Ontwikkeling van Cell-type-specifieke anti-HIV-gp120 aptameren voor siRNA levering

Het algemene doel van de volgende experimenten is om in vitro RNA Aptima te genereren voor het HIV-1 GP120-eiwit met behulp van een nitrocellulosemembraan. Dit wordt bereikt via PCR en daaropvolgende in vitro T7-transcriptie. Om in een tweede stap het initiële DNA en de random RNA-bibliotheek voor te bereiden, wordt het mengsel van het doeleiwit en de RNA-bibliotheek aangebracht op een vooraf bevochtigd nitrocellulosefilter, waardoor gebonden RNA-moleculen kunnen worden geïsoleerd van ongebonden RNA-soorten.

Na 12 selectiecycli wordt de RNA-bibliotheek gekloond en gesequentieerd om de individuele RNA-aptimeer-kandidaten uit de bibliotheek te identificeren. Er worden resultaten verkregen die meerdere nieuwe aptimeren identificeren met nanomolaire affiniteit, gebaseerd op gel shift-assays en confocale microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals beads of kolomgebaseerde isolatiemethoden, is simpel en vereist geen voorbehandeling van het eiwit of de bibliotheken, zoals de immobilisatie van het eiwit op de beads. De RNA-bibliotheek voor de isolatie van anti-HIV GP120 RNA-aptimeren wordt voorbereid vanuit een commercieel gesynthetiseerde DNA-bibliotheek die 50 nucleotiden aan random sequenties bevat.

De sequentie van de enkelstrengs DNA-oligo library heeft een lengte van 81 nucleotiden. Zoals in dit diagram is te zien, wordt de random regio geflankeerd door constante regio's: A 30 tumor aan het 5'-uiteinde en een 16 MA aan het 3'-uiteinde. De constante regio's bevatten de T7-promotor voor in vitro transcriptie en een 3'-tag voor RT-PCR.

Amplificeer de library van random single-stranded DNA-oligo's via PCR; beperk de PCR tot 10 cycli om de abundantie van de oorspronkelijke DNA-library te behouden. Na de PCR-reacties wordt de pool van geamplificeerd double-stranded DNA teruggewonnen met een gel-zuiveringskit. Het double-stranded DNA wordt vervolgens omgezet in een RNA-library met de cript kit volgens de instructies van de fabrikant; vervang in het transcriptiereactiemengsel CTP en UTP door 2-fluoropyrimidine-CTP en 2-fluoropyrimidine-UTP om ribonucleaseresistent RNA te produceren.

Wanneer de transcriptiereacties zijn voltooid, worden de reacties behandeld met DS one om het template-DNA te verwijderen en vervolgens gezuiverd met een 8% polyacrylamidegel met zeven molar ureum. Quantificeer tot slot de gezuiverde RNA-bibliotheek via UV-spectrofotometrie. Bereid vóór de selectie van optimas de benodigde buffers voor en bewaar deze op de juiste temperaturen.

Heaps-buffer bij kamertemperatuur en buffers voor RNA-herfolding en RNA-binding bij -20 °C. Voordat de eerste selectieronde wordt gestart, moet de willekeurige RNA-pool gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur worden gepre-incubeerd op een vochtig nitrocellulosefilter om aspecifieke binding met het filter te minimaliseren. Verwijder na 30 minuten het nitrocellulosefilter.

Combineer de vooraf gezuiverde willekeurige RNA-pool en het HIV one bowel GP one 20-proteïne in een RNA-bindingsbuffer met laag zoutgehalte en incubeer dit op een roteerplatform bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Laat de reactie vervolgens door een voorgewet nitrocellulosefilter lopen en was dit met 1 milliliter RNA-bindingsbuffer met laag zoutgehalte om het gebonden RNA uit het filter te elueren. Verwijder het nitrocellulosemembraan uit de filterhouder.

Voeg 200 µL eluatiebuffer toe aan het membraan en verhit dit vijf minuten lang bij 95 °C. Nadat het RNA uit het filter is geëlueerd, wordt de buis kort gecentrifugeerd, waarna de RNA-oplossing naar een nieuwe buis wordt overgebracht en er een fenol-chloroformextractie op wordt uitgevoerd. Gebruik een MicroCon YM 30-kolom om het RNA te concentreren en elueer het teruggewonnen RNA met 20 µL RNAse-vrij water.

De teruggewonnen RNA-pool wordt vervolgens omgezet in cDNA via reverse transcriptie en gedurende 15 PCR-cycli geamplificeerd. Nadat de geamplificeerde dubbelstrengse pool is gezuiverd, wordt deze getranscribeerd tot een nieuwe RNA-pool, zoals eerder gedemonstreerd, voorafgaand aan de volgende selectieronde. Vouw de RNA-pool opnieuw door deze in één volume HBS-buffer te verhitten tot 95 °C gedurende drie minuten en laat het daarna langzaam afkoelen tot 37 °C.

Zet de incubatie voort bij 37 °C gedurende 10 minuten. Adsorbeer het hergevouwen RNA en breng dit gedurende 30 minuten over op een nitrocellulosefilter vóór incubatie met het doelwit HIV gp120-eiwit voor de volgende selectieronde. Om succesvol aptameren met een hogere bindingsaffiniteit te verkrijgen, moet de selectiestrengentheid zorgvuldig worden gecontroleerd door de selectiecondities aan te passen.

De selectiecondities staan in deze tabel. Incubeer voor de cellex-rondes één tot en met vier de voorzuiverde RNA-pool met het doeleiwit in een RNA-bindingsbuffer met een lage zoutconcentratie gedurende 30 minuten. Gebruik na de vierde cellex-ronde een RNA-bindingsbuffer met een hoge zoutconcentratie naarmate de cellex vordert.

Verlaag de hoeveelheid GP120-eiwit en verhoog de concurrerende gist-tRNA om de strengheid van de aptameerselectie bij elke cyclus te verhogen. De voortgang van de HIV-1 GP120-optima selectie wordt gemonitord met een filterbindingsassay. In deze video worden de 12 RNA-pools die na alle selectiecycli zijn verzameld, geanalyseerd.

Verwijder eerst de initiërende vijf-prime trifosfaatgroep door elke RNA-pool gedurende één uur bij 37 °C te behandelen met calf intestinal phosphatase. Om het met CIP behandelde RNA voor te bereiden op labeling met T4-polynucleotidekinase en P³² 80 p, wordt het vijf minuten verhit op 95 °C, gevolgd door afkoelen op ijs. De labeling van het RNA wordt uitgevoerd in een warmteruimte die is ingericht voor experimenten met radioactiviteit, met PNK-buffer, T4-polynucleotidekinase, 1 µL gamma-P³² ATP en water tot 20 µL. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.

Voeg na 30 minuten 20 µL water toe aan elke reactie en zuiver deze met een G 50-kolom. Verkrijg uiteindelijk 40 µL gelabeld RNA met een eindconcentratie van 250 nM refold; verhit elke pool van gelabeld RNA in een 1x HBS-buffer gedurende drie minuten tot 95 °C. Laat dit vervolgens afkoelen tot 37 °C, wat 30 tot 40 minuten zal duren.

Zet de incubatie voort bij 37 °C gedurende 10 minuten. Wanneer de RNA-pool is gevouwen, wordt een bindingsreactie van 100 µL uitgevoerd. Combineer de gelabelde RNA-pool met GP one 20-eiwit en een tienvoudig molair overschot aan niet-specifieke competitor tRNA in een RNA-bindingsbuffer met een hoog zoutgehalte, geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.

Na afloop van de 30 minuten worden 50 µL van de bindingsreactie gescheiden door een voorbevochtigd nitrocellulosefilter. Was vervolgens het filter met twee milliliter bindingsbuffer en tel de op het filter achtergebleven radioactiviteit met een multifunctionele scintillatieteller als inputcontrole. De resterende 50 µL van de bindingsreactie worden tegelijkertijd gebruikt; de bindingsassay van de RNA-pool na elke selectieronde werd geanalyseerd met een filterbindingsassay met concurrerend TRNA om de voortgang van HIV-1 GP120 te monitoren.

De bindingsactiviteiten van Optima's selectie werden berekend als het percentage van het input-RNA dat als eiwit-RNA-complex op het filter is vastgehouden, zoals hier wordt getoond. De initiële RNA-pool vertoont slechts 0,1% van het input-RNA dat aan het membraan is gebonden. Na negen selectierondes heeft de negende RNA-bibliotheek echter 9,72% van het input-RNA gebonden.

Hoewel er extra selectieronde zijn uitgevoerd, is er geen verdere verrijking waargenomen, wat suggereert dat de maximale binding van de RNA-pool is bereikt. De bindingsactiviteiten van de RNA-pools werden verder bevestigd door middel van gel shift-assays. Deze resultaten tonen aan dat bepaalde liganden met een hoge bindingsspecificiteit voor het doeleiwit opeenvolgend zijn verrijkt in deze RNA-pools.

In dit voorbeeld vertoonde de 12e RNA-pool de hoogste bindingsactiviteit; aangezien de maximale binding van de RNA-pool werd bereikt na de 12e selectieronde, werd deze RNA-pool omgezet in cDNA via reverse transcriptie, dat vervolgens via PCR werd geamplificeerd. Het PCR-product werd daarna gezuiverd, gekloond in een TA-cloningsvector en gesequenced na uitlijning van 140 klonen. Zes groepen anti GP one 20 optimas werden geïdentificeerd.

In deze tabel zijn enkel de random sequenties van de Aptima-kernregio's aangegeven. Ongeveer 40% van de klonen bevat een geconserveerde sequentie. Vanwege hun relatieve overvloed binnen hun groep werd uit elke groep één representatieve sequentie gekozen voor verdere karakterisering via een native gel mobility shift assay; de dissociatieconstante KD van deze representatieve probes werd berekend, bijvoorbeeld A1.

De beste van de abers heeft een schijnbare KD-waarde van 52 nanomolar, zoals hier wordt getoond. Deze geselecteerde abers kunnen selectief binden aan het doelewit HIV-1 gp120, maar niet aan het HIV-gp120 CM-eiwit. CHO G1-60 cellen die stabiel het HIV-enveloppeglycoproteïne gp160 tot expressie brengen, werden gebruikt om de binding en internalisatie van de geselecteerde anti-gp120 optimas te testen.

Deze cellen zetten GP160 niet om in GP120 en GP41, aangezien ze de gag-gecodeerde proteasen missen die vereist zijn voor de processing van de envelope. Flowcytometrische analyse laat zien dat de S3-gelabelde aptameren specifiek binden aan de CHO GP160-cellen, maar niet aan de controle CHO EE-cellen, die geen GP160 tot expressie brengen. Bovendien wijst real-time live-cell Z-stack confocale microscopie erop dat na twee uur incubatie de S3-gelabelde aptameren selectief worden geïnternaliseerd door de CHO GP160-cellen, maar niet door de CHO EE-controlecellen. Er werd ook waargenomen dat de aptameren aggregeerden in het cytoplasma, wat suggereert dat de GP120-aptameren cellen kunnen binnendringen via receptor-gemedieerde endocytose.

Ten slotte, na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe veldgebaseerde meetmethoden worden gebruikt om RNA-Abers te isoleren.