Name: Ontwikkeling van Cell-type-specifieke anti-HIV-gp120 aptameren voor siRNA levering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Leer hoe je RNA-aptameren tegen HIV-1 gp120 genereert via nitrocellulose-filter-SELEX. Deze methode isoleert hoogaffiene aptameren voor celtype-specifieke siRNA-afgifte en antivirale therapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Britta Hoehn, Guihua zon, Harris Soifer en Lisa Scherer voor nuttige discussies. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health AI29329 en HL07470 uitgereikt aan de volgende reagentia JJR werden verkregen door het NIH AIDS-onderzoek en referentiereagens Program, Division van aids, NIAID, NIH: De CHO-EE en CHO-cel GP160 lijn, de pNL4-3 luc vector; HIV-1-BAL gp120 uit dan DAIDS, NIAID.

<ol><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Robertson, D. L., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+in+vitro+of+an+RNA+enzyme+that+specifically+cleaves+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA.</a> Nature. 344, 467-468 (1990).</li>
<li>Fitzwater, T., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SELEX+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A SELEX primer.</a> Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).</li>
<li>Weiss, C. D., White, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+stable+Chinese+hamster+ovary+cells+expressing+wild-type%2C+secreted%2C+and+glycosylphosphatidylinositol-anchored+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein.</a> J Virol. 67, 7060-706 (1993).</li>
<li>Vodicka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indicator+cell+lines+for+detection+of+primary+strains+of+human+and+simian+immunodeficiency+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses.</a> Virology. 233, 193-198> (1997).</li>
<li>Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection%2C+characterization+and+application+of+new+RNA+HIV+gp+120+aptamers+for+facile+delivery+of+Dicer+substrate+siRNAs+into+HIV+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li>
<li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+biology+of+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The chemical biology of aptamers.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).</li>
<li>Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aptamers+and+aptazymes+in+biotechnology%2C+diagnostics%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy.</a> Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).</li>
<li>Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+mediated+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Aptamer mediated siRNA delivery.</a> Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).</li>
<li>McNamara, J. O., 2nd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+delivery+of+siRNAs+with+aptamer-siRNA+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras.</a> Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).</li>
<li>Dassie, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+optimized+aptamer-siRNA+chimeras+promotes+regression+of+PSMA-expressing+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors.</a> Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+cell-internalizing+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers.</a> Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dual+inhibitory+function+aptamer-siRNA+delivery+system+for+HIV-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy.</a> Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).</li>
</ol>

J. R en JZ heeft een patent aangevraagd op de &quot;Cell-type-specifieke aptameer-siRNA systeem voor de HIV-1 therapie&quot;. USPTO, Nee.<strong&gt; 12/328994</strong&gt;, De publicatiedatum: 11 juni, 2009.

Aptameren zijn in vitro ontwikkelde nucleïnezuren die specifieke en stabiele drie-dimensionale vormen aannemen, waardoor een uiterst specifieke, sterke binding gerichte moleculen 8. De lage nanomolaire bindingsaffiniteit en specificiteit van exquise aptameren om hun doelstellingen maken veelzijdige tools voor diagnose, in vivo beeldvorming, en therapeutica 9. Met de komst van aptameer technologie voor gerichte siRNA levering is het nu mogelijk om de aptameer bindende functie voor ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> MF-Millipore membraanfilter </td><td> Millipore </td><td> HAWP01300 </td><td> Poriegrootte 0,45 pm </td></tr><tr><td> Swinnex Filterhouder </td><td> Millipore </td><td> SX0001300 </td><td> 13 mm diameter </td></tr><tr><td> QIAquick Gel Extraction Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28706 </td><td> DNA-zuivering </td></tr><tr><td> Microcontroller YM-30 kolom </td><td> Millipore </td><td> 42410 </td><td> RNA-concentratie </td></tr><tr><td> Bio-spin 30 column </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6250 </td><td> RNA-zuivering </td></tr><tr><td> Taq PCR DNA-polymerase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1806 </td><td></td></tr><tr><td> ThermoScript RT-PCR-systeem </td><td> Invitrogen </td><td> 11146-024 </td><td></td></tr><tr><td> DuraScribe T7 transcriptie Kit </td><td> Epicentrum </td><td> DS010925 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP voor PCR </td><td> Roche </td><td> 1 581 295 </td><td></td></tr><tr><td> Ribonucleïnezuur, transfer van E. coli </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R1753 </td><td> tRNA concurrent </td></tr><tr><td> HIV-1 Ba-L eiwit gp120 </td><td> de AIDS-onderzoek en referentiereagens Programma </td><td> 4961 </td><td> Doelwiteiwit </td></tr><tr><td> Silencer siRNA labeling kit - Cy3 </td><td> Ambion </td><td> 1632 </td><td></td></tr><tr><td> Zuur fenol / chloroform 5 / 1-oplossing (pH 4,5) </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td><td></td></tr><tr><td> Chloroform / isopropanol 24 / 1-oplossing </td><td> Sigma </td><td> C0549 </td><td></td></tr><tr><td> Kalf intestinale fosfatase (CIP) </td><td> New England BioLab </td><td> M0290L </td><td></td></tr><tr><td> T4 polynucleotide kinase </td><td> New England BioLab </td><td> M0201L </td><td></td></tr><tr><td> Glycogeen </td><td> Roche </td><td> 10 901 393 001 </td><td> RNA neerslag </td></tr><tr><td> Gamma-P 32-ATP </td><td> MP Biomedische </td><td> 013502002 </td><td> Radiactivity </td></tr><tr><td> 40% AccuGel 19:1 </td><td> Nationale Diagnostics </td><td> EC-850 </td><td></td></tr><tr><td> 10xTBE </td><td> Nationale Diagnostics </td><td> EC-860 </td><td></td></tr><tr><td> N, N, N, N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9281 </td><td></td></tr><tr><td> Ammoniumpersulfaat (APS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3678 </td><td></td></tr><tr><td> L-methioine sulfoximine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5379-250 mg </td><td></td></tr><tr><td> RPMI Media 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11835-030 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumbicarbonaat oplossing, 7,5% w / v </td><td> Invitrogen </td><td> 25080-094 </td><td></td></tr><tr><td> Minimum Essential Medium (MEM) (10 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11430-030 </td><td></td></tr><tr><td> MEM niet-essentieel aminozuur (100 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> TA klonering kit met pCR 2.1 </td><td> Invitrogen </td><td> K2040-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van cell-type-specifieke anti-hiv-gp120 aptameren voor sirna levering

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

De wereldwijde epidemie van een infectie met HIV heeft een dringende behoefte aan nieuwe klassen van antiretrovirale middelen. Het krachtige vermogen van kleine storende (si) RNA&#39;s om de expressie van complementaire RNA-transcripten te remmen wordt benut als een nieuwe klasse van geneesmiddelen voor een verscheidenheid van ziekten, waaronder HIV. Vele eerdere rapporten is gebleken dat nieuwe RNAi-gebaseerde anti-HIV/AIDS therapeutische strategieën aanzienlijk belofte hebben, maar een belangrijke belemmering voor de succesvolle therapeutische toepassing en de klinische vertaling van siRNA&#39;s is een efficiënte levering. In het bijzonder, gelet op de veiligheid en werkzaamheid van RNAi-gebaseerde therapieën, is het zeer wenselijk om de ontwikkeling van een gerichte intracellulaire siRNA levering benadering van specifieke cel populaties of weefsels. De HIV-1 eiwit gp120, een glycoproteïne envelop op het oppervlak van HIV-1, speelt een belangrijke rol bij het binnendringen van het virus in de CD4-cellen. De interactie tussen gp120 en CD4-triggers die HIV-1 entry en start celfusie is gevalideerd als een klinisch relevant anti-virale strategie voor drug discovery. Hierin bespreken we eerst de selectie en de identificatie van 2&#39;-F gewijzigd anti-HIV-RNA gp120 aptameren. Met behulp van een conventionele nitrocellulosefilter SELEX methode, werden verschillende nieuwe aptameren met nanomolaire affiniteit geïsoleerd uit een 50 willekeurige nt RNA bibliotheek. Om met succes gebonden soorten te verkrijgen met een hogere affiniteit, is de selectie streng zorgvuldig gecontroleerd door het aanpassen van de voorwaarden. De geselecteerde aptameren kan specifiek binden en worden snel geïnternaliseerd in cellen die het HIV-1 envelop eiwit. Daarnaast kan de aptameren alleen neutraliseren HIV-1 besmettelijkheid. Op basis van de best aptameer A-1, creëren we ook een nieuw, tweevoudig remmende functie anti-gp120 aptameer-siRNA chimera waarin zowel de aptameer en de siRNA porties zijn krachtige anti-HIV-activiteiten. Verder maken we gebruik van de gp120 aptameer-siRNA hersenschimmen voor cel-type specifieke levering van de siRNA in HIV-1 geïnfecteerde cellen. Deze dubbele functie chimera laat zien grote mogelijkheden voor het combineren van verschillende nucleïnezuur therapeutische middelen (aptameer en siRNA) bij het onderdrukken van HIV-1-infectie, waardoor de aptameer-siRNA hersenschimmen aantrekkelijke therapeutische kandidaten voor patiënten bij zeer actieve antiretrovirale therapie (HAART).

Verschillende 2&#39;-fluor RNA aptameren tegen HIV-1Ba-L gp120 met nanomole affiniteit geïsoleerd zijn van een RNA bibliotheek door<em&gt; In vitro</em&gt; SELEX procedure. Een nieuwe dual remmende functie anti-gp120 aptameer-siRNA chimera is gemaakt en toont grote belofte voor de systemische anti-HIV therapie.

Ontwikkeling van Cell-type-specifieke anti-HIV-gp120 aptameren voor siRNA levering

De wereldwijde epidemie van HIV-infecties heeft geleid tot een dringende behoefte aan nieuwe klassen antiretrovirale middelen. Het krachtige vermogen van kleine interfererende ...

Het algemene doel van de volgende experimenten is om in vitro RNA Aptima te genereren voor het HIV-1 GP120-eiwit met behulp van een nitrocellulosemembraan. Dit wordt bereikt via PCR en daaropvolgende in vitro T7-transcriptie. Om in een tweede stap het initiële DNA en de random RNA-bibliotheek voor te bereiden, wordt het mengsel van het doeleiwit en de RNA-bibliotheek aangebracht op een vooraf bevochtigd nitrocellulosefilter, waardoor gebonden RNA-moleculen kunnen worden geïsoleerd van ongebonden RNA-soorten.Na 12 selectiecycli wordt de RNA-bibliotheek gekloond en gesequentieerd om de individuele RNA-aptimeer-kandidaten uit de bibliotheek te identificeren. Er worden resultaten verkregen die meerdere nieuwe aptimeren identificeren met nanomolaire affiniteit, gebaseerd op gel shift-assays en confocale microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals beads of kolomgebaseerde isolatiemethoden, is simpel en vereist geen voorbehandeling van het eiwit of de bibliotheken, zoals de immobilisatie van het eiwit op de beads. De RNA-bibliotheek voor de isolatie van anti-HIV GP120 RNA-aptimeren wordt voorbereid vanuit een commercieel gesynthetis

development-cell-type-specific-anti-hiv-gp120-aptamers-for-sirna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Het begrijpen van de conformatie van virale oppervlakte-antigenen is noodzakelijk om antilichaamneutralisatie te evalueren en het ontwerp van effectieve vaccin-immunogenen te begeleiden. Hier beschrijven we een cel-gebaseerde ELISA-test die de studie van de herkenning van trimeer HIV-1 Env, tot expressie gebracht aan het oppervlak van getransfecteerde cellen, door specifieke anti-Env antilichamen mogelijk maakt.

Conformationele Evaluatie van HIV-1 Trimere envelop glycoproteïnen met een cel-gebaseerde ELISA test

Hier presenteren we een protocol om een proof-of-principle bivalente adenovirus type 5 (Ad5) vector genereren Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 door gebruik te maken van de Antigen Capsid-Incorporation strategie. Deze vector werd aangetoond kwalitatieve conditie vertonen het vermogen om Ad5-positieve sera in vitro, en de antigeniteit en immunogeniteit ontsnappen naar de opgenomen antigenen.

Gebruik makend van de Antigen Capsid-Incorporation strategie voor de ontwikkeling van adenovirus serotype 5-Vectored Vaccin Approaches

Dit protocol beschrijft de methoden voor het construeren van een gehumaniseerd muismodel voor beenmerg/lever/thymus met stamcelgebaseerde geëngineerde immuniteit tegen HIV-infectie.

Stamcel-Based Engineered immuniteit tegen HIV infectie in het gehumaniseerde muismodel

Methoden om de werkzaamheid en toxiciteit van RNA-moleculen die zich richten op post-integratie stappen van de HIV-1 replicatiecyclus te evalueren, worden beschreven. Deze methoden zijn nuttig voor het screenen van nieuwe moleculen en het optimaliseren van de indeling van bestaande.

Evaluatie van de effectiviteit en toxiciteit van RNA&#39;s Targeting HIV-1 productie voor gebruik in Gene of Drug Therapy

Een modulaire benadering van de synthese van N- glycanen voor bevestiging aan een aluminium oxide-gecoate glazen schuif (ACG dia) als een microarray glycan heeft ontwikkeld en het gebruik ervan voor de profilering van een HIV in grote lijnen neutraliserende antilichamen aangetoond.

Chemo-enzymatische synthese van N- glycanen voor Array ontwikkeling en HIV antilichaam profilering

We beschrijven een cel-gebaseerde test om te melden aan de HIV-1 fusion via de uitdrukking van groen fluorescent proteïne aantoonbaar door stroom cytometry of fluorescentie microscopie. Het kan worden gebruikt voor het testen van remmers van virale toegang (specifiek aan de fusie stap) in cel-vrij en cel-naar-cel infectie systemen.

Een High-throughput Cre-Lox geactiveerd virale membraan Fusion Assay ter identificatie van de Inhibitors van HIV-1 virale membraan Fusion

De BSelex-methode om individuele antigeen-specifieke antilichamen van humane perifere bloed mononucleaire cellen te identificeren en te herstellen combineert Flowcytometrie met eencellige PCR en klonen.

Eencellige screening methode voor de selectie en terugwinning van antilichamen met de gewenste specifieke kenmerken van verrijkte menselijke geheugen B-celpopulaties

Hier wordt een gedetailleerde methode beschreven die de zuivering, refolding en karakterisering van zelf-assembleren eiwit nanodeeltjes (Sapn's) beschrijft voor gebruik bij de ontwikkeling van vaccins.

Productie van E. coli-uitgedrukt zelf-assembleren eiwit nanodeeltjes voor vaccins die een Trimere epitope presentatie vereisen

Het glycosyleringspatroon van een antilichaam bepaalt de klinische prestaties, dus industriële en academische inspanningen om glycosylatie te beheersen blijven bestaan. Omdat typische glyco-engineeringcampagnes tijd- en arbeidsintensief zijn, zou het genereren van een snel protocol om de impact van glycosyleringsgenen te karakteriseren met behulp van transiënte uitschakeling nuttig zijn.

Snelle antilichaamglycosengineering in ovariumcellen van Chinese hamsters

We bieden een protocol dat algemeen kan worden toegepast op het selecteren van aptameren die alleen binden aan infectieuze virussen en niet aan virussen die niet-infectieus zijn gemaakt door een desinfectiemethode of aan andere soortgelijke virussen. Dit opent de mogelijkheid om de infectiviteitsstatus te bepalen in draagbare en snelle tests.

In vitro selectie van aptameren om infectieuze van niet-infectieuze virussen te onderscheiden

Leer hoe je RNA-aptameren tegen HIV-1 gp120 genereert via nitrocellulose-filter-SELEX. Deze methode isoleert hoogaffiene aptameren voor celtype-specifieke siRNA-afgifte en antivirale therapie.

Ontwikkeling van Cell-type-specifieke anti-HIV-gp120 aptameren voor siRNA levering

Meer video's verkennen