het uitvoeren van deze procedure op dat de tong niet met de naald wordt doorprikt, om te voorkomen dat tumorcellen verloren gaan en de tumoropname wordt belemmerd. Na deze procedure kan het testen van therapeutische verbindingen of cellen met gemanipuleerde eiwitniveaus worden uitgevoerd om hun effectiviteit op de invasie van mondkanker te bepalen.In een in vivo setting dient u er rekening mee te houden dat het werken met menselijke tumorcellen die met lentivirus zijn gemodificeerd gevaarlijk is; er moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het gebruik van geschikte PBM en het werken in een BSL-2 gecertificeerde laminaire flowkast bij het werken met geïnjecteerde muizen.

multi-photon-imaging-tumor-cell-invasion-an-orthotopic-mouse-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een orthotope Model van sereuze eierstokkanker in immunocompetente muizen voor In vivo Tumor Imaging en Bewaking van de Tumor Immuunrespons

Bioluminescentie beeldvorming van hypoxie induceerbare factor-1α-activiteit wordt toegepast op intracraniale tumor hypoxie ontwikkeling in een borstkanker hersenmetastasen muismodel te controleren.

In vivo bioluminescentie van Tumor Hypoxie Dynamiek van Borstkanker hersenmetastasen in een muismodel

In this video, we develop an orthotopic head and neck cancer murine model by intramucosal inoculation of the squamous cell carcinoma cell line. The tumor-bearing mouse would show resemblance to clinically relevant symptoms of human disease and can thus be used to study cancer progression and discover novel therapeutic strategies.

Intramucosal Inoculation of Cancer Cells in Murine Model: A Procedure to Establish an Orthotopic Head and Neck Cancer Mouse Model

We beschrijven een werkwijze voor beeldvorming respons op...

Leef Imaging van de Drug antwoorden in de tumor micro-omgeving in muismodellen van Kanker van de Borst

We hebben een corticaal orthotope glioblastoom model vastgesteld muizen intravitale twee-foton microscopie dat de biofysische beperkingen recapituleert beginsel zullen spelen tijdens de groei van de tumor. Een chronische glazen venster vervangen van de schedel boven de tumor kan de follow-up van de progressie van de tumor na verloop van tijd door twee-foton microscopie.

Een orthotope Glioblastoma Muis Model Handhaving Brain Parenchymale fysieke beperkingen en geschikt voor intravitale twee-foton microscopie

Een orthotope borstkanker primaire tumor model en chirurgische verwijdering van de primaire tumor de muis het leven uit te breiden tot spontane metastase genereren beschreven. De tumorgroei en progressie worden gecontroleerd en gekwantificeerd luciferase fluorescentiebeeldvorming.

Een orthotope Muis Model van Spontane uitzaaiing van borstkanker

Hier presenteren we een reproduceerbare methode voor het ontwikkelen van een model orthotopic lymfkliertest van hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom. Tumoren tonen klinisch relevante histopathologische kenmerken van de ziekte, met inbegrip van necrose, arme differentiatie, knooppunten metastasen en immuun infiltratie. Tumor-dragende muizen ontwikkelen klinisch relevante symptomen zoals dysfagie, verplaatsing van de kaak en gewichtsverlies.

Intramucosal enten van plaveiselcelcarcinoom cellen in muizen voor Tumor immuun profileren en evaluatie van de reactie van de behandeling

Het manuscript beschrijft een methodologie voor het opzetten en longitudinaal monitoren van spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumoren, die vatbaar is voor interventie in alle stadia van de metastatische cascade.

In vivo Beeldvorming om spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumorcellen te meten

Het huidige protocol beschrijft de implantatie en evaluatie van melanoom in het muriene vaatvlies met behulp van optische coherentietomografie.

Implantatie en evaluatie van melanoom in het muizenvlies via optische coherentietomografie

De vertaling van de bevindingen van intravitale microscopie wordt uitgedaagd door de geringe dieptepenetratie in het weefsel. Hier beschrijven we een muismodel met dorsale vensterkamer dat co-registratie van intravitale microscopie en klinisch toepasbare beeldvormingsmodaliteiten (bijv. CT, MRI) mogelijk maakt voor directe ruimtelijke correlatie, waardoor de klinische vertaling van intravitale microscopiebevindingen mogelijk wordt gestroomlijnd.

Een dorsaal huidplooi raamkamer tumor muismodel voor gecombineerde intravitale microscopie en magnetische resonantie beeldvorming in translationeel kankeronderzoek

Een unieke methode om chirurgisch orale plaveiselceltumoren die in de mondholte zijn gevestigd, te verwijderen, wordt hier getoond.

Translationeel relevant tumorresectiemodel voor muispreklinische modellen van orale plaveiselcelcarcinoom

Leer multi-foton microscopie voor kwantitatieve beeldvorming van tumorinvasie in een orthotopisch muismodel van oraal plaveiselcelcarcinoom. Deze methode ondersteunt de evaluatie van anti-invasieve therapeutische verbindingen.

Multi-foton Imaging van de tumorcel invasie in een orthotope Muis Model van Oral plaveiselcelcarcinoom

Meer video's verkennen