Name: Ontwikkeling van Cell-type-specifieke anti-HIV-gp120 aptameren voor siRNA levering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Leer hoe je RNA-aptameren tegen HIV-1 gp120 genereert via nitrocellulose-filter-SELEX. Deze methode isoleert hoogaffiene aptameren voor celtype-specifieke siRNA-afgifte en antivirale therapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Britta Hoehn, Guihua zon, Harris Soifer en Lisa Scherer voor nuttige discussies. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health AI29329 en HL07470 uitgereikt aan de volgende reagentia JJR werden verkregen door het NIH AIDS-onderzoek en referentiereagens Program, Division van aids, NIAID, NIH: De CHO-EE en CHO-cel GP160 lijn, de pNL4-3 luc vector; HIV-1-BAL gp120 uit dan DAIDS, NIAID.

<ol><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Robertson, D. L., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+in+vitro+of+an+RNA+enzyme+that+specifically+cleaves+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA.</a> Nature. 344, 467-468 (1990).</li>
<li>Fitzwater, T., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SELEX+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A SELEX primer.</a> Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).</li>
<li>Weiss, C. D., White, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+stable+Chinese+hamster+ovary+cells+expressing+wild-type%2C+secreted%2C+and+glycosylphosphatidylinositol-anchored+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein.</a> J Virol. 67, 7060-706 (1993).</li>
<li>Vodicka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indicator+cell+lines+for+detection+of+primary+strains+of+human+and+simian+immunodeficiency+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses.</a> Virology. 233, 193-198> (1997).</li>
<li>Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection%2C+characterization+and+application+of+new+RNA+HIV+gp+120+aptamers+for+facile+delivery+of+Dicer+substrate+siRNAs+into+HIV+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li>
<li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+biology+of+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The chemical biology of aptamers.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).</li>
<li>Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aptamers+and+aptazymes+in+biotechnology%2C+diagnostics%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy.</a> Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).</li>
<li>Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+mediated+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Aptamer mediated siRNA delivery.</a> Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).</li>
<li>McNamara, J. O., 2nd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+delivery+of+siRNAs+with+aptamer-siRNA+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras.</a> Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).</li>
<li>Dassie, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+optimized+aptamer-siRNA+chimeras+promotes+regression+of+PSMA-expressing+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors.</a> Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+cell-internalizing+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers.</a> Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dual+inhibitory+function+aptamer-siRNA+delivery+system+for+HIV-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy.</a> Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).</li>
</ol>

J. R en JZ heeft een patent aangevraagd op de &quot;Cell-type-specifieke aptameer-siRNA systeem voor de HIV-1 therapie&quot;. USPTO, Nee.<strong&gt; 12/328994</strong&gt;, De publicatiedatum: 11 juni, 2009.

Aptameren zijn in vitro ontwikkelde nucleïnezuren die specifieke en stabiele drie-dimensionale vormen aannemen, waardoor een uiterst specifieke, sterke binding gerichte moleculen 8. De lage nanomolaire bindingsaffiniteit en specificiteit van exquise aptameren om hun doelstellingen maken veelzijdige tools voor diagnose, in vivo beeldvorming, en therapeutica 9. Met de komst van aptameer technologie voor gerichte siRNA levering is het nu mogelijk om de aptameer bindende functie voor ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> MF-Millipore membraanfilter </td><td> Millipore </td><td> HAWP01300 </td><td> Poriegrootte 0,45 pm </td></tr><tr><td> Swinnex Filterhouder </td><td> Millipore </td><td> SX0001300 </td><td> 13 mm diameter </td></tr><tr><td> QIAquick Gel Extraction Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28706 </td><td> DNA-zuivering </td></tr><tr><td> Microcontroller YM-30 kolom </td><td> Millipore </td><td> 42410 </td><td> RNA-concentratie </td></tr><tr><td> Bio-spin 30 column </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6250 </td><td> RNA-zuivering </td></tr><tr><td> Taq PCR DNA-polymerase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1806 </td><td></td></tr><tr><td> ThermoScript RT-PCR-systeem </td><td> Invitrogen </td><td> 11146-024 </td><td></td></tr><tr><td> DuraScribe T7 transcriptie Kit </td><td> Epicentrum </td><td> DS010925 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP voor PCR </td><td> Roche </td><td> 1 581 295 </td><td></td></tr><tr><td> Ribonucleïnezuur, transfer van E. coli </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R1753 </td><td> tRNA concurrent </td></tr><tr><td> HIV-1 Ba-L eiwit gp120 </td><td> de AIDS-onderzoek en referentiereagens Programma </td><td> 4961 </td><td> Doelwiteiwit </td></tr><tr><td> Silencer siRNA labeling kit - Cy3 </td><td> Ambion </td><td> 1632 </td><td></td></tr><tr><td> Zuur fenol / chloroform 5 / 1-oplossing (pH 4,5) </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td><td></td></tr><tr><td> Chloroform / isopropanol 24 / 1-oplossing </td><td> Sigma </td><td> C0549 </td><td></td></tr><tr><td> Kalf intestinale fosfatase (CIP) </td><td> New England BioLab </td><td> M0290L </td><td></td></tr><tr><td> T4 polynucleotide kinase </td><td> New England BioLab </td><td> M0201L </td><td></td></tr><tr><td> Glycogeen </td><td> Roche </td><td> 10 901 393 001 </td><td> RNA neerslag </td></tr><tr><td> Gamma-P 32-ATP </td><td> MP Biomedische </td><td> 013502002 </td><td> Radiactivity </td></tr><tr><td> 40% AccuGel 19:1 </td><td> Nationale Diagnostics </td><td> EC-850 </td><td></td></tr><tr><td> 10xTBE </td><td> Nationale Diagnostics </td><td> EC-860 </td><td></td></tr><tr><td> N, N, N, N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9281 </td><td></td></tr><tr><td> Ammoniumpersulfaat (APS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3678 </td><td></td></tr><tr><td> L-methioine sulfoximine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5379-250 mg </td><td></td></tr><tr><td> RPMI Media 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11835-030 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumbicarbonaat oplossing, 7,5% w / v </td><td> Invitrogen </td><td> 25080-094 </td><td></td></tr><tr><td> Minimum Essential Medium (MEM) (10 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11430-030 </td><td></td></tr><tr><td> MEM niet-essentieel aminozuur (100 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> TA klonering kit met pCR 2.1 </td><td> Invitrogen </td><td> K2040-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van cell-type-specifieke anti-hiv-gp120 aptameren voor sirna levering

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

De wereldwijde epidemie van een infectie met HIV heeft een dringende behoefte aan nieuwe klassen van antiretrovirale middelen. Het krachtige vermogen van kleine storende (si) RNA&#39;s om de expressie van complementaire RNA-transcripten te remmen wordt benut als een nieuwe klasse van geneesmiddelen voor een verscheidenheid van ziekten, waaronder HIV. Vele eerdere rapporten is gebleken dat nieuwe RNAi-gebaseerde anti-HIV/AIDS therapeutische strategieën aanzienlijk belofte hebben, maar een belangrijke belemmering voor de succesvolle therapeutische toepassing en de klinische vertaling van siRNA&#39;s is een efficiënte levering. In het bijzonder, gelet op de veiligheid en werkzaamheid van RNAi-gebaseerde therapieën, is het zeer wenselijk om de ontwikkeling van een gerichte intracellulaire siRNA levering benadering van specifieke cel populaties of weefsels. De HIV-1 eiwit gp120, een glycoproteïne envelop op het oppervlak van HIV-1, speelt een belangrijke rol bij het binnendringen van het virus in de CD4-cellen. De interactie tussen gp120 en CD4-triggers die HIV-1 entry en start celfusie is gevalideerd als een klinisch relevant anti-virale strategie voor drug discovery. Hierin bespreken we eerst de selectie en de identificatie van 2&#39;-F gewijzigd anti-HIV-RNA gp120 aptameren. Met behulp van een conventionele nitrocellulosefilter SELEX methode, werden verschillende nieuwe aptameren met nanomolaire affiniteit geïsoleerd uit een 50 willekeurige nt RNA bibliotheek. Om met succes gebonden soorten te verkrijgen met een hogere affiniteit, is de selectie streng zorgvuldig gecontroleerd door het aanpassen van de voorwaarden. De geselecteerde aptameren kan specifiek binden en worden snel geïnternaliseerd in cellen die het HIV-1 envelop eiwit. Daarnaast kan de aptameren alleen neutraliseren HIV-1 besmettelijkheid. Op basis van de best aptameer A-1, creëren we ook een nieuw, tweevoudig remmende functie anti-gp120 aptameer-siRNA chimera waarin zowel de aptameer en de siRNA porties zijn krachtige anti-HIV-activiteiten. Verder maken we gebruik van de gp120 aptameer-siRNA hersenschimmen voor cel-type specifieke levering van de siRNA in HIV-1 geïnfecteerde cellen. Deze dubbele functie chimera laat zien grote mogelijkheden voor het combineren van verschillende nucleïnezuur therapeutische middelen (aptameer en siRNA) bij het onderdrukken van HIV-1-infectie, waardoor de aptameer-siRNA hersenschimmen aantrekkelijke therapeutische kandidaten voor patiënten bij zeer actieve antiretrovirale therapie (HAART).

Verschillende 2&#39;-fluor RNA aptameren tegen HIV-1Ba-L gp120 met nanomole affiniteit geïsoleerd zijn van een RNA bibliotheek door<em&gt; In vitro</em&gt; SELEX procedure. Een nieuwe dual remmende functie anti-gp120 aptameer-siRNA chimera is gemaakt en toont grote belofte voor de systemische anti-HIV therapie.

Ontwikkeling van Cell-type-specifieke anti-HIV-gp120 aptameren voor siRNA levering

De wereldwijde epidemie van HIV-infecties heeft geleid tot een dringende behoefte aan nieuwe klassen antiretrovirale middelen. Het krachtige vermogen van kleine interfererende ...

Het algemene doel van de volgende experimenten is om in vitro RNA Aptima te genereren voor het HIV-1 GP120-eiwit met behulp van een nitrocellulosemembraan. Dit wordt bereikt via PCR en daaropvolgende in vitro T7-transcriptie. Om in een tweede stap het initiële DNA en de random RNA-bibliotheek voor te bereiden, wordt het mengsel van het doeleiwit en de RNA-bibliotheek aangebracht op een vooraf bevochtigd nitrocellulosefilter, waardoor gebonden RNA-moleculen kunnen worden geïsoleerd van ongebonden RNA-soorten.Na 12 selectiecycli wordt de RNA-bibliotheek gekloond en gesequentieerd om de individuele RNA-aptimeer-kandidaten uit de bibliotheek te identificeren. Er worden resultaten verkregen die meerdere nieuwe aptimeren identificeren met nanomolaire affiniteit, gebaseerd op gel shift-assays en confocale microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals beads of kolomgebaseerde isolatiemethoden, is simpel en vereist geen voorbehandeling van het eiwit of de bibliotheken, zoals de immobilisatie van het eiwit op de beads. De RNA-bibliotheek voor de isolatie van anti-HIV GP120 RNA-aptimeren wordt voorbereid vanuit een commercieel gesynthetiseerde DNA-bibliotheek die 50 nucleotiden aan random sequenties bevat.De sequentie van de enkelstrengs DNA-oligo library heeft een lengte van 81 nucleotiden. Zoals in dit diagram is te zien, wordt de random regio geflankeerd door constante regio's: A 30 tumor aan het 5'-uiteinde en een 16 MA aan het 3'-uiteinde. De constante regio's bevatten de T7-promotor voor in vitro transcriptie en een 3'-tag voor RT-PCR.Amplificeer de library van random single-stranded DNA-oligo's via PCR; beperk de PCR tot 10 cycli om de abundantie van de oorspronkelijke DNA-library te behouden. Na de PCR-reacties wordt de pool van geamplificeerd double-stranded DNA teruggewonnen met een gel-zuiveringskit. Het double-stranded DNA wordt vervolgens omgezet in een RNA-library met de cript kit volgens de instructies van de fabrikant; vervang in het transcriptiereactiemengsel CTP en UTP door 2-fluoropyrimidine-CTP en 2-fluoropyrimidine-UTP om ribonucleaseresistent RNA te produceren.Wanneer de transcriptiereacties zijn voltooid, worden de reacties behandeld met DS one om het template-DNA te verwijderen en vervolgens gezuiverd met een 8% polyacrylamidegel met zeven molar ureum. Quantificeer tot slot de gezuiverde RNA-bibliotheek via UV-spectrofotometrie. Bereid vóór de selectie van optimas de benodigde buffers voor en bewaar deze op de juiste temperaturen.Heaps-buffer bij kamertemperatuur en buffers voor RNA-herfolding en RNA-binding bij -20 °C. Voordat de eerste selectieronde wordt gestart, moet de willekeurige RNA-pool gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur worden gepre-incubeerd op een vochtig nitrocellulosefilter om aspecifieke binding met het filter te minimaliseren. Verwijder na 30 minuten het nitrocellulosefilter.Combineer de vooraf gezuiverde willekeurige RNA-pool en het HIV one bowel GP one 20-proteïne in een RNA-bindingsbuffer met laag zoutgehalte en incubeer dit op een roteerplatform bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Laat de reactie vervolgens door een voorgewet nitrocellulosefilter lopen en was dit met 1 milliliter RNA-bindingsbuffer met laag zoutgehalte om het gebonden RNA uit het filter te elueren. Verwijder het nitrocellulosemembraan uit de filterhouder.Voeg 200 µL eluatiebuffer toe aan het membraan en verhit dit vijf minuten lang bij 95 °C. Nadat het RNA uit het filter is geëlueerd, wordt de buis kort gecentrifugeerd, waarna de RNA-oplossing naar een nieuwe buis wordt overgebracht en er een fenol-chloroformextractie op wordt uitgevoerd. Gebruik een MicroCon YM 30-kolom om het RNA te concentreren en elueer het teruggewonnen RNA met 20 µL RNAse-vrij water.De teruggewonnen RNA-pool wordt vervolgens omgezet in cDNA via reverse transcriptie en gedurende 15 PCR-cycli geamplificeerd. Nadat de geamplificeerde dubbelstrengse pool is gezuiverd, wordt deze getranscribeerd tot een nieuwe RNA-pool, zoals eerder gedemonstreerd, voorafgaand aan de volgende selectieronde. Vouw de RNA-pool opnieuw door deze in één volume HBS-buffer te verhitten tot 95 °C gedurende drie minuten en laat het daarna langzaam afkoelen tot 37 °C.Zet de incubatie voort bij 37 °C gedurende 10 minuten. Adsorbeer het hergevouwen RNA en breng dit gedurende 30 minuten over op een nitrocellulosefilter vóór incubatie met het doelwit HIV gp120-eiwit voor de volgende selectieronde. Om succesvol aptameren met een hogere bindingsaffiniteit te verkrijgen, moet de selectiestrengentheid zorgvuldig worden gecontroleerd door de selectiecondities aan te passen.De selectiecondities staan in deze tabel. Incubeer voor de cellex-rondes één tot en met vier de voorzuiverde RNA-pool met het doeleiwit in een RNA-bindingsbuffer met een lage zoutconcentratie gedurende 30 minuten. Gebruik na de vierde cellex-ronde een RNA-bindingsbuffer met een hoge zoutconcentratie naarmate de cellex vordert.Verlaag de hoeveelheid GP120-eiwit en verhoog de concurrerende gist-tRNA om de strengheid van de aptameerselectie bij elke cyclus te verhogen. De voortgang van de HIV-1 GP120-optima selectie wordt gemonitord met een filterbindingsassay. In deze video worden de 12 RNA-pools die na alle selectiecycli zijn verzameld, geanalyseerd.Verwijder eerst de initiërende vijf-prime trifosfaatgroep door elke RNA-pool gedurende één uur bij 37 °C te behandelen met calf intestinal phosphatase. Om het met CIP behandelde RNA voor te bereiden op labeling met T4-polynucleotidekinase en P³² 80 p, wordt het vijf minuten verhit op 95 °C, gevolgd door afkoelen op ijs. De labeling van het RNA wordt uitgevoerd in een warmteruimte die is ingericht voor experimenten met radioactiviteit, met PNK-buffer, T4-polynucleotidekinase, 1 µL gamma-P³² ATP en water tot 20 µL. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.Voeg na 30 minuten 20 µL water toe aan elke reactie en zuiver deze met een G 50-kolom. Verkrijg uiteindelijk 40 µL gelabeld RNA met een eindconcentratie van 250 nM refold; verhit elke pool van gelabeld RNA in een 1x HBS-buffer gedurende drie minuten tot 95 °C. Laat dit vervolgens afkoelen tot 37 °C, wat 30 tot 40 minuten zal duren.Zet de incubatie voort bij 37 °C gedurende 10 minuten. Wanneer de RNA-pool is gevouwen, wordt een bindingsreactie van 100 µL uitgevoerd. Combineer de gelabelde RNA-pool met GP one 20-eiwit en een tienvoudig molair overschot aan niet-specifieke competitor tRNA in een RNA-bindingsbuffer met een hoog zoutgehalte, geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.Na afloop van de 30 minuten worden 50 µL van de bindingsreactie gescheiden door een voorbevochtigd nitrocellulosefilter. Was vervolgens het filter met twee milliliter bindingsbuffer en tel de op het filter achtergebleven radioactiviteit met een multifunctionele scintillatieteller als inputcontrole. De resterende 50 µL van de bindingsreactie worden tegelijkertijd gebruikt; de bindingsassay van de RNA-pool na elke selectieronde werd geanalyseerd met een filterbindingsassay met concurrerend TRNA om de voortgang van HIV-1 GP120 te monitoren.De bindingsactiviteiten van Optima's selectie werden berekend als het percentage van het input-RNA dat als eiwit-RNA-complex op het filter is vastgehouden, zoals hier wordt getoond. De initiële RNA-pool vertoont slechts 0,1% van het input-RNA dat aan het membraan is gebonden. Na negen selectierondes heeft de negende RNA-bibliotheek echter 9,72% van het input-RNA gebonden.Hoewel er extra selectieronde zijn uitgevoerd, is er geen verdere verrijking waargenomen, wat suggereert dat de maximale binding van de RNA-pool is bereikt. De bindingsactiviteiten van de RNA-pools werden verder bevestigd door middel van gel shift-assays. Deze resultaten tonen aan dat bepaalde liganden met een hoge bindingsspecificiteit voor het doeleiwit opeenvolgend zijn verrijkt in deze RNA-pools.In dit voorbeeld vertoonde de 12e RNA-pool de hoogste bindingsactiviteit; aangezien de maximale binding van de RNA-pool werd bereikt na de 12e selectieronde, werd deze RNA-pool omgezet in cDNA via reverse transcriptie, dat vervolgens via PCR werd geamplificeerd. Het PCR-product werd daarna gezuiverd, gekloond in een TA-cloningsvector en gesequenced na uitlijning van 140 klonen. Zes groepen anti GP one 20 optimas werden geïdentificeerd.In deze tabel zijn enkel de random sequenties van de Aptima-kernregio's aangegeven. Ongeveer 40% van de klonen bevat een geconserveerde sequentie. Vanwege hun relatieve overvloed binnen hun groep werd uit elke groep één representatieve sequentie gekozen voor verdere karakterisering via een native gel mobility shift assay; de dissociatieconstante KD van deze representatieve probes werd berekend, bijvoorbeeld A1.De beste van de abers heeft een schijnbare KD-waarde van 52 nanomolar, zoals hier wordt getoond. Deze geselecteerde abers kunnen selectief binden aan het doelewit HIV-1 gp120, maar niet aan het HIV-gp120 CM-eiwit. CHO G1-60 cellen die stabiel het HIV-enveloppeglycoproteïne gp160 tot expressie brengen, werden gebruikt om de binding en internalisatie van de geselecteerde anti-gp120 optimas te testen.Deze cellen zetten GP160 niet om in GP120 en GP41, aangezien ze de gag-gecodeerde proteasen missen die vereist zijn voor de processing van de envelope. Flowcytometrische analyse laat zien dat de S3-gelabelde aptameren specifiek binden aan de CHO GP160-cellen, maar niet aan de controle CHO EE-cellen, die geen GP160 tot expressie brengen. Bovendien wijst real-time live-cell Z-stack confocale microscopie erop dat na twee uur incubatie de S3-gelabelde aptameren selectief worden geïnternaliseerd door de CHO GP160-cellen, maar niet door de CHO EE-controlecellen. Er werd ook waargenomen dat de aptameren aggregeerden in het cytoplasma, wat suggereert dat de GP120-aptameren cellen kunnen binnendringen via receptor-gemedieerde endocytose.Ten slotte, na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe veldgebaseerde meetmethoden worden gebruikt om RNA-Abers te isoleren.

development-cell-type-specific-anti-hiv-gp120-aptamers-for-sirna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Het begrijpen van de conformatie van virale oppervlakte-antigenen is noodzakelijk om antilichaamneutralisatie te evalueren en het ontwerp van effectieve vaccin-immunogenen te begeleiden. Hier beschrijven we een cel-gebaseerde ELISA-test die de studie van de herkenning van trimeer HIV-1 Env, tot expressie gebracht aan het oppervlak van getransfecteerde cellen, door specifieke anti-Env antilichamen mogelijk maakt.

Conformationele Evaluatie van HIV-1 Trimere envelop glycoproteïnen met een cel-gebaseerde ELISA test

Hier presenteren we een protocol om een proof-of-principle bivalente adenovirus type 5 (Ad5) vector genereren Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 door gebruik te maken van de Antigen Capsid-Incorporation strategie. Deze vector werd aangetoond kwalitatieve conditie vertonen het vermogen om Ad5-positieve sera in vitro, en de antigeniteit en immunogeniteit ontsnappen naar de opgenomen antigenen.

Gebruik makend van de Antigen Capsid-Incorporation strategie voor de ontwikkeling van adenovirus serotype 5-Vectored Vaccin Approaches

Methoden om de werkzaamheid en toxiciteit van RNA-moleculen die zich richten op post-integratie stappen van de HIV-1 replicatiecyclus te evalueren, worden beschreven. Deze methoden zijn nuttig voor het screenen van nieuwe moleculen en het optimaliseren van de indeling van bestaande.

Evaluatie van de effectiviteit en toxiciteit van RNA&#39;s Targeting HIV-1 productie voor gebruik in Gene of Drug Therapy

Een modulaire benadering van de synthese van N- glycanen voor bevestiging aan een aluminium oxide-gecoate glazen schuif (ACG dia) als een microarray glycan heeft ontwikkeld en het gebruik ervan voor de profilering van een HIV in grote lijnen neutraliserende antilichamen aangetoond.

Chemo-enzymatische synthese van N- glycanen voor Array ontwikkeling en HIV antilichaam profilering

We beschrijven een cel-gebaseerde test om te melden aan de HIV-1 fusion via de uitdrukking van groen fluorescent proteïne aantoonbaar door stroom cytometry of fluorescentie microscopie. Het kan worden gebruikt voor het testen van remmers van virale toegang (specifiek aan de fusie stap) in cel-vrij en cel-naar-cel infectie systemen.

Een High-throughput Cre-Lox geactiveerd virale membraan Fusion Assay ter identificatie van de Inhibitors van HIV-1 virale membraan Fusion

Hier wordt een gedetailleerde methode beschreven die de zuivering, refolding en karakterisering van zelf-assembleren eiwit nanodeeltjes (Sapn's) beschrijft voor gebruik bij de ontwikkeling van vaccins.

Productie van E. coli-uitgedrukt zelf-assembleren eiwit nanodeeltjes voor vaccins die een Trimere epitope presentatie vereisen

Het recombinante antilichaameiwit dat tot expressie komt in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-cellen en monoklonale antilichamen geproduceerd met behulp van traditionele hybridoma-technologie kan het varkensaminopeptidase N (APN) -eiwit herkennen en eraan binden.

Productie van monoklonale antilichamen gericht tegen aminopeptidase N in het varkensdarmslijmvliesepitheel

Hier presenteren we een protocol om neutralisatie-epitopen te detecteren op antigeen-displaying virusachtige deeltjes (VLP's). Immunoprecipitatie van het van het humaan immunodeficiëntievirus (HIV) afgeleide VLP's wordt uitgevoerd met behulp van envelop glycoproteïnen-specifieke monoklonale antilichamen gekoppeld aan eiwit G-geconjugeerde magnetische kralen. Gevangen VLP's worden vervolgens onderworpen aan SDS-PAGE en Western blot-analyse met behulp van virale kerneiwit Gag-specifieke...

Detectie van neutralisatiegevoelige epitopen in antigenen die worden weergegeven op op virusachtige deeltjes (VLP) gebaseerde vaccins met behulp van een capture-assay

Het glycosyleringspatroon van een antilichaam bepaalt de klinische prestaties, dus industriële en academische inspanningen om glycosylatie te beheersen blijven bestaan. Omdat typische glyco-engineeringcampagnes tijd- en arbeidsintensief zijn, zou het genereren van een snel protocol om de impact van glycosyleringsgenen te karakteriseren met behulp van transiënte uitschakeling nuttig zijn.

Snelle antilichaamglycosengineering in ovariumcellen van Chinese hamsters

We bieden een protocol dat algemeen kan worden toegepast op het selecteren van aptameren die alleen binden aan infectieuze virussen en niet aan virussen die niet-infectieus zijn gemaakt door een desinfectiemethode of aan andere soortgelijke virussen. Dit opent de mogelijkheid om de infectiviteitsstatus te bepalen in draagbare en snelle tests.

In vitro selectie van aptameren om infectieuze van niet-infectieuze virussen te onderscheiden

Leer hoe je RNA-aptameren tegen HIV-1 gp120 genereert via nitrocellulose-filter-SELEX. Deze methode isoleert hoogaffiene aptameren voor celtype-specifieke siRNA-afgifte en antivirale therapie.

Ontwikkeling van Cell-type-specifieke anti-HIV-gp120 aptameren voor siRNA levering

Meer video's verkennen