Efficiënte gen delivery in meerdere CNS Gebieden Het gebruik van In Utero Elektroporatie
23 juni 2011
In utero elektroporatie zorgt voor een snelle genafgifte in een ruimtelijk-temporeel en gecontroleerde wijze in de zich ontwikkelende centrale zenuwstelsel (CZS). Hier beschrijven we een groot aanpassingsvermogen in utero electroporatie protocol dat gebruikt kan worden om expressie constructen te leveren in meerdere embryonale CNS domeinen, waaronder de telencephalon, diencephalon en netvlies.
Het algemene doel van deze procedure is om de genexpressie in het neuronale embryonale centrale zenuwstelsel te veranderen. Dit wordt bereikt door eerst zwangere vrouwtjes te verkrijgen en ze voor te bereiden op een operatie. De baarmoederhoorns worden vervolgens blootgelegd door een abdominale incisie te maken.
Zodra de embryo's zijn blootgelegd, wordt DNA geïnjecteerd in de laterale ventrikel, derde ventrikel of subretinale ruimte. De laatste stap van de procedure is om een elektrische stroom toe te passen op het embryo via de baarmoederwand, waarbij de paddle-elektroden zo worden gepositioneerd dat de positieve pool over de gewenste plaats van transfectie wordt geplaatst. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de proliferatie, migratie en differentiatie van neuroprogenitorcellen in de tline kelon stervende kelon en retina laten zien door middel van immunofluorescentiemicroscopie.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek of bestaande methoden, zoals de degeneratie van transgene muizen, is dat het snel is, hogere doorvoerstudies mogelijk maakt en minder kost. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurale ontwikkeling, zoals welke genen neurale progenitorcellen reguleren, celproliferatie, celbestemmingspecificatie, neuronale differentiatie en celmigratie. De implicaties van deze techniek kunnen zich uitstrekken tot een beter begrip van de genetische paden die defecten in de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel onderliggen, waarvan vele resulteren in cognitieve beperkingen en gedragsstoornissen bij mensen. Dit gaat verder dan alleen het nut ervan bij het begrijpen van de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel.
Deze techniek kan ook worden toegepast op andere orgaansystemen zoals het zich ontwikkelende perifere zenuwstelsel, hart en placenta. Het kan ook worden toegepast om ziektemodellen bij muizen en andere modelorganismen zoals kip en xip te bestuderen. Over het algemeen is het grootste obstakel voor succes voor personen die nieuw zijn met deze techniek de overleving van embryo's. Er moet zorgvuldig worden omgegaan met het manipuleren, injecteren en poren van de embryo's.
We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we een snelle manier nodig hadden om genexpressie te manipuleren in het embryonale telencephalon en de retina. We ontwikkelden deze techniek in ons laboratorium door de techniek te wijzigen die oorspronkelijk werd beschreven door Sal, gepubliceerd in het tijdschrift Developmental Biology in 2001. We werkten ook samen met een crashlab om dit protocol ook in de zich ontwikkelende dilon vast te stellen.
De visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de injectie- en elektroporatiefasen moeilijk te leren zijn omdat ze een zeer zorgvuldige manipulatie van de embryo's vereisen en de injectieplaatsen soms erg klein kunnen zijn. Voorbeeld, de subretinale ruimte. Het demonstreren van de procedure zal vandaag worden gedaan door Rajiv, een postdoc van het Sherman's Laboratory. Om te beginnen, reinig en steriliseer alle chirurgische gereedschappen. Vul vervolgens spuiten met fysiologische zoutoplossing en lactaatringer-oplossing en plaats ze op een verwarmingskussen om op te warmen in het operatiegebied.
Steriliseer een verwarmingskussen met 70% ethanol en bedek het vervolgens met een gesteriliseerde, kreukvrije gaaspad. Stel het verwarmingskussen in op 37 graden Celsius. Plaats het dier in een kleine anesthesiekamer en anesthetiseer het door 5% isofluorine met zuurstof bij een liter per minuut via een verdamper te leveren.
Zorg ervoor dat de isofluorine-uitlaat wordt opgevangen met behulp van een opvangsysteem. Zodra de ademhaling van het dier diep en regelmatig is, verwijdert u het uit de kamer. Gebruik teen knijpen en oogknipreflexen.
Om volledige anesthesie te garanderen. Plaats het anesthetiseerde dier op zijn buik en gebruik een ademhalingsbuis om tijdens de operatie 2,25% ijsfluorine te leveren. Injecteer buprenorfine in een concentratie van 0,1 milligram per kilogram lichaamsgewicht subcutaan aan de achterkant van de nek.
Blijf de ademhaling van het dier controleren en pas de stroom isofluorine indien nodig aan. Plak vervolgens een plek tape over de borst van het anesthetiseerde dier en controleer opnieuw op een terugtrekkingsreactie door de achterpoot met stompe pincetten te knijpen. Gebruik een steriele wattenstaafje om een dikke laag de cream op de buik te smeren en zorg ervoor dat de ondervacht volledig is bedekt.
Laat de cream ongeveer drie minuten staan en controleer periodiek op haarverwijdering. Gebruik een steriele wattenstaaf om een steriele gaaspad nat te maken met steriel water en veeg het haar van de buik. Steriliseer vervolgens de snede met chloorhexidine en meer water.
Droog de buik met schone steriele gaas. Herhaal deze stap met 70% ethanol met behulp van vers gesteriliseerde katoenen gaas. Bereid u voor op de operatie door chirurgische kledij aan te trekken om de baarmoederhoorns bloot te leggen.
Loceer eerst de linea alba als de zwakke lijn onder de huid op de middellijn. Trek de huid met behulp van pincetten weg van de buikwand en maak een kleine rechte insnijding vanaf het midden van de buik naar beneden met behulp van rechte pincetten en schaar. Herhaal het proces met het peritoneum. Pak het peritoneum vast met de pincetten.
Trek weg en snijd vervolgens een insnijding die net groot genoeg is om de baarmoeder doorheen te trekken. Plaats steriele gaas met een kleine verticale snede over de insnijding en maak het vochtig met warm steriel zoutoplossing. Schuif vervolgens de pincetten in de insnijding en lokaliseer de baarmoeder terwijl de insnijding met de pincetten open wordt gehouden.
Pak de baarmoeder tussen de eerste en tweede zichtbare embryo's vast en trek beide zijden van de baarmoederhoorns op het gaas. Tel het aantal embryo's en noteer eventuele reabsorptie of embryo's met een kleine lichaamsgrootte. Om het juiste aantal DNA-injecties voor te bereiden, bevochtigt u de baarmoederhoorns met zoutoplossing en brengt u een baarmoederhoorn voorzichtig te
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor in utero electroporatie, een techniek die nauwkeurige genoverdracht in het ontwikkelende centrale zenuwstelsel (CZS) mogelijk maakt. De methode maakt de gerichte introductie van expressieconstructen in verschillende embryonale regio's van het CZS mogelijk, waaronder het telencephalon, diencephalon en de retina.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Genoverdracht
- Embryonale ontwikkeling
Achtergrond
- In utero electroporatie is een methode voor genmanipulatie in embryo's.
- Deze techniek is essentieel voor het bestuderen van genfuncties tijdens de ontwikkeling van het centraal zenuwstelsel (CZS).
- Het maakt ruimtelijke en temporele controle over de genexpressie mogelijk.
- Toepassingen omvatten het onderzoeken van het gedrag en de differentiatie van neurale progenitorcellen.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor in utero electroporatie.
- Om de aflevering van genetisch materiaal in specifieke regio's van het CZS te demonstreren.
- Om onderzoek naar de embryonale neuronale ontwikkeling te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Tijdig drachtige vrouwtjes worden chirurgisch voorbereid voor de procedure.
- DNA wordt geïnjecteerd in gerichte gebieden van het CZS, zoals de laterale ventrikel.
- Er wordt een elektrische stroom toegepast om de genopname te verhogen.
- Immunofluorescentiemicroscopie wordt gebruikt om de resultaten te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle genoverdracht werd bereikt in verschillende regio's van het centrale zenuwstelsel.
- De resultaten wezen op proliferatie en differentiatie van neurale progenitorcellen.
- Immunofluorescentiemicroscopie leverde visuele bevestiging van genexpressie.
- Het protocol is aanpasbaar voor verschillende experimentele behoeften.
Conclusies
- In utero electroporatie is een effectieve methode voor genoverdracht in embryo's.
- Deze techniek vergroot het inzicht in de ontwikkeling van het centraal zenuwstelsel.
- Het protocol kan worden aangepast voor diverse onderzoeksapplicaties.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Snelle, regio-specifieke genoverdracht in embryonale modellen van het CZS is cruciaal voor het verminderen van risico's bij target-validatie en het versnellen van vroeg neuro-ontwikkelingsonderzoek. In utero electroporatie maakt high-throughput, kostenefficiënte manipulatie van genexpressie in meerdere CZS-gebieden mogelijk, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid van mechanistische studies. Deze mogelijkheid stroomlijnt de overgang van discovery biology naar de ontwikkeling van preklinische modellen in neurofarmaceutische pipelines.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe ondervraging van genfuncties in ontwikkelende weefsels van het centraal zenuwstelsel mogelijk.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door in vivo loss-of-function- en gain-of-function-studies mogelijk te maken.
- Faciliteert snelle hypothesetoetsing voor neurodevelopmentele targets.
- Vermindert de tijd en kosten in vergelijking met de generatie van traditionele transgene modellen.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde embryonale CZS-systemen voor voor downstream fenotypische screening.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten via reporterconstructen en immunofluorescentie.
- Maakt schaalbare, geparallelliseerde studies in meerdere CZS-regio's mogelijk.
- Ondersteunt assay-standaardisatie voor vergelijkbaarheid tussen verschillende studies.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt genmanipulatie uit met ziekterelevante CNS-gebieden voor translationele continuïteit.
- Maakt monitoring van progenitor-rijping, differentiatie en migratie in vivo mogelijk.
- Faciliteert de risico-gecorrigeerde voortgang van neurodevelopmentale targets naar preklinische modellen.
- Ondersteunt de studie naar genetische pathways die ten grond liggen aan ontwikkelingsstoornissen van het CNS.
Integratie van Pijplijn & Workflow
In utero elektroporatie slaat een brug tussen vroege ontdekkingen en preklinisch onderzoek door snelle, gerichte genlevering in embryonale CNS-modellen mogelijk te maken.
- Ontdekkingsbiologie: Biedt een platform voor hypothese-gestuurde manipulatie van genexpressie in specifieke regio's van het centrale zenuwstelsel (CZS).
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare resultaten voor het evalueren van genfuncties en cellulaire fenotypes.
- Analytica: Ondersteunt immunofluorescentie-gebaseerde metingen van proliferatie, migratie en differentiatie.
- Translationeel onderzoek: Handhaaft continuïteit van embryonale manipulatie tot postnatale en functionele assays bij volwassenen.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Aanpasbaar protocol voor diverse CZS- en niet-CZS-organsystemen, wat bijdraagt aan een brede R&D-bruikbaarheid.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in neuroontwikkelingsstudies.
- Operationele waarde: Maakt snelle, gestandaardiseerde en schaalbare workflows voor genoverdracht mogelijk.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en kapitaalefficiëntie in vroege CNS-targetportfolio's.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van therapeutische programma's voor het CZS.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in embryonale chirurgie en microinjectietechnieken.
- Vereist precieze instrumentatie, waaronder micromanipulatoren en electroporatoren.
- Necessiteert een strikte steriele techniek en monitoring van de levensvatbaarheid van embryo's.
- Aanpasbaarheid van het protocol voor verschillende CNS-regio's en andere orgaansystemen wordt ondersteund.
- Voorzichtige hantering is essentieel om de overleving van embryo's en de reproduceerbaarheid te maximaliseren.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
3:06
Set-up and Anesthesia
4:26
Animal Preparation for Surgery
5:21
Incision and Exposure of Uterine Horns
6:45
Injection of DNA into Vesicles
8:23
Electroporation
9:13
Suturing and Stapling
10:12
Fluorescent Protein Expression in Multiple CNS Territories of Electroporated Embryonic Mouse Brain
11:52
Conclusion
