Name: Orale Biofilm Analyse van de Palatal Expanders door middel van fluorescentie in-situ hybridisatie en confocale laser scanning microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Leer orale biofilmanalyse van palatale expanders met fluorescentie in-situ hybridisatie en confocale laser scanning microscopie. Deze methode onthult de structuur en samenstelling van bacteriële gemeenschappen voor onderzoek naar parodontale gezondheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de Hygiene Fonds van de Medische Universiteit Graz. Alle proefpersonen gaven hun informed consent. Institutionele goedkeuring van de studie protocol werd verkregen van de Medische Universiteit Graz.

1. Specimen collectie <ol><li> Verwijder de vaste palatinale expanders na 4 maanden van intraorale service. Gebruik NOLA Droog veld Systeem om de toestellen te isoleren voordat u ze (figuren 1 en 2). </li><li> Gebruik gesteriliseerde tangen, handschoenen en trays te expanders te verwijderen zonder toevoeging van verontreiniging (figuren 3 en 4). </li><li> Bewaar objecten in Sarstedt 120 ml flacons bij -20 ° C. Nemen om het laboratorium op het ijs en het proces binnen 24 uur. </li></ol> 2. Biofilm fixatie <ol><li> Schraap biofilm schilfers met een steriele scalpel, of het verzamelen stukken met steriel pincet. </li><li> Voeg ijskoude 4% PFA-oplossing tot monster wordt goed gedekt. </li><li> Incubeer dit mengsel bij +4 ° C (niet invriezen) gedurende 3 tot 12 uur. Langere fixatietijden of hogere temperaturen kunnen fixatie maken de cel enveloppen van gram-negatieve cellen minder doorlaatbaar voor oligonucleotideprobes. </li><li> Verwijder de PFA oplossing en wassen met ijskoud 1X PBS. Herhaal deze stap 2-3 keer aan rerwijderen resterende PFA. </li><li> Resuspendeer het monster in 1 vol. ijskoud 1X PBS en voeg 1 vol. ijskoude 96% (v / v) ethanol. </li><li> Bewaar het monster bij -20 ° C. Monsters vastgesteld op basis van dit protocol kan worden opgeslagen voor enkele maanden tot jaren. </li></ol> 3. Uitdroging van vaste monsters <ol><li> Toe te passen 5-30 ul van PFA-vaste monstermateriaal op een objectglaasje. </li><li> Droog bij 46 ° C voor ongeveer 15 minuten of bij kamertemperatuur langer. Ontdooi de lysozym en de formamide. </li><li> Voeg 250 ul van lysozym (1mg/ml) bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, waardoor het gemakkelijker penetratie van de sondes in de cellen door de gedeeltelijke vernietiging van de celwanden. </li><li> Dip glijden in 50%, 80% en 96% (v / v) ethanol gedurende 3 minuten elk. Het uitdrogend effect van de concentratie ethanol serie zal desintegreren van de celmembranen. </li><li> Droog de glaasjes op 46 ° C gedurende 10 minuten. </li></ol> 4. In-situ hybridisatie <ol><li> Bereid 1 mlverse hybridisatie buffer (zie tabel 1 voor de concentraties). Formamide concentraties die in deze studie: 10% (EUBmix), 20% (Bac303, POGI, MUT590) of 45% (LGCmix). </li><li> Ontdooi de oligonucleotide probe-oplossingen. Ontdooide sondes worden bewaard op ijs en beschermd tegen licht. </li><li> Voeg 2 pi van elke probe tot 200 ul van hybridisatie buffer, goed mengen en breng het mengsel op de gedroogde monster op een microscoopglaasje. </li><li> Leg een stukje weefsel papier in een vierkant petrischaal en giet de rest van hybridisatie buffer op het weefsel papier. </li><li> Onmiddellijk horizontaal plaatsen van de dia in de schotel en sluit de schotel. Incubeer in een oven op 46 ° C voor 1-5 uur (90 min volstaan ​​in de meeste gevallen). De schotel fungeert als een vocht kamer het voorkomen van verdamping van hybridisatie-oplossing uit de dia. In het bijzonder kan de verdamping van formamide oorzaak niet-specifieke probe binding aan non-target cellen. </li><li> Bereid 50 ml wasbuffer (zie tabel 2 voor concentrations). Bereid de wasbuffer in een 50 ml buis en verwarm tot 48 ° C in een waterbad. De wasstap wordt uitgevoerd bij 48 ° C. </li><li> Haal de schotel met de dia in de hybridisatie oven. Onmiddellijk wassen uit de hybridisatie buffer met een klein volume van de voorverwarmde wasbuffer, en breng de dia in de resterende wasbuffer. </li><li> Plaats de buis met het wassen buffer en de schuif terug in het waterbad en incubeer bij 48 ° C gedurende 10-15 minuten. </li><li> Verwijder dia uit de tube en dip in de ijskoude DDH 2 O voor 2-3 seconden om de resterende wasbuffer te elimineren. </li><li> De lucht drogen de schuif zo snel mogelijk (het gebruik van perslucht wordt aanbevolen). Sneldrogende zal verminderen sonde dissociatie. </li><li> Gedroogde dia's kunnen worden opgeslagen in het donker bij -20 ° C gedurende enkele weken zonder een significant verlies van de probe-verleende fluorescentie-signaal. </li></ol> 5. Microscopie <ol><li> Na het FISH en wassen, apply twee druppels antifadent de buurt van de linker-en rechterzijde van een dia (bevroren plakjes moet worden opgewarmd tot kamertemperatuur voorafgaand aan deze stap). </li><li> Plaats een microscoop dekglas op de top en wacht tot de antifadent heeft verspreid over de hele dia. Merk op dat een overmatige hoeveelheid antifadent kan de microscoop beeld vervagen. </li><li> Let op de monsters onder een confocale laser scanning microscoop uitgerust met geschikte filters of lasers. We gebruikten een Leica TCS unit (HCX PL APO/63x; NA 1.2). Gegevens kunnen worden geanalyseerd met software zoals IMARIS of AMIRA. </li><li> Dia's zijn ingebed in antifadent kan worden opgeslagen bij +4 ° C (niet invriezen) tot 7 dagen voor de probe-verleende fluorescentie begint te dalen. Als alternatief kan de antifadent worden verwijderd met DDH 2 O, en de gedroogde dia's kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C voor een langere periode van tijd. </li></ol> 6. Representatieve resultaten: Schrapen biofilm off vaste orthodontische apparatuur (Figuur 5) geeft geschikt vlokken (Figuur 6), die direct kan worden gehybridiseerd op gecoat glas dia's voor microscopie. Op deze manier kunnen verschillende groepen orobiome bacteriën geïdentificeerd worden in hun natuurlijke driedimensionale omgeving door tagging bacteriële rRNA met verschillend gelabelde specifieke probes (figuren 7 en 8). In figuur 7 is biofilm gekleurd met EUBmix (groen, alle bacteriën) en LGCmix (geel, Firmicutes). Firmicutes in het groen, als ze waren gekleurd met geel en blauw. In Figuur 8, werd biofilm gekleurd met EUBmix (rood, alle bacteriën), Bac303 (blauw, Bacteroidetes) en POGI (geel, Porphyromonas gingivalis). Porphyromonas gingivalis wordt weergegeven in geelachtig wit, omdat alle drie probes binden aan het DNA en de overlap van kleuren resulteert in een wit signaal. Morfologische verschillen tussen groepen van bacteriën kunnen ook worden geïdentificeerd (figuren 9 en 10). Grote clusters van coccoid bacteriën zijn weergegeven in Figuur 9, waar de kleuring werd uitgevoerd met EUBmix (groen, alle bacteria). Verschillende vormen van orale bacteriën werden gevisualiseerd in figuur 10, waar coccoid en filamenteuze bacteriën kunnen worden onderscheiden door kleuring met EUBmix (rood). Ook een typische paddestoel-achtige structuur van de biofilm kan worden verwerkt via de 3D-modellering van de CLSM gegevens (figuren 11 en 12) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1%20Klug%20Santigli%2001_2_JES_Web.mov">Klik hier voor een filmpje van de 3D-modellering te kijken.</a> <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Fixed palatinale expander in situ. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Nola Droog Field System. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Gesteriliseerde tangen, handschoenen en een lade. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Verwijderde expander. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Afschrapen biofilm met een steriel scalpel. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. Resin vlokken direct gehybridiseerd op gecoat glas dia's. <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 7"> Figuur 7 CLSM afbeelding:. Differentiatie van een specifieke bacteriële groep. 2D-overlay van 3D CLSM stack gegevens. Biofilm gekleurd met EUBmix (groen, alle bacteriën) en LGCmix (geel, Firmicutes). <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 8"> Figuur 8 CLSM afbeelding:. Differentiatie van een specifieke bacteriële groep. 2D-overlay van 3D CLSM stack gegevens. Biofilm gekleurd met EUBmix (rood, alle bacteriën), Bac303 (blauw, Bacteroidetes) en POGI (geel, Porphyromonas gingivalis). <img alt="Figuur 9" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig9.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 9"> Figuur 9 CLSM afbeelding:. Differentiatie van specifieke morfologiën. 2D-overlay van 3D CLSM stack gegevens. Biofilm gekleurd met EUBmix (groen, alle bacteriën). Grote clusters van coccoid bacteriën (pijlen). <img alt="Figuur 10" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig10.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 10"> . Figuur 10 CLSM foto's: differentiatie van specifieke morfologiën. 2D-overlay van 3D CLSM stack gegevens. Biofilm gekleurd met EUBmix (rood, alle bacteriën). Coccoid (pijl hieronder) en filamenteuze bacteriën (pijl boven) kan worden onderscheiden. <img alt="Figuur 11" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 11"> Figuur 11. Mushroom structuur, 3D-weergave van onderen. Stapels van biofilm vlokken (afgeschraapt het oppervlak van een orthodontische toestel), gekleurd met EUBmix en proceduresssed met IMARIS (CLSM beeld). <img alt="Figuur 11" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 11"> Figuur 12. Mushroom structuur, 3D-zijaanzicht. Stapels van biofilm vlokken (afgeschraapt het oppervlak van een orthodontische toestel) verwerkt met IMARIS (CLSM beeld). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Hybridisatiebuffer (200 pi) </td></tr><tr><td> Formamide concentratie </td><td> 10% </td><td> 20% </td><td> 45% </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 36 </td><td> 36 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 2% SDS </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> FA </td><td> 20 </td><td> 40 </td><td> 90 </td></tr><tr><td>2 O </td><td> 138 </td><td> 118 </td><td> 68 </td></tr><tr><td> Elke FISH probe </td><td> 2 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Bestanddelen van hybridisatie buffer (concentraties in pi). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Wassen buffer (50 ml) </td></tr><tr><td> Formamide concentratie </td><td> 10% </td><td> 20% </td><td> 45% </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 4500 </td><td> 2150 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> 0 </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 44 500 </td><td> 46 350 </td> 48 200 </tr></tbody></table> Tabel 2. Bestanddelen van wasbuffer (concentraties in pi). Film 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1%20Klug%20Santigli%2001_2_JES_Web.mov">Klik hier om de film te bekijken.</a>

<ol><li>Sunde, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+for+direct+visualization+of+bacteria+in+periapical+lesions+of+asymptomatic+root-filled+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of bacteria in periapical lesions of asymptomatic root-filled teeth.</a> Microbiology. 149, 1095-1102 (2003).</li>
<li>Sussman, M., Loya, Y., Fine, M., Rosenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marine+fireworm+Hermodice+carunculata+is+a+winter+reservoir+and+spring-summer+vector+for+the+coral-bleaching+pathogen+Vibrio+shiloi%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The marine fireworm Hermodice carunculata is a winter reservoir and spring-summer vector for the coral-bleaching pathogen Vibrio shiloi.</a> Environ. Microbiol. 5, 250-255 (2003).</li>
<li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+among+oral+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Communication among oral bacteria.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66, 486-505 (2002).</li>
<li>Zijnge, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+biofilm+architecture+on+natural+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oral biofilm architecture on natural teeth.</a> PLoS One. 5, e9321-e9321 (2010).</li>
<li>Thurnheer, T., Gmur, R., Giertsen, E., Guggenheim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+fluorescent+in+situ+hybridization+for+the+specific+detection+and+quantification+of+oral+streptococci+in+dental+plaque%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated fluorescent in situ hybridization for the specific detection and quantification of oral streptococci in dental plaque.</a> J. Microbiol. Methods. 44, 39-47 (2001).</li>
<li>Hojo, K., Nagaoka, S., Ohshima, T., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+interactions+in+dental+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dent.+Res%22%5BJournal%5D)">Bacterial interactions in dental biofilm development.</a> J. Dent. Res. 88, 982-990 (2009).</li>
<li>Jung, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+initial+bacterial+colonization+on+dentine+and+enamel+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualization of initial bacterial colonization on dentine and enamel in situ.</a> J. Microbiol. Methods. 81, 166-174 (2010).</li>
<li>Al-Ahmad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonization+of+enamel+in+situ+investigated+using+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonization of enamel in situ investigated using fluorescence in situ hybridization.</a> J. Med. Microbiol. 58, 1359-1366 (2009).</li>
<li>Bryers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Medical biofilms.</a> Biotechnol. Bioeng. 100, 1-18 (2008).</li>
<li>Cardinale, M., Vieira de Castro, J., Muller, H., Berg, G., Grube, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+the+bacterial+community+associated+with+the+reindeer+lichen+Cladonia+arbuscula+reveals+predominance+of+Alphaproteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of the bacterial community associated with the reindeer lichen Cladonia arbuscula reveals predominance of Alphaproteobacteria.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 66, 63-71 (2008).</li>
<li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+normal+bacterial+flora+of+the+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Defining the normal bacterial flora of the oral cavity.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).</li>
<li>Chin, M. Y., Busscher, H. J., Evans, R., Noar, J., Pratten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+biofilm+formation+and+the+effects+of+antimicrobial+agents+on+orthodontic+bonding+materials+in+a+parallel+plate+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Orthod%22%5BJournal%5D)">Early biofilm formation and the effects of antimicrobial agents on orthodontic bonding materials in a parallel plate flow chamber.</a> Eur. J. Orthod. 28, 1-7 (2006).</li>
<li>Loy, A., Maixner, F., Wagner, M., Horn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((probeBase--an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes%3A+new+features+2007%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes: new features 2007.</a> Nucleic. Acids. Res. 35, (2007).</li>
<li>Diaz, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+subject-specific+oral+microflora+during+initial+colonization+of+enamel%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2837-2848 (2006).</li>
<li>Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+identification+of+streptococci+and+other+bacteria+in+initial+dental+biofilm+by+confocal+laser+scanning+microscopy+and+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Oral+Sci%22%5BJournal%5D)">In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization.</a> Eur. J. Oral Sci. 115, 459-467 (2007).</li>
<li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+interactions+and+successions+during+plaque+development%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology%22%5BJournal%5D)">Bacterial interactions and successions during plaque development.</a> Periodontology. 42, 47-79 (2000).</li>
<li>Kolenbrander, P. E., Palmer, R. J., Periasamy, S., Jakubovics, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+multispecies+biofilm+development+and+the+key+role+of+cell-cell+distance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oral multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 471-480 (2010).</li>
<li>Chalmers, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantum+dot+luminescent+probes+to+achieve+single-cell+resolution+of+human+oral+bacteria+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 630-636 (2007).</li>
<li>Wecke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+monitoring+the+development+of+bacterial+biofilms+in+human+periodontal+pockets%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">A novel technique for monitoring the development of bacterial biofilms in human periodontal pockets.</a> FEMS Microbiol. Lett. 191, 95-101 (2000).</li>
<li>Moter, A., Gobel, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+for+direct+visualization+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms.</a> J. Microbiol. Methods. 41, 85-112 (2000).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De beschreven protocol hierin is een zeer bruikbare benadering voor vlekken biofilms verzameld uit harde materialen. Bemonstering en hybridisatie zijn de meest kritische stappen. Tijdens de bemonstering, moet erop worden gelet dat de schijfjes van voldoende dikte worden verzameld om ervoor te zorgen dat de biofilm-structuur intact blijft. Tijdens de hybridisatie, is het essentieel om te grote temperatuurschommelingen te vermijden, zo te voorkomen niet-specifieke binding, of verlies van binding, van de fluorescent gelabelde probes. Deze vis protocol is een elegante methode om de normale heterogene biofilm vlek direct op glasplaatjes zonder verstoring van de samenstelling ervan. De dia&#39;s kunnen direct worden gebruikt voor microscopie, zonder de noodzaak om het monster te verplaatsen opnieuw. Op deze manier is een verbetering ten opzichte van kleuring in buizen bereikt met minder dwarskracht wordt toegepast op de biofilm. Slices&gt; 50 urn dik kan worden voorbereid en onderzocht op deze manier.

orale biofilm analyse van de palatal expanders door middel van fluorescentie in-situ hybridisatie en confocale laser scanning microscopie

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Confocale laser scanning microscopie (CLSM) van natuurlijke heterogene biofilm wordt vergemakkelijkt vandaag door een uitgebreide reeks kleuren van technieken, een van hen is fluorescentie in situ hybridisatie (FISH). 1,2 We hebben een pilot-studie waarin orale biofilm monsters van vaste uitgevoerd orthodontische apparatuur (palatinale expanders) werden gekleurd door FISH, de doelstelling om de drie-dimensionale organisatie van de natuurlijke biofilm en plaque accumulatie te beoordelen. 3,4 FISH creëert een mogelijkheid om cellen vlek in hun eigen biofilm milieu door het gebruik van fluorescent gelabelde 16S rRNA-targeting sondes. 4-7,19 Vergeleken met alternatieve technieken, zoals immunofluorescentie etikettering, dit is een goedkope, nauwkeurige en eenvoudig etikettering techniek om verschillende bacteriële groepen te onderzoeken in gemengde biofilm consortia. 18,20 General probes werden gebruikt die binden aan Eubacteria ( EUB338 + + EUB338II EUB338III; hierna EUBmix), 8-10 Firmicutes (LGC354 AC;. Waren hierna LGCmix), 9,10 en Bacteroidetes (Bac303) 11 Daarnaast zijn specifieke probes binding aan Streptococcus mutans (MUT590) 12,13 en Porphyromonas gingivalis (POGI) 13,14 gebruikt . De extreme hardheid van de betrokken oppervlakte materialen (roestvrij staal en acryl hars) dwong ons om nieuwe manieren van voorbereiding van de biofilm te vinden. Omdat deze oppervlakte-materialen kunnen niet gemakkelijk worden gesneden met een cryotome, werden verschillende bemonsteringsmethoden onderzocht om intact mondeling biofilm te verkrijgen. De meest werkbare van deze aanpak wordt gepresenteerd in deze mededeling. Kleine vlokken van de biofilm-dragende acrylhars werden afgeschraapt met een steriele scalpel, zorg ervoor dat u de biofilm-structuur beschadigen. Tang werden gebruikt om biofilm te verzamelen van de stalen oppervlakken. Eenmaal verzameld, werden de monsters vast en direct geplaatst op polysine gecoat glas dia&#39;s. FISH werd direct uitgevoerd op deze dia&#39;s met de sondes mentioned hierboven. Verschillende FISH protocollen werden gecombineerd en aangepast aan een nieuw protocol, dat was gemakkelijk te hanteren maken. 5,10,14,15 Vervolgens worden de monsters werden geanalyseerd door confocale laser scanning microscopie. Bekende configuraties 3,4,16,17 kan worden gevisualiseerd, waaronder champignon-achtige formaties en clusters van coccoid bacteriën doordrongen door kanalen. Daarnaast werden de bacteriële samenstelling van deze typische biofilm structuren geanalyseerd en 2D-en 3D-beelden gemaakt.

We presenteren een protocol voor structurele en analyse van de samenstelling van natuurlijke orale biofilm van orthodontische apparatuur met<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) en confocale laser scanning microscopie (CLSM). Orale biofilm monsters werden verzameld van palatinale expanders, schrapen acryl-hars vlokken van hun oppervlak en verwijzen ze voor de moleculaire verwerking.

Orale Biofilm Analyse van de Palatal Expanders door middel van fluorescentie in-situ hybridisatie en confocale laser scanning microscopie

Confocale laser scanning microscopie (CLSM) van natuurlijke heterogene biofilm wordt tegenwoordig gefaciliteerd door een uitgebreid assortiment aan kleurtechnieken, waarvan één van...

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van een native orale biofilm van palatale expanders voor fluorescentie in situ hybridisatie. Dit wordt bereikt door eerst de palatale expander te verwijderen, die de vier maanden oude biofilm van de patiënt draagt. Vervolgens worden de acrylharsvlokken die de biofilm bevatten van de palatale expander afgeschraapt.Vervolgens wordt fluorescentie-in-situ-hybridisatie van de gefixeerde biofilm direct op gecoate objectglaasjes uitgevoerd. Tot slot wordt de gekleurde biofilm geanalyseerd met behulp van confocale laser-scanning microscopie. Uiteindelijk worden de structuur en samenstelling van bacteriële biofilmgemeenschappen aangetoond via fluorescentie-in-situ-hybridisatie en confocale laser-scanning microscopie. Het idee voor deze methode ontstond toen we dikke biofilms tegenkwamen op orthodontische expanders die met het blote oog zichtbaar waren.Ze lieten ons nadenken over mogelijke associaties tussen deze en parodontale ziekten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de orale microbiologie, zoals de ruimtelijke schikking en samenstelling van inheemse orale biofilmen. De methode is interdisciplinair en moet door verschillende specialisten worden uitgevoerd.Om te beginnen: Elizabeth is een orthodontist en Barbara is een moleculair biologisch laborant. Isoleer na vier maanden intraoraal oppervlak, met behulp van het NOLA dry field-systeem, de gefixeerde palatinale expander om contaminatie te voorkomen. Verwijder het apparaat uit de mond van de patiënt met behulp van gesteriliseerde tangen, handschoenen en trays.Bewaar de objecten in flacons van 120 milliliter bij -20 °C. Breng ze op ijs naar het laboratorium en verwerk ze binnen 24 uur om de specimens te fixeren. Schraap biofilmvlokken af met een steriel scalpel of verzamel stukjes met een steriele pincet.Het is essentieel om acrylharsvlokken van voldoende dikte af te schrapen om te garanderen dat de biofilmstructuur intact blijft in een ijskoude 4% paraldehyde-oplossing totdat het monster volledig is bedekt. Incubeer het mengsel gedurende drie tot 12 uur bij vier graden Celsius.Langere fixatietijden of hogere fixatietemperaturen kunnen de celenveloppen van gramnegatieve cellen minder doorlaatbaar maken voor oligonucleotide-sondes. Verwijder na de incubatie de paraldehyde-oplossing en was met ijskoud 1x PBS. Herhaal deze stap twee tot drie keer om resterend paraldehyde te verwijderen; spoel het monster in één volume ijskoud 1x PBS en voeg één volume ijskoude 96% ethanol toe. Bewaar het monster bij -20 °C.Monsters kunnen enkele maanden tot jaren worden bewaard om het monster te dehydrateren. Breng eerst 5 tot 30 µL van het met paraldehyde gefixeerde monstermateriaal aan op een microscoopglaasje. Droog het monster 15 minuten bij 46 °C of langer bij kamertemperatuur; terwijl het monster droogt, breken het lysozym en het formaldehyde de celwanden gedeeltelijk af.Voor een betere penetratie van de probes wordt 250 µL van een lysozyme-oplossing van 1 mg/mL toegevoegd gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, waarna de slides elk drie minuten worden ondergedompeld in 50%, 80% en 96% ethanol. Het dehydraterende effect van de ethanolconcentratie-reeks zal de membranen desintegreren voor een betere opname van de oligonucleotide probes. Droog de slides tot slot bij 46 °C om in situ U-hybridisatie uit te voeren.Begin met het bereiden van één milliliter verse hybridisatiebuffer en verwarm deze voor tot 47 °C. Ontdooi de oligonucleotide-sondeo-oplossingen op ijs en bewaar deze beschermd tegen licht. Plaats een stukje weefselpapier in een vierkante Petrischaal en pipetteer 800 µL van de hybridisatiebuffer op het weefselpapier.Sluit de kamer onmiddellijk opnieuw aangezien de buffer formamide bevat, voeg twee µL van elke probe toe aan 200 µL van de rest van de hybridisatiebuffer. Meng goed en breng het mengsel onmiddellijk aan op het gedehydrateerde monster op een microscoopglaasje, plaats het glaasje horizontaal in de schaal en dek deze af. Incubeer de schaal in een oven gedurende één tot vijf uur bij 46 °C.De schaal fungeert als bevochtigingskamer om verdamping van de hybridisatieoplossing van de slide te voorkomen. In het bijzonder kan de verdamping van formamide leiden tot aspecifieke binding van probes aan niet-doelcellen. Bereid 50 milliliter wasbuffer voor en verwarm deze voor tot 48 graden Celsius in een waterbad.Verwijder de schaal met de objectglas uit de hybridisatieoven. Spoel de hybridisatiebuffer onmiddellijk weg met een klein volume voorverwarmde wasbuffer en breng het objectglas over naar de resterende wasbuffer. Plaats de buis met de wasbuffer en het objectglas terug in het waterbad en incubeer gedurende 10 tot 15 minuten bij 48 °C.Om de monsters met meer dan één probe te kleuren, worden de voorgaande stappen herhaald nadat de wasbuffer is verwijderd; let er hierbij op om te beginnen met de hoogste concentratie en vervolgens naar een mildere concentratie over te gaan. Haal het objectglas uit de buis en dompel het in ijs.Koud dubbel gedestilleerd water gedurende twee tot drie seconden. Om resterende wasbuffer te elimineren, moet de slide zo snel mogelijk aan de lucht worden gedroogd, aangezien snel drogen de dissociatie van de probe vermindert.Bewaar de gedroogde preparaten donker bij -20 °C gedurende enkele weken zonder significant verlies van het door de probe veroorzaakte fluorescentiesignaal. Om de monsters af te beelden, brengt u twee druppels Antifa-reagens aan nabij de linker- en rechterzijde van een objectglas en plaatst u vervolgens een dekglas. Observeer de monsters onder een confocale laserscanning-microscoop uitgerust met geschikte filters of lasers; de preparaten kunnen tot zeven dagen bij 4 °C worden bewaard, of kunnen worden gewassen met dubbel gedestilleerd water en voor langere perioden bij -20 °C worden bewaard.Het betreft de beeldvorming van biofilm van gefixeerde orthodontische beugels. U verkrijgt geschikte schilfers die direct gehybridiseerd kunnen worden op gecoate glasplaatjes voor microscopie; door middel van specifieke probes kunnen verschillende groepen van het orale microbioom en bacteriën in een driedimensionale configuratie worden geïdentificeerd. In deze figuur werd de biofilm gekleurd met EUB-mix en LGC-mix; vaste structuren verschijnen groen, terwijl ze met geel en blauw zijn gekleurd.Hier is de biofilm gekleurd met EUB mix back 3 0 3 en pogi. Bacteriën van de groep bacteria dts verschijnen in roze en poor fire. Ramons gingivalis wordt weergegeven in geelachtig wit, aangezien alle drie de probes aan het DNA binden en de overlap van kleuren resulteert in een wit signaal. Morfologisch.Verschillen tussen groepen bacteriën kunnen evenzo worden geïdentificeerd, evenals bepaalde structuren zoals grote clusters van coccen. Voorbeelden van dergelijke clusters worden hier getoond waarbij EUB mix is gebruikt voor kleuring. Daarnaast kan een typische paddenstoelachtige structuur van de biofilm worden verwerkt via 3D-modellering van de CLSM-gegevens.Dit is een 3D-animatie van de EUB-gemengd gekleurde biofilm. Deze methode kan inzicht bieden in orthodontisch geïnduceerde biofilmvorming. Het kan ook worden toegepast op elk ander kunstmatig oppervlak in het menselijk lichaam dat complexe biofilmstructuren met mogelijke pathogeniciteit bevat.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u native orale biofilms kunt prepareren voor fluorescentie in situ hybridisatie en confocale laserscanningmicroscopie. Het is belangrijk om te onthouden dat dit een interdisciplinair veld is en dat u alleen succesvol kunt zijn in een team. Behandel uw collega's daarom altijd vriendelijk.

oral-biofilm-analysis-palatal-expanders-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Biofilms gevormd op tandoppervlakken zijn zeer complex en worden blootgesteld aan een constante aangeboren en exogene milieu-uitdagingen, die hun architectuur moduleren, fysiologie en transcriptoom. We ontwikkelden een toolbox om de samenstelling, de structurele organisatie en gen-expressie van orale biofilms, die kan worden aangepast aan andere gebieden van de biofilm onderzoek te onderzoeken.

Een analytisch instrument-box voor de Uitgebreide Biochemische, structurele en Transcriptome Evaluatie van orale biofilms gemedieerd door mutans streptococcen

Source: Tay, S. B., et.al. Anti-virulent Disruption of Pathogenic Biofilms using Engineered Quorum-quenching Lactonases. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of inhibiting biofilm formation by introducing an enzyme that disrupts bacterial cell signaling. The enzyme prevents the bacteria from producing extracellular polymeric substances, thereby reducing biofilm development on a glass-bottomed microdish. Finally, the biofilm structure is visualized using fluorescent lectins and...

Microscopic Assessment of Enzyme-Mediated Inhibition of Biofilm Formation

This video demonstrates a real-time assay for monitoring extracellular pH in dental biofilms using a pH-sensitive ratiometric probe. When an in situ-grown bacterial biofilm is exposed to glucose, a reduction in extracellular pH near the bacterial biomass protonates the probe, leading to its increased concentration inside the bacteria. The disparity in emission wavelength between the protonated and unprotonated probe is utilized to calculate the pH across the extracellular matrix of the biofilm...

An Assay for Real-Time Monitoring of Extracellular pH in Dental Biofilms

Een protocol voor de gelijktijdige kwantificering en vergelijking van drie cellulaire en extracellulaire componenten binnen biofilms wordt gepresenteerd. De methodologie omvat het gebruik van confocale laserscanningmicroscopie, software voor biofilmstructuuranalyse en -visualisatie, en statistische analysesoftware.

Concurrent Kwantificering van Cellulaire en extracellulaire componenten van biofilms

Het doel van deze methoden papier is het gebruik van een microfluïdische systeem te beschrijven voor de ontwikkeling van multi-species biofilms dat soort gewoonlijk geïdentificeerd in humaan supragingivale tandplaque bevatten. Methoden om biofilm architectuur, biofilm levensvatbaarheid, en een aanpak om te oogsten biofilm voor cultuur-afhankelijke of cultuur-onafhankelijke analyses zijn gemarkeerd beschrijven.

Toepassing van een High-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluïdische System op mondelinge Multi-species biofilms Ontwikkel

Een pH-gevoelige ratiometrische kleurstof wordt gebruikt in combinatie met confocale laser scanning microscopie en digitale beeldanalyse extracellulaire pH in tandheelkundige biofilms in real-time te volgen.

Ratiometrische Imaging van extracellulaire pH in Dental biofilms

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode te groeien en kwalitatief analyseren bacteriële biofilms op schimmeldraden door confocale en elektronenmicroscopie.

Een nieuwe methode voor Kwalitatieve Multi-schaal analyse van bacteriële biofilms op draadschimmelcel Koloniën met behulp van confocale en Electron Microscopy

Veranderingen in de mondelinge microbiome tijdens jeugd zijn van toenemende belangstelling. Vergelijking van verschillende microbiome studies blijkt een gebrek aan gestandaardiseerde bemonstering protocollen. Beperkte ruimte maakt het geluid subgingivale Sulcus (hersenanatomie) van kinderen uitdagende bemonstering. Papieren punt bemonstering wordt hier in detail gepresenteerd als de methode van keuze voor dit gebied.

Mondelinge Biofilm bemonstering voor analyse van de Microbiome bij gezonde kinderen

Hier presenteren we een protocol om te evalueren van mondelinge biofilm vorming op titanium en zirconia materialen voor tandheelkundige prothese abutments, met inbegrip van de analyse van de levensvatbaarheid van de bacteriële cellen en morfologische kenmerken. Een in situ -model die samenhangen met krachtige microscopie technieken wordt gebruikt voor de analyse orale biofilm.

Mondelinge Biofilm vorming op verschillende materialen voor tandheelkundige implantaten

Het protocol beschrijft de teelt van cross-kingdom biofilms bestaande uit Candida albicans en Streptococcus mutans en presenteert een confocale microscopie-gebaseerde methode voor het monitoren van extracellulaire pH in deze biofilms.

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms met behulp van ConfocalMicroscopie

Het doel van dit protocol is een gestandaardiseerde benadering te bieden voor het kwantitatief beoordelen van de integriteit van de muisachtige gingivale epitheliale barrière door topisch fluorescentie-gelabelde dextrans van verschillende molecuulgroottes op het gingivale oppervlak in vivo toe te passen, gevolgd door ex vivo beeldvorming met een enkelfotonmicroscopiesysteem.

Functionele beoordeling van de muis-gingivale epitheliale barrière met behulp van fluorescerende tracers

Leer orale biofilmanalyse van palatale expanders met fluorescentie in-situ hybridisatie en confocale laser scanning microscopie. Deze methode onthult de structuur en samenstelling van bacteriële gemeenschappen voor onderzoek naar parodontale gezondheid.

Orale Biofilm Analyse van de Palatal Expanders door middel van fluorescentie in-situ hybridisatie en confocale laser scanning microscopie (Video) | JoVE Journal

Orale Biofilm Analyse van de Palatal Expanders door middel van fluorescentie in-situ hybridisatie en confocale laser scanning microscopie

Meer video's verkennen