Name: Calcium Imaging van Geur-reacties van de consument in de Drosophila Antennaal Lobe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Leer calcium imaging van geur-reacties in de antennale lob van Drosophila melanogaster. Deze optische methode meet intracellulaire calciumveranderingen in olfactorische neuronen en onthult ruimtelijke en temporele patronen van neurale activiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen Silke Sachse en Beate Eisermann in de ontwikkeling van deze methodiek, Pablo Traversa voor het tekenen van het montageblok blauwdrukken en Daniela Pelz voor het gebruik van het schema in figuur 1. We zijn dankbaar voor Silke Sachse, Pavan Ramdya en Raphael Rytz voor commentaar op het manuscript. R. Bell wordt ondersteund door een Boehringer Ingelheim Stichting PhD Fellowship. Onderzoek in het laboratorium van R. Benton&#39;s wordt gefinancierd door een European Research Council Starting Independent Researcher Grant en de Zwitserse National Science Foundation.

1. Montageblok Vergadering <ol><li> De plexiglas montageblok (Figuur 1A) moeten worden gemaakt om de exacte specificaties van de blauwdruk (beschikbaar op <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> ) Voor eenvoudige montage en dissectie van de vlieg mogelijk te maken. Draad door de schroeven aan de achterkant, maar ze niet verder gaan dan de voorkant van het blok, hun standpunt zal worden aangepast tijdens de voorbereiding van het dier (zie 2.7). </li><li> Met behulp van een precisie-boren, maak een deuk in de bovenste rand van de ronde kamer voor de vlieg, het graven onder de oppervlakte om ruimte te maken voor het lichaam van de vlieg, het verminderen van de dikte van het blok op dit punt. </li><li> Snij een koperen raster met een scalpel loodrecht dicht bij de bodem van de uitsparing om een ​​"kraag" te maken. Zorg dat de twee resulterende kleppen niveau zijn, omdat dit het inbrengen van de vlieg te helpen. </li><li> Met een tandenstoker, een kleine druppel superlijm op de DIN-blok boven de ronde kamer voor de vlieg. Plaats het koper raster op de lijm en positie, zodat de spleet in het midden van het blok (figuur 1A). Druk zachtjes en verwijder de overtollige lijm. Met een pincet, voeg kleine druppeltjes lijm onder de flappen aan elke kant en vouw het net over de voorkant van het blok, zodat de sleuf wordt recht naar beneden wijst. Zorg dat de bovenkant van het net is ter hoogte van de blok. Laat goed drogen. </li><li> Monteer een draad houder: snij een plastic dekglaasje in de helft en verwijderen van een centraal onderdeel van een "U" vorm te maken. Gebruik bijenwas te lijmen een stuk draad over de bovenkant van de "U", maak niet de draad te strak. </li><li> Construeer de antennaal schild: maak een gat in een plastic dekglaasje met een papieren perforeren. Snij de randen van het dekglaasje tot 0,5 x 0,7 cm. Lijm de doorboorde plastic dekglaasje aan plakband en plaats dan een druppel ethanol op de band worden blootgesteld door het gat naarverwijderen van de lijm. </li></ol> 2. Toebereiding van dieren <ol><li> Vliegen van de juiste genotype - dat wil zeggen met de gewenste combinatie van "bestuurder" en de activiteit-reporter transgenen - zou moeten zijn 1-3 weken oud, de nagelriem van de jongere vliegen is te zacht en moeilijk te snijden. Bij experimenten directe vergelijking van verschillende genotypen vereisen en om transgene expressie overeenkomen moet vliegen worden dezelfde leeftijd aan leeftijd gerelateerde fysiologische verschillen voorkomen. Als mannen en vrouwen niet belangrijk is, geven we de voorkeur aan vrouwelijke vliegen te gebruiken omdat ze grotere hoofden en zijn gemakkelijker te manipuleren. </li><li> Verdoof vliegen door afkoeling op ijs. </li><li> Introduceer een vlieg in de montage blok. Houd de vlieg de vleugel gezamenlijke en schuif, rug-oppervlak eerst langs de spleet van het koper rooster zodat het wordt opgehangen aan de hals (Figuur 1B-C). Indien nodig, draai het totdat deze naar beneden te kijken. </li><li> Plaats een fijne cactus rug voor de fly's hoofd om te voorkomen dat ontsnappen (Figuur 1B-C). Zet de cactus rug voor de proboscis om te voorkomen dat bewegen. Zet de cactus wervelkolom om het blok met behulp van bijenwas. Zorg ervoor dat de bovenkant van het hoofd is gelijk met de bovenkant van het blok. </li><li> Zet de kop van de vlieg naar het blok met een druppeltje colofonium (opgelost in ethanol). Plaats het blok in een bevochtigde doos kan de hars te harden gedurende ongeveer een uur. </li><li> Met behulp van een tang, trek de antennaal plaat en de draad laten vallen op de houder (wax-kant naar buiten, zie 1.5) in de cuticulair plooi tussen de antenne en het hoofd. Bevestig de houder aan de voorkant van het blok met bijenwas. </li><li> Met behulp van de schroeven is ingebouwd in het blok, voorzichtig duw de kabel houder om wat ruimte tussen de antennaal plaat en het hoofd te creëren. </li><li> Plaats de antennaal schild (zie 1.6) over de bovenkant van het hoofd van de vlieg met de opening centraal geplaatst. Vast met bijenwas op de bovenzijde van het montageblok. </li><li> Met behulp van een mes-splitter, cuta klein gaatje in de tape op het schild het blootstellen van de cuticula van het hoofd van de vlieg achter de antenne. Het gat moet niet verder gaan dan de ogen aan de voorbereiding te voorkomen lekken. </li><li> Dicht het gat tussen de band en de cuticula met twee-componenten-silicium. Overtollige silicium van de kruin van de vlieg. </li><li> Breng een druppel Drosophila Ringer zoutoplossing (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 36 mM saccharose, 5 mM HEPES, pH 7,3) op de kop. Zorg ervoor dat er geen lekken zijn: de antennes moeten blijven volledig droog is. Met behulp van een saffier mes, sneed een gat in de cuticula. Ten eerste, licht score langs de cuticulair vouw direct achter de antenne, en snijd langs de ogen en over de ocelli op de rug. Tot slot, vouw het stukje over de cuticula scoorde rand en snijd van de onderkant om te voorkomen dat het doorsnijden van het antennaal zenuwen. </li><li> Verwijder voorzichtig klieren en de luchtpijp met fijne pincet. Spoel herhaaldelijk met Drosophila </li></ol> 3. Geur Stimulus Levering <ol><li> Geur spuiten: plaats een cellulose pad in een 2 ml plastic spuit met schone pincet en pipet op het (met behulp van filter tips) 20 ul van geur, verdund zoals gewenst in een geschikt oplosmiddel, met behulp van de pipet tip om de pad diep te duwen in het vat . Plug-and-dop van de spuit totdat vereist. Frisse geur verdunningen moeten worden voorbereid ten minste om de 3 maanden (of vaker voor zeer vluchtige en / of vaak gebruikte geuren), en nieuwe remblokjes dienen voorbereid te zijn geur spuiten vlak voor elke opname sessie. Gebruik geen geur pads voor meer dan drie stimulaties, omdat de geur concentratie zou kunnen vervallen. </li><li> Op maat gemaakte olfactometer (figuur 2): een primaire luchtstroom (1 l / min) wordt geleid door middel van Teflon slang (0,4 mm binnendiameter); 27 cm stroomopwaarts vanaf het einde van deze buis, een secundaire luchtstroom (1 l / min ) toegevoegd. Beide luchtstromen worden gegenereerd door membraan pompen, enhet debiet wordt geregeld door twee onafhankelijke flowmeters. De lucht stroomt kan worden bevochtigd door het passeren door het water in de gas-zuigflessen, maar er moet voor worden genomen om over-bevochtiging te vermijden (dat wil zeggen meer dan ~ 60%). De secundaire luchtstroom wordt geleid door hetzij een geur spuit of een lege spuit: spuiten zijn verbonden met de luchtstroom via een injectienaald (1,2 mm buitendiameter) doorboren zuiger. Een drie-weg magneetventiel bediend via een klep controller (bijvoorbeeld Harvard Apparatus VC6) wordt gebruikt om te schakelen tussen de schone lucht en geur stimulus. </li></ol> 4. In vivo Imaging <ol><li> We beschrijven hier beeldvorming met behulp van een rechtop fluorescentiemicroscoop (bijv. rechtop vaste fase Zeiss Axio Examiner D1) uitgerust met een 20x water doelstelling (bv. Zeiss W "Plan-Apochromat" 20x / 1,0 M27 DIC) (figuur 2). Voor de beeldvorming met G-CAMP (excitatie / emissie: 488/509 nm), gebruik dan een filter blok met de volgende eigenschappen: 450-490 nm excitatie-filter, Dichroïsche spiegel (T495LP) en 500-550 nm emissie-filter (Chroma ET). Plaats de montage blok met de vlieg onder de microscoop. Plaats de uitgang van de olfactometer ongeveer 0,5 cm voor antennes van de vlieg. </li><li> Laat het doel totdat deze de Ringer-oplossing op het hoofd van de vlieg. Kijkend door de kijker onder bright-field verlichting, de positie van de voorbereiding, zodat het gat in het hoofd capsule in het midden en de grenzen zijn in focus. Schakel over naar de tl-licht en de scherpstelling totdat je kunt zien dat de gelabelde neuronen (blijkt uit basale groene fluorescentie van G-Camp). </li><li> Fijn focus op de glomeruli van belang door de overname van beelden met een Charge-coupled device (CCD) camera (bijv. CoolSNAP-HQ2 Digitale Camera System) geplaatst op de microscoop met behulp van passende acquisitie software (bijv. Metafluor) (Figuur 3A). Sluit de membraan in de verlichting lichtpad excitatielicht beperken tot de afgebeelde gebied. </li><li> Voor het opnemen van geur-opgeroepenactiviteit, stellen de aankoop rente tot 4 Hz en de belichting aanpassen tijd om fluorescentie waarden te verkrijgen binnen het dynamische bereik van de CCD-camera, maar niet lager dan 1000 (willekeurige eenheden), met ten minste 12-bit dynamische resolutie. De belichtingstijd mag niet meer dan 100 ms, indien mogelijk, tot en met G-CAMP fotobleken te verminderen. Als de ruimtelijke resolutie van uw camera kunt, kunt u de verhoging van de binning (aantal putten op de chip die zal worden weggegooid in een digitale pixel) om de belichting te verminderen. Wij verkregen beelden van 350x225 pixels (met binning 2x2), overeenkomend met 210x135 pm bij de bereiding. Deze instellingen zijn optimaal om glomerulaire geur-geïnduceerde reacties van G-CAMP vast te leggen met een goede ruimtelijke en temporele resolutie bij een beperking van verslaggever bleken. </li><li> Stel de meting parameters. We nemen meestal gedurende 10 seconden (dwz 40 frames), met geur stimulatie gewoonlijk vanaf 4 seconden na het begin van de periode van verwerving (frame 15) en een looptijd van een seconde (uot kader 19). Een vlieg voorbereiding kan normaal worden getest met maximaal 25-30 verschillende geur stimuli, vaak beperkt door een onomkeerbare achteruitgang in de fluorescerende signaal van de verslaggever door fotobleken. De inter-stimulus interval is afhankelijk van de sterkte van de waargenomen respons en de snelheid van fotobleken. De juiste lengte van de inter-stimulus interval voor sensorische adaptatie te vermijden kan bij benadering worden bepaald door herhaalde presentatie van een positieve controle geur (indien bekend) in een proefopstelling. Het opnemen van deze geur elke ~ 10 stimuli in een bepaalde serie kan toestaan ​​verificatie van de duurzame levensvatbaarheid en consistente respons van het preparaat. </li></ol> 5. Gegevensverwerking en-analyse De gegevens worden verwerkt met behulp van ImageJ (met Mac biofotonica plug-in, <a href="http://www.macbiophotonics.ca/">www.macbiophotonics.ca</a> ) en op maat geschreven programma's in Matlab en R als volgt: <ol><li> Corrigeer voor het monster bewegingsartefacten:aanpassing van alle beelden die overeenkomt met een dier preparaat (bijvoorbeeld 30 metingen van 40 frames per stuk) met de "starre lichaam"-modus van STACKREG / TurboReg ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg">bigwww.epfl.ch / thevenaz / STACKREG</a> ) in ImageJ. Deze stap vereist verschuivingen verwijderen van de positie van de gelabelde neuronen ten opzichte van het gestel verkrijgen in en tussen de metingen. Het is echter alleen mogelijk verwijderen verschuivingen in het xy-vlak. De gegevens moeten worden weggegooid als er sterke veranderingen in focus optreden. </li><li> Segment de stapel in afzonderlijke 10-seconden (40-frame) metingen. </li><li> Juist voor het bleken van artefacten: blootstelling aan TL-licht zorgt ervoor dat fluorescentie te vervallen tijdens een enkele meting 10. In sommige gevallen is het belangrijk om deze verval corrigeren voordat het analyseren van de data. Per meting berekenen achtergrondbeeld. Dit moet het gemiddelde van een aantal frames voor stimulus onset (bijv. frames 6-14) zijn. Verdeel elk frame door deze backgronde frame om de relatieve fluorescentie wijzigingen. Bereken de gemiddelde relatieve fluorescentie-waarde voor elk frame door het gemiddelde te alle pixels op het gebied gelabeld door G-kamp. Plaats een dubbele exponentiële de gemiddelde fluorescentie curve geeft sterker hechten aan de frames voor de stimulus en geen gewicht naar de tijd van de geur respons (20 frames na stimulusaanvang in ons geval). Trek de gemonteerde curve van de relatieve fluorescentie curve van elke pixel. Vermenigvuldig het gecorrigeerde frames door de achtergrond frame opnieuw verkrijgen van ruwe data. Dit soort correctie kan leiden tot een verandering in de reactie dynamiek als het signaal niet de basislijn tegen eind van de meting (bijvoorbeeld als remmende of sterk exciterende reacties worden opgeroepen) (Figuur 4). Hoewel correctie bleken artefacten is nuttig in veel gevallen zouden interpretatie van tijd parameters worden voorzichtig als bleekmiddel wordt gecorrigeerd. </li><li> Bereken de relatieve verandering in fluorescentie (&amp; DeLTA, F / V) voor elk frame van elke meting als (F i-F 0) / F 0 * 100, waar F 0 de achtergrond frame (5.3) en F i de fluorescentie waarde voor de i frame de meting. </li><li> Bereken de gemiddelde AF / F binnen een cirkelvormig gebied van belang in een glomerulus (figuur 3B) met een diameter van 10 pixels activiteit sporen (figuur 5A) te verkrijgen. Indien gewenst, transformeren deze sporen in heatmaps met ImageJ (figuur 5A). </li><li> Bereken de piek amplitude van de reactie van het aftrekken van de gemiddelde AF / F van vier frames voor stimulatie van de gemiddelde AF / F van vier frames tijdens het hoogtepunt van de respons. Dezelfde procedure wordt zowel gebruikt om ruimtelijke patronen te reageren (zie figuur 3B) illustreren en de respons amplitude te kwantificeren in specifieke regio's van belang in de hele vliegen (zie figuur 5B). De piek reactie kan ook worden gekwantificeerd door integratie het gebied onder de curve in de tijd van de stimulus of averaging van de frames in het maximum van de reactie. </li></ol> 6. Representatieve resultaten We gebruikten de protocollen boven op te nemen en te analyseren propionzuur-reacties van de consument van vliegen te drukken G-CaMP1.6 28 onder de controle van de promotor voor de olfactorische co-receptor IR8a, die actief is in verschillende populaties van OSNs 29,30 ( figuren 3-5). Stimulatie met 1% propionzuur lokt stijging van de G-CAMP fluorescentie - met vermelding van toename van de intracellulaire calcium - in OSNs innerveren twee glomeruli, DC4 en DP1l (Figuur 3B). We illustreren verschillende manieren om die gegevens uit meerdere vliegen in Figuur 5: lijn sporen van activiteiten, heatmaps en een bar plot van piek reacties. Propionzuur-reacties van de consument hebben verschillende piek amplitudes en temporele dynamiek in DC4 en DP1l. En hoewel de reacties zijn over het algemeen robuust, kan variabiliteit tussen individuele dieren ook worden waargenomen in zowel de glomeruli (zie hijatmaps in figuur 5A). Kwantificering van de piek reacties (figuur 5B) laat een eenvoudige statistische vergelijking tussen glomeruli en verschillende geurstoffen in dieren. Echter, geur-opgeroepen calcium reacties hebben niet-uniforme temporele dynamiek, en het kwantificeren van de omvang met een enkele waarde zal deze complexiteit te negeren. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Schema van het montageblok (A) voor en (B) na invoering van de vlieg en (C) een bovenaanzicht van dichtbij (naar 31). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Schematische voorstelling van de experimentele set-up. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. (A) Bovenaanzicht van de vlieg preparaat na stap 2.8 (links) en ruwe fluorescentie beeld van de antennal lobben voorzien van G-CaMP1.6 (Genotype: IR8a promotor: GAL4; UAS: G-CaMP1.6). DC4 en DP1l glomeruli kan worden onderscheiden door hun morfologie, grootte en positie en zijn in het rood en blauw, resp. (B) Gekleurde beeld van de reactie propionzuur (1% v / v). Het beeld overeen met de AF / F van de piek van de reactie berekend zoals beschreven in stap 5.6 (zie Figuur 5A). De colorscale aan de linkerkant geeft de% AF / F-waarde. De zwarte cirkels geven de positie en grootte van het gebied van belang gebruikt om de te kwantificeren (zie figuur 5). <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Corrigeren bleken van de fluorescerende reporter signaal. Voorbeelden van het effect van bleekmiddel correctie beschreven in stap 5.3. Voorbeeld van gegevens op het linker paneel kan worden gecorrigeerd zonder grote veranderingen in de vorm van de respons. Voorbeeld van gegevens op het rechterdeel wordt ernstige gevolgen hebben voored door bleekmiddel correctie, waarschijnlijk omdat het signaal wegvalt en wordt onderhouden onder de uitgangswaarden na de geur stimulus beëindiging. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 5 (A) Top. Tijd dynamiek van calcium reacties van glomeruli DC4 (links) en DP1l (rechts) propionzuur (1% v / v). De zwarte sporen tonen de mediaan van de gemiddelde AF / F in de regio van belang (zie figuur 3B) over acht dieren. Het grijze oppervlak geeft het verschil tussen de eerste en derde kwartielen van de verdeling. Presentatie van de mediaan en kwartiel waarden geeft meer informatie over de variabiliteit en de verdeling van de waargenomen respons dan de gemiddelde en de standaard fout. De groene en magenta vakken geven de gemiddelde frame naar de top reacties figuur 3B en gekwantificeerd in figuur 5B berekenen. Onder: de heatmaps tonen de respons gegevens voor alle individuele dieren in aparte rijen, met AF / F-waarden represented door de colorscale (uiterst rechts). De horizontale zwarte balken geven de tijd en duur van de stimulus. (B) De mediane piek reacties op propionzuur over acht dieren voor DC4 en DP1l glomeruli. De fout balken geven het bereik tussen de eerste en derde kwartiel van de verdeling.

<ol><li>Galizia, C. G., Rossler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+olfactory+systems+in+insects%3A+anatomy+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Parallel olfactory systems in insects: anatomy and function.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 399-420 (2010).</li>
<li>Vosshall, L. B., Stocker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Architecture+of+Smell+and+Taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular Architecture of Smell and Taste in Drosophila.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 505-533 (2007).</li>
<li>Wilson, R. I., Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+events+in+olfactory+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early events in olfactory processing.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 163-201 (2006).</li>
<li>Masse, N. Y., Turner, G. C., Jefferis, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+information+processing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Olfactory information processing in Drosophila.</a> Curr. Biol. 19, 700-713 (2009).</li>
<li>Hansson, B. S., Anton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+morphology+of+the+antennal+lobe%3A+new+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Function and morphology of the antennal lobe: new developments.</a> Annu. Rev. Entomol. 45, 203-231 (2000).</li>
<li>Galizia, C. G., Joerges, J., Kuttner, A., Faber, T., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-in-vivo+preparation+for+optical+recording+of+the+insect+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A semi-in-vivo preparation for optical recording of the insect brain.</a> J. Neurosci. Methods. 76, 61-69 (1997).</li>
<li>Galizia, C. G., Menzel, R., Holldobler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+odor-evoked+glomerular+activity+patterns+in+the+antennal+lobes+of+the+ant+Camponotus+rufipes%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of odor-evoked glomerular activity patterns in the antennal lobes of the ant Camponotus rufipes.</a> Naturwissenschaften. 86, 533-537 (1999).</li>
<li>Okada, K., Kanzaki, R., Kawachi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+voltage-sensitive+dye+imaging+of+an+in+vivo+insect+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">High-speed voltage-sensitive dye imaging of an in vivo insect brain.</a> Neurosci. Lett. 209, 197-200 (1996).</li>
<li>Carlsson, M. A., Knusel, P., Verschure, P. F., Hansson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+Ca2%2B+dynamics+of+moth+olfactory+projection+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal Ca2+ dynamics of moth olfactory projection neurones.</a> The European journal of neuroscience. 22, 647-657 (2005).</li>
<li>Galizia, C. G., Vetter, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGalizia%2C+CG+%22Methods+in+Insect+Sensory+Neuroscience+%28Frontiers+in+Neuroscience%29%22">Methods in Insect Sensory Neuroscience (Frontiers in Neuroscience)</a>. Christensen, T. A. 13, CRC Press. 349-392 (2005).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li>
<li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
<li>Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+quantitative+Ca2%2B+measurements+using+improved+cameleons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 2135-2140 (1999).</li>
<li>Martin, J. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brulet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+Ca+signalling+in+the+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of Ca signalling in the brain of Drosophila.</a> PLoS One. 2, 275-275 (2007).</li>
<li>Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+Ca2%2B+stores+contribute+to+odor-induced+responses+in+Drosophila+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons.</a> The Journal of Experimental Biology. 213, 4163-4173 (2010).</li>
<li>Yuste, R., Miller, R. B., Holthoff, K., Zhang, S., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapto-pHluorins%3A+chimeras+between+pH-sensitive+mutants+of+green+fluorescent+protein+and+synaptic+vesicle+membrane+proteins+as+reporters+of+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Synapto-pHluorins: chimeras between pH-sensitive mutants of green fluorescent protein and synaptic vesicle membrane proteins as reporters of neurotransmitter release.</a> Methods Enzymol. 327, 522-546 (2000).</li>
<li>Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+specificity+in+Drosophila+pheromone+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and specificity in Drosophila pheromone perception.</a> Trends Neurosci. 30, 512-519 (2007).</li>
<li>Elliott, D. A., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GAL4+system+%3A+a+versatile+system+for+the+expression+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The GAL4 system : a versatile system for the expression of genes.</a> Methods Mol. Biol. 420, 79-95 (2008).</li>
<li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).</li>
<li>Yagi, R., Mayer, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+LexA+transactivators+and+their+use+in+combination+with+the+Drosophila+Gal4+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Refined LexA transactivators and their use in combination with the Drosophila Gal4 system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16166-16171 (2010).</li>
<li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Q+System%3A+A+Repressible+Binary+System+for+Transgene+Expression%2C+Lineage+Tracing%2C+and+Mosaic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Q System: A Repressible Binary System for Transgene Expression, Lineage Tracing, and Mosaic Analysis.</a> Cell. 141, 536-548 (2010).</li>
<li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112, 271-282 (2003).</li>
<li>Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+expressed+cameleon+in+Drosophila+melanogaster+is+used+to+visualize+olfactory+information+in+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically expressed cameleon in Drosophila melanogaster is used to visualize olfactory information in projection neurons.</a> Curr. Biol. 12, 1877-1884 (2002).</li>
<li>Ng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+olfactory+information+between+three+populations+of+neurons+in+the+antennal+lobe+of+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly.</a> Neuron. 36, 463-474 (2002).</li>
<li>Sachse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+plasticity+in+an+olfactory+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit.</a> Neuron. 56, 838-850 (2007).</li>
<li>Pelz, D., Roeske, T., Syed, Z., de Bruyne, M., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+receptive+range+of+an+olfactory+receptor+in+vivo+%28Drosophila+melanogaster+Or22a%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The molecular receptive range of an olfactory receptor in vivo (Drosophila melanogaster Or22a).</a> J. Neurobiol. 66, 1544-1563 (2006).</li>
<li>Silbering, A. F., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+odor+mixtures+in+the+Drosophila+antennal+lobe+reveals+both+global+inhibition+and+glomerulus-specific+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Processing of odor mixtures in the Drosophila antennal lobe reveals both global inhibition and glomerulus-specific interactions.</a> J. Neurosci. 27, 11966-11977 (2007).</li>
<li>Reiff, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li>
<li>Abuin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+olfactory+ionotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of olfactory ionotropic glutamate receptors.</a> Neuron. 69, 44-60 (2011).</li>
<li>Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+ionotropic+glutamate+receptors+as+chemosensory+receptors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila.</a> Cell. 136, 149-162 (2009).</li>
<li>Pelz, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Functional+characterization+of+Drosophila+melanogaster+Olfactory+Receptor+Neurons%22">Functional characterization of Drosophila melanogaster Olfactory Receptor Neurons</a>. , Freien Universitat Berlin. (2005).</li>
<li>Ai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid+sensing+by+the+Drosophila+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Acid sensing by the Drosophila olfactory system.</a> Nature. 468, 691-695 (2010).</li>
<li>Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Brain+Imaging%3A+Fluorescence+or+Bioluminescence%2C+Which+to+Choose%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">In Vivo Brain Imaging: Fluorescence or Bioluminescence, Which to Choose?</a> Journal of Neurogenetics. , 1-23 (2008).</li>
<li>Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+a+genetically+encoded+optical+sensor+of+neural+activity+using+electrophysiology+in+intact+adult+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies.</a> Front. Neural Circuits. 1, 3-3 (2007).</li>
<li>Pfeiffer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9715-9720 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De bereiding en analysemethoden hier beschreven worden gebruikt om de geur-reacties van analyseren een populatie van cellen in de antennaal nok (OSNs, LN en PN) die een corresponderende bestuurder transgen is. Terwijl beschrijven we de toepassing ervan met behulp van een fluorescentie microscoop, kunnen optische beeldvorming van deze voorbereiding ook worden uitgevoerd met behulp van confocale of twee-foton microscopie 22,32. Inderdaad laatstgenoemde instrumenten verlichten lichtverstrooiende probleem breed microscopie, waardoor de resolutie van beelden te verminderen, vooral wanneer grote aantallen neuronen drukken de reporter. Deze voorbereiding meestal opnames van geur-reacties van de consument toelaat voor minstens een half uur, maar deze keer kan aanzienlijk langer of korter zijn, afhankelijk van het aantal en de lengte van de geregistreerde metingen, de belichtingstijd voor elk frame en de inter-stimulus interval. Bovendien kunnen twee foton excitatie verminderen fotobleken van de fluorescerende reporter alsmede cellulaire fototoxiciteit, de meting mogelijk gedurende langere perioden 22,32. Ongeacht de keuze van de microscoop, de verplaatsing van de vlieg hersenen in het hoofd capsule is het meest voorkomende probleem bij beeldvorming in intacte dieren. Terwijl de beweging correctie kan corrigeren kleine problemen (stap 5.1), is het meestal beter alleen om op te nemen van zeer stabiele preparaten. Strategieën om bewegingsartefacten te verminderen zijn onder meer: ​​(i) de juiste beperken van de proboscis van de vlieg met de cactus wervelkolom, (ii) het immobiliseren van de vlieg de benen door de vaststelling van hen om het podium met eicosaan (voor 2,6 stap) (eicosaan kan worden gesmolten bij ~ 37 ° C; gebruik maken van een zilveren draad uit te breiden en te verfijnen de punt van de soldeerbout voor dit doel), (iii) inkeping de slokdarm (zichtbaar tussen de antennaal zenuwen) met fijne pincet. Naast G-CaMP1.6 gebruikt, een aantal geoptimaliseerde versies van G-cAMP en andere calcium indicatoren zijn,die verschillen in hun signaal-ruisverhouding, baseline fluorescentie en temporele dynamiek 12,28,33. De precieze keuze van de sensor moet rekening houden met alle van deze eigenschappen, het type van neuronen te analyseren en de biologische vraag worden aangepakt. De huidige sensoren melden calcium veranderingen die vrij goed correleren met actiepotentialen 12,34, en de verdere verbetering, in combinatie met een toenemend aantal specifieke genetische bestuurder lijnen 35 zal blijven om het potentieel van optische beeldvorming van neurale activiteit in het intacte vliegen te verbeteren.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Leverancier </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Cactus wervelkolom </td><td> Tuincentrum </td><td></td><td> ~ 7mm lange dunne, niet te flexibel </td></tr><tr><td> Hars </td><td> String instrument winkel </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Twee componenten silicium </td><td> WPI </td><td> KWIK-SIL </td><td></td></tr><tr><td> Op maat gemaakte plexiglas montageblok </td><td> Blauwdrukken die beschikbaar zijn vanaf <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Koper roosters </td><td> Athene Grids </td><td> G220-5 </td><td> Meestal gebruikt voor elektronenmicroscopie monsters. </td></tr><tr><td> Schroeven </td><td> Bouwmarkt </td&gt; <td></td><td> 2 mm diameter </td></tr><tr><td> Kunststof dekglaasjes </td><td> Plano-em </td><td> L4193 </td><td> 22 X 22 mm </td></tr><tr><td> Soldeerbout tips </td><td> Conrad </td><td> 830283-62 </td><td></td></tr><tr><td> Gereglementeerde voeding </td><td> Conrad </td><td> 511407-62 </td><td></td></tr><tr><td> Dunne draad </td><td> Isabellenhütte </td><td> Isa-ohm </td><td> 0,013 mm </td></tr><tr><td> Eicosaan </td><td> Sigma </td><td> 21,927-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microscoop </td><td> Zeiss </td><td> Axioexaminer D1 </td><td></td></tr><tr><td> CCD camera </td><td> Visitron </td><td> CoolSNAP HQ </td><td></td></tr><tr><td> Metafluor </td><td> Visitron </td><td></td><td> Acquisitie software </td></tr><tr><td> Monochromator </td><td> Visitron </td><td> Visichrome </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Breekbare bladen </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10050-00 </td><td></td></tr><tr><td> Houder voor mes </td><td> WPI </td><td> 14134 </td><td></td></tr><tr><td> Sapphire mes </td><td> WPI </td><td> 500314 </td><td> Dubbel gezoomd mes 1mm </td></tr><tr><td> Membraan gas pompen </td><td> KNF Neuberger AG </td><td> NMP 830 KVE </td><td></td></tr><tr><td> Sapphire meshouder </td><td> WPI </td><td> 500317 </td><td></td></tr><tr><td> Drie weg klep </td><td> Lee Company </td><td> LFAA1200118H </td><td> Configuratie E </td></tr><tr><td> Rotameter 500 ml / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 112-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Rotameter 5 L / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 102-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Bijenwas </td><td> Siladent Technik </td><td> 209212 </td><td>; </td></tr><tr><td> Cellulose pad </td><td> Kettenbach Medische </td><td> 31003 </td><td></td></tr><tr><td> Pincet </td><td> Plano-em </td><td> T5130 </td><td> Dumont biologie # 5 </td></tr><tr><td> Spuiten </td><td> BD </td><td> 300928 </td><td> 2ml, Discardit II, 2pieces </td></tr><tr><td> Naalden </td><td> Braun Sterican </td><td> 4665120 </td><td> 1,2 mm OD </td></tr></tbody></table>

calcium imaging van geur-reacties van de consument in de drosophila antennaal lobe

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

De antennaal kwab is het primaire olfactorische centrum in de hersenen insecten en vertegenwoordigt de anatomische en functionele equivalent van de gewervelde bulbus olfactorius 1-5. Olfactorische informatie in de buitenwereld wordt doorgegeven aan de antennaal lob van olfactorische sensorische neuronen (OSNs), die tot verschillende regio&#39;s van neuropil genoemd glomeruli te scheiden op basis van de specifieke olfactorische receptor ze uit te drukken. Hier kunt OSN axonen synaps met zowel lokale interneuronen (LNS), waarvan de processen innerveren veel verschillende glomeruli, en projectie neuronen (PNS), die olfactorische informatie over te brengen naar hogere olfactorische gebieden van de hersenen. Optische beeldvorming van de activiteit van OSNs, LNS en PN in de antennaal kwab - van oudsher gebruik van synthetische calcium-indicatoren (bijvoorbeeld calcium groen, Fura-2) of voltage-sensitieve kleurstoffen (bijv. RH414) - is al lang een belangrijke techniek om te begrijpen hoe olfactorische stimuli worden voorgesteld als ruimtelijke en temporele patronenvan de glomerulaire activiteit in vele soorten insecten 6-10. Ontwikkeling van genetisch gecodeerde neurale activiteit reporters, zoals fluorescerende calcium indicatoren G-CAMP 11,12 en Cameleon 13, bioluminescerende calcium indicator GFP-aequorine 14,15 of een reporter van synaptische transmissie is synapto-pHluorin 16 gemaakte olfactorisch systeem van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, in het bijzonder toegankelijk voor neurofysiologische beeldvorming, in aanvulling op zijn uitvoerig beschreven-moleculaire, elektrofysiologische en neuroanatomische eigenschappen 2,4,17. Deze reporters kunnen selectief worden uitgedrukt via binaire transcriptionele controle systemen (bijvoorbeeld GAL4/UAS 18, LexA / LexAop 19,20, Q-systeem 21) in gedefinieerde populaties van neuronen in de olfactorische circuits te ontleden met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie hoe geur-opgeroepen neurale activiteit is vertegenwoordigd, gemoduleerd en getransformeerd 22-24 &lt;/ Sup&gt;. Hier beschrijven we de voorbereiding en analyse methoden om geur-reacties van de consument te meten in het Drosophila antennaal kwab met G-CAMP 25-27. Het dier preparaat minimaal invasieve en kan worden aangepast aan beeldvorming met breed gebied fluorescentie confocale en twee foton microscopen.

We beschrijven een gevestigde techniek om te meten en geur-opgeroepen calcium antwoorden te analyseren in de antennaal kwab van het leven<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Calcium Imaging van Geur-reacties van de consument in de Drosophila Antennaal Lobe

De antennallobus is het primaire olfactorische centrum in het insectenbrein en vormt het anatomische en functionele equivalent van de olfactorische bol bij gewervelden ...

Het algemene doel van deze procedure is het meten van de fysiologische activiteit van reukneuronen in de drosophila en de antennelobbus door middel van optische beeldvorming van intracellulaire calciumveranderingen. Dit wordt bereikt door eerst de draadhouder van het montageblok en het antennaschild te assembleren. Vervolgens wordt een vlieg die de fluorescente calciumsensor GCaMP tot expressie brengt, op het blok gemonteerd en gefixeerd.Zodra de vlieg is gefixeerd, wordt het cuticulum op de bovenkant van de kop van de vlieg weggesneden om de antennelobben bloot te leggen. De laatste stap van de procedure is om de vlieg onder de microscoop te plaatsen en deze te stimuleren met een geur. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die geur-geïnduceerde activiteitspatronen in de DLA antennelobben laten zien via geregistreerde veranderingen in de relatieve fluorescentie van de calciumsensor G camp.Deze methode kan helpen onthullen hoe geuren worden gerepresenteerd als ruimtelijke en temporele patronen van neurale activiteit op verschillende niveaus van het olfactorische circuit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals elektrofysiologie, is dat we de activiteit kunnen registreren van genetisch geïdentificeerde neuronen die niet toegankelijk zijn voor registratie-elektroden. Zo kan deze methode inzicht bieden in de neurale verwerking van geuren.Het kan ook worden toegepast op andere regio's van het joof-brein, zoals de auditieve en gassystemen. Rijg eerst de schroeven door de achterkant van het plexiglas montageblok, zodanig dat ze niet voorbij de voorkant steken. Gebruik een precisieboor om een inkeping te maken in de bovenrand van de cirkelvormige kamer voor de vlieg door onder het oppervlak te boren om de dikte van het blok te verminderen.Snijd onder een dissectiemicroscoop met een scalpel een koperen grid loodrecht en vlakbij de onderkant van de sleuf om een kraag te creëren waarmee de vlieg kan worden vastgehouden. Zorg ervoor dat de twee resulterende flappen gelijk liggen, omdat dit de invoering van de vlieg vergemakkelijkt. Breng met een tandenstoker een kleine druppel secondelijm aan op het montageblok boven de cirkelvormige kamer.Plaats voor de vlieg het koperen rooster op de lijm en positioneer dit zodanig dat de sleuf in het midden van het blokje staat. Druk het rooster voorzichtig aan en verwijder eventuele overtollige lijm met een pincet. Breng kleine druppels lijm aan onder de flappen aan weerszijden en vouw het rooster over de voorkant van het blokje, zodat de sleuf recht naar beneden wijst.Zorg ervoor dat de bovenkant van het rooster gelijk ligt met het blok en laat het volledig drogen. Om een draadhouder te maken, snijdt u een plastic dekglas doormidden en verwijdert u een centraal stuk om een U-vorm te creëren. Gebruik bijenwas om een stuk draad over de bovenkant van de U te lijmen, zodat de draad niet te strak staat.Maak een antennaschild door met een perforator een gat in een plastic dekglas te maken. Trim de randen van het dekglas tot 0,5 bij 0,7 centimeter. Plak het geperforeerde plastic dekglas op plakband en breng vervolgens een druppel ethanol aan op het plakband dat door het gat zichtbaar is.Om de kleefstof te verwijderen, worden één tot drie weken oude vliegen van het juiste genotype geanestheseerd door ze op ijs te koelen. Pak onder de dissectiescoop een vlieg bij het vleugelgewricht vast en schuif deze met de dorsale zijde eerst langs het koperen rooster, zodat de vlieg aan de nek blijft hangen. Draai de vlieg indien nodig totdat deze naar beneden kijkt.Plaats een fijne cactusdoorn voor de kop van de vlieg om te voorkomen dat deze ontsnapt en positioneer de doorn voor de proboscis om beweging te voorkomen. Bevestig de cactusdoorn aan het blokje met bijenwas, waarbij u erop let dat de bovenkant van de kop gelijk ligt met de bovenkant van het blokje. Bevestig de kop van de vlieg aan het blokje met een kleine druppel harsen opgelost in ethanol.Plaats het blok in een bevochtigde box en laat de hars ongeveer een uur uitharden. Trek met een pincet de antenneplaat naar voren en plaats de draadhouder in de cuticulaire plooi tussen de antenne en de kop. Bevestig de houder aan de voorzijde van het blok met extra bijenwas.Duw de draadhouder voorzichtig naar voren met behulp van de schroeven die in het blok zijn ingebouwd om ruimte te creëren tussen de antenneplaat en de kop. Plaats het antenneschild over de kop van een vlieg, waarbij het geheel centraal wordt gepositioneerd. Bevestig het schild met bijenwas aan de bovenkant van het montageblok.Maak met een blade splitter een klein gaatje in de tape op het schild, zodat de cuticula van de vliegenkop achter de antenne wordt blootgesteld. Het gaatje mag niet verder reiken dan de ogen om te voorkomen dat het preparaat gaat lekken. Kit het gaatje tussen de tape en de cuticula dicht met twee componenten siliconen.Verwijder eventuele overtollige siliconen van de bovenkant van de kop van de vlieg. Plaats een druppel drosophila ringer-zoutoplossing op de kop van de vlieg en zorg ervoor dat er geen lekken zijn en dat de antennes volledig droog blijven. Maak met een saffiermesje een lichte inkeping langs de cuticulaire plooi direct achter de antenne.Snijd vervolgens langs de ogen en over de selli aan de achterzijde. Vouw ten slotte het stukje cuticula over de ingesneden rand en snijd vanaf de onderkant. Verwijder de klieren en trachea voorzichtig met een fijne pincet om te voorkomen dat de antennerven worden doorgesneden.Spoel herhaaldelijk met Drosophila ringer-oplossing, waarbij een grote druppel op de kop achterblijft. Plaats met een schone pincet een cellulosepad in een plastic spuit van twee milliliter. Breng met een gefilterde pipetpunt 20 µL van de verdunde geurstof aan.Sluit de spuit af met een dop totdat deze nodig is voor de beeldvorming. Plaats de houder met de vlieg onder de microscoop. Laat het objectief zakken tot het de ringer-oplossing op de kop van de vlieg raakt.Positioneer de preparatie via het oculair onder brightfield-verlichting, zodat het gat in het hoofdkapsel gecentreerd is en de randen scherp zijn. Schakel over naar fluorescent licht en stel de focus in tot de gelabelde neuronen zichtbaar zijn; deze zouden herkenbaar moeten zijn aan de basale groene fluorescentie van GCaMP. Leg beelden vast met een op de microscoop gemonteerde CCD-camera met behulp van geschikte acquisitiesoftware en stel scherp op de glomeruli van belang.Zorg ervoor dat het diafragma in het pad van het verlichtingslicht wordt gesloten om het excitatielicht te beperken tot het afgebeelde gebied. Positioneer de uitlaat van de olfactometer ongeveer 0,5 centimeter voor de antennes van de vliegen. Hier worden de anale lobben getoond in een vlieg die GCaMP 1.6 tot expressie brengt onder controle van een promotor van olfactorische sensorische neuronen die expressie in verschillende glomeruli aanstuurt; stimulatie met 1% propionzuur veroorzaakt een toename van de GAMP-fluorescentie, wat wijst op een toename van intracellulair calcium in olfactorische sensorische neuronen die de glomeruli DC four en DP one L innerveren. De temporele dynamiek van de calciumresponsen van glomeruli DC four en DP one L op propionzuur wordt hier getoond.De zwarte lijnen tonen de mediaan van de gemiddelde delta F over F binnen het gebied van interesse over acht dieren, en het grijze oppervlak geeft het bereik tussen het eerste en derde kwartiel van de distributie aan. De heatmaps hieronder tonen de responsen van de individuele dieren. De groen omrande magenta kaders geven de frames aan die zijn gemiddeld om de piekresponsen van de glomeruli boven de basisfluorescentieniveaus van GCaMP te berekenen en die hier gekwantificeerd worden weergegeven.Correctie voor het bleken van de fluorescerende reporter kan effecten hebben op de respons. De piekgegevens van de monster op het linkerpaneel kunnen worden gecorrigeerd zonder grote veranderingen in de vorm van de respons. De gegevens van het monster op het rechterpaneel worden ernstig beïnvloed door de bleach-correctie, waarschijnlijk omdat het signaal daalt en na beëindiging van de geurstimulatie onder de nullijn blijft. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in ongeveer 30 minuten worden uitgevoerd.Wanneer deze procedure correct wordt uitgevoerd, is het essentieel om de antennes volledig droog te houden, anders kunnen ze geen geuren detecteren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u beelden voorbereidt en geuren analyseert.Wek neuronale activiteit op in de fruitvlieg.

calcium-imaging-odor-evoked-responses-drosophila-antennal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Bijen kunnen worden geconditioneerd in een appetitief olfactorische leren paradigma (PER-conditioning). Het gebruik van geuren als prikkels, hebben we een methode waarin het gedrag wordt vastgelegd, terwijl tegelijkertijd Calcium Imaging wordt gebruikt om de geur oproept activiteit te meten in champignon lichaam...

In vivo Ca 2 + - Beeldvorming van Mushroom Body neuronen tijdens Olfactorische Leren in de Honey Bee

Deze video beschrijft in vivo calcium beeldvorming in Drosophila neuronen met behulp van GCaMP. De aanbevolen protocolclip laat zien hoe u veranderingen in GCaMP-fluorescentie van paddestoellichaamneuronen kunt registreren tijdens een olfactorisch conditioneringsexperiment.

Drosophila In Vivo Calcium imaging: een methode voor functionele beeldvorming van neuronale activiteit

This video demonstrates a method for detecting sensory neuron responses in Drosophila using ligand binding and fluorescence imaging. Ligands bind to neuron receptors, causing calcium influx. The calcium binds to indicator complexes, leading to fluorescence emission, which confirms the neuronal response to the ligand.

Detecting Physiological Responses from Sensory Neurons in Drosophila

This video demonstrates a method for in vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors in flies. It outlines the steps for preparing the flies for microscopy, conducting olfactory conditioning, and visualizing odor-induced calcium influx.

In Vivo Calcium Imaging Using Synaptically Localized Calcium Sensors in Drosophila melanogaster

Source: Ishimoto, H. et. al., Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) This video demonstrates calcium imaging to study Drosophila brain responses to neuropeptides. Neurons expressing a fluorescent calcium indicator reveal intracellular calcium dynamics and functional responses to signaling molecules.

Ex Vivo Calcium Imaging to Study Drosophila Brain Responses to Neuropeptides

De voorpoten en slurf van Drosophila bevatten een rijk repertoire van gustatoire sensorische neuronen. Hier presenteren we een methode met behulp van calciumbeeldvorming om fysiologische reacties van sensorische neuronen in de voorpoot en slurf van levende vliegen te meten na exogeen aanbrengen van een gustatoir feromoon.

Meten van fysiologische reacties<em&gt; Drosophila</em&gt; Sensorische neuronen te Lipid Feromonen met Live Calcium Imaging

Dit artikel beschrijft een aanpasbare ex vivo protocol voor het visualiseren van Ca 2+ tijdens ei activering in Drosophila.

Beeldvorming Calcium in<em&gt; Drosophila</em&gt; Bij Egg Activering

Hier presenteren we een protocol waarmee pre-en/of postsynaptisch calcium kan worden gevisualiseerd in de context van Drosophila leren en geheugen. In vivo calcium beeldvorming met behulp van Synaptisch gelokaliseerde calcium sensoren wordt gecombineerd met een klassieke olfactorische conditionerings paradigma zodanig dat de Synaptische plasticiteit onderliggende dit type associatief leren kan worden bepaald.

In vivo optische calcium beeldvorming van leren-geïnduceerde synaptische plasticiteit in Drosophila melanogaster

Een calciumbeeldvormingsbenadering maakt het mogelijk om smaakgeïnduceerde reacties in de hersenen van wakkere vliegen vast te leggen terwijl een oplossing op het labellum wordt aangebracht. Primaire smaakresponsen in Drosophila melanogaster worden als voorbeeld gebruikt, maar dit protocol kan worden aangepast om stroomafwaartse neuronen of andere soorten te bestuderen.

In vivo Calciumbeeldvorming van smaakgeïnduceerde neurale reacties bij volwassen Drosophila

Een belangrijke barrière voor het bestuderen van cellulaire activiteit tijdens cognitieve processen zoals leren en geheugen is het gebruik van anesthetica voor in vivo beeldvormingsvoorbereiding. Anesthesie schaadt het kortetermijngeheugen en de cognitie in meerdere modellen, waaronder Drosophila. Deze studie presenteert een unieke methode voor het bereiden van volwassen Drosophila voor in vivo beeldvorming zonder verdoving.

In vivo Beeldvorming van neurale activiteit bij onverdoofde Drosophila-volwassen vliegen

We presenteren calciumbeeldvormingsprotocollen voor een Drosophila-larvale olfactorische neuron, met behulp van een topische weefsellijm voor immobilisatie. Deze methode verbetert de stabiliteit en maakt betrouwbare in- en ex-vivo-experimenten mogelijk. Aangepaste R-scripts analyseren calciumsignalen en bieden een efficiënt platform voor gedetailleerd neurofysiologisch onderzoek.

In-vivo en ex-vivo calciumbeeldvorming van een reukcircuitneuron in de larve van de Drosophila melanogaster met een derde instar

Leer calcium imaging van geur-reacties in de antennale lob van Drosophila melanogaster. Deze optische methode meet intracellulaire calciumveranderingen in olfactorische neuronen en onthult ruimtelijke en temporele patronen van neurale activiteit.

Calcium Imaging van Geur-reacties van de consument in de Drosophila Antennaal Lobe

Meer video's verkennen