Name: Studeren Age-afhankelijke genomische instabiliteit met behulp van de S. cerevisiae Chronologische levensduur Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Leer hoe je leeftijdsafhankelijke genomische instabiliteit bestudeert in S. cerevisiae met behulp van chronologische levensduuranalyse en DNA-mutatie-assays. Deze methode onthult mechanismen die veroudering en genoominstabiliteit met elkaar verbinden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken S. Jinks Robertson en E. Heidenreich voor het verstrekken van plasmiden en giststammen, P. Pham en MF Goodman voor hulp metde TLS test. Dit werk werd ondersteund, voor een deel, door de Amerikaanse Federatie voor Aging Research te verlenen en door de NIH AG20642, AG025135.

Twee modellen zijn levensduur wordt gebruikt om te studeren veroudering in S. cerevisiae: RLS en CLS. De replicatieve (ontluikende) levensduur (RLS) is gebaseerd op de observatie dat gist moeder cellen een eindig aantal divisies 3-6 ondergaan. Zullen we ons richten op de chronologische levensduur (CLS), een model gebaseerd op de chronologische overleving van niet-delende gist in cultuur of op platen 7-11. Wild type gist groeit exponentieel voor 10-12 uur in synthetische dextrose complete (SDC) medium . Bij het glucose niveau verlaagt, gist overschakelt van fermentatie tot ademhaling, een proces genaamd diauxic verschuiven. Cellen langzaam blijven delen tijdens de post-diauxic fase voor ongeveer 48 uur vóór het binnenvaren G 0 arresteren. De stofwisseling van de cellen blijft hoog tot dag 5-6 (dag 0 is de inenting dag). Levensvatbaarheid van de cellen na verloop van tijd kan worden geopend met het percentage van de chronologisch verouderende cellen, bemonsterd om de twee dagen, die G 0 arrestatie en vormen kolonies op rijke YPED platen kunnen verlaten. 1. Gist chronologische levensduur (CLS) in vloeibare cultuur <ol><li> Inoculeren een enkele kolonie in 1 ml synthetisch volledige glucose-medium (SDC, tabel 1) en incubeer overnacht met schudden (220 rpm) bij 30 ° C. Drie inoculums van onafhankelijke kolonies moeten worden voorbereid voor elke stam om de biologische replica&#39;s te bieden. </li><li> Verdun het &#39;s nachts de cultuur in verse SDC medium (meestal 10 ml) tot OD = 0.05-0.1 (~ 1:100 verdunning) en incubeer met schudden (220 rpm) bij 30 ° C. Dit tijdstip wordt beschouwd als dag 0 van de chronologische veroudering. Handhaaf een 1:5 verhouding van cultuur / fles volume (10 ml cultuur in 50 ml, of voor een langere / grote experimenten 25 ml cultuur in 125 ml) om een ​​goede beluchting zorgen. </li><li> Vanaf dag drie, twee porties van 10 pi uit de kolf te verwijderen, verdunnen 10.000 keer in geautoclaveerd water, 10 ui verdund cultuur (dat wil zeggen, 10 4 -10) op YEPD (1% gistextract, 2% Bacto pepton, 2% glucose , 2% agar) platen, en incubeer bij 30 ° C voor 48-72 uur voordat kolonievormende verenigen (CFU) is geteld. </li><li> Dag 3 CFU wordt beschouwd als 100% overleving. Verdunningsfactoren van vergrijzing cultuur in de daaropvolgende dagen moet dienovereenkomstig worden aangepast aan ~ 20-100 kolonies in de CFU-test (bijvoorbeeld 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, etc.) te verzekeren. Voor wild-type cellen in de DBY746 achtergrond, de CLS bereikt 1% overleving rond dag 11. </li></ol> Variaties van in situ levensvatbaarheid test zijn onder meer: <ul><li> Caloriebeperking (CR) van glucose beperking. Verdunning van &#39;s nachts cultuur in glucose beperkte SC medium (zoals 0,5 of 0,05% in plaats van de standaard 2% glucose) in het algemeen leiden tot een lagere dichtheid bevolking verzadiging op dag 3, maar veel langere gemiddelde en maximale (10% overleving) levensduur 12. </li><li> Voor extreme CR / honger, was de dag 3 stationaire fase cultuur (meestal 10 ml, zoals in stap 3 hierboven) met geautoclaveerd water (resuspendeer cellen in gelijke hoeveelheid water en spin neer op 2500 rpm gedurende 5 minuten, herhaal 3 keer). Incubationof cellen in water bootst de honger voorwaarde dat de gist kunnen tegenkomen in het wild. Om de twee dagen daarna, moet veroudering cultuur gewassen met geautoclaveerd water en opnieuw gesuspendeerd in gelijke hoeveelheid water die alle voedingsstoffen vrijkomen uit gelyseerde dode cellen te verwijderen. Voer levensvatbaarheid assay door bemonstering van de vergrijzing van de cultuur zoals hierboven beschreven. Deze toestand zal hongersnood leidde tot bijna een verdubbeling van de gemiddelde CLS in het wild type DBY746 stam 12. </li></ul> 2. Ter plaatse levensvatbaarheid assay In de vloeistof cultuur, een klein deel van de overlevende cellen kunnen de celcyclus opnieuw worden ingevoerd en te groeien gebruik te maken van de resterende voedingsstoffen of deze vrijgegeven vorm gelyseerd dode cellen in het medium, een fenotype genoemd hergroei / hijgend 13. We ontwikkelden een levensvatbaarheid-op-een-plaat systeem dat de auxotrofie van de DBY746 stam (trp1) gebruikt voor het omzeilen van de hergroei / hijgend probleem en ook laat het testen van het effect van constante blootstelling of ontbering van verschillende externe stimuli voedingsstoffen of op gist CLS 11. Deze in situ levensvatbaarheid assay bootst ook de replicatieve levensduur model zoals dat cellen voortdurend worden blootgesteld aan overvloedige voedingsstoffen voor de duur van de levensduur analyse. <ol><li> Inoculeren een enkele kolonie in 1 ml synthetisch volledige glucose-medium (SDC) en incubeer overnacht met schudden (220 rpm) bij 30 ° C. Ten minste drie inoculums van onafhankelijke kolonies moeten worden voorbereid voor elke stam om de biologische replica&#39;s te bieden. </li><li> Laat de cultuur om te groeien tot ~ 10 8 cellen / ml (OD 600 = ~ 10), vul het culturewith geautoclaveerd water met 100-200 cell/10 ui (meestal 10 4-voudige verdunning) en 1.000 cells/10 il (10 3 -voudige verdunning). </li><li> Bord twee aliquots van 10-30 ul van de verwaterde cultuur op een tryptofaan uitval SDC plaat. Voorr elke stam, bereiden een reeks van 8 tot 20 platen en geëtiketteerd overeenkomstig plating dichtheid (bv. 10 4-voudig verdund, plaat 10 ui of 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, 10 -30 3 , enz.), die ervoor zorgen 10-100 kolonies kunnen worden geteld in afwachting van verminderde levensvatbaarheid tijdens het ouder worden. </li><li> Incubeer de plaat ingesteld op 30 ° C voor de duur van de levensduur analyse. </li><li> Op de dag van de beplating en om de 2 dagen daarna, verwijder een plaat en druppelsgewijs voeg 0,5 ml Tryptofaan (2 mg / ml), zodat levensvatbare cellen om te groeien. Incubeer de plaat bij 30 ° C voor extra 48-72 uur. Tel de CFU voor levensvatbaarheid op de dag van tryptofaan toevoeging. De CFU op de dag van plating wordt beschouwd als 100% overleving. </li></ol> Variaties van in situ levensvatbaarheid test zijn onder meer: <ul><li> Leeftijd van cellen op agarplaten (extreme honger conditie). Voeg 1 ml 2x YPED in plaats van tryptofaan op de volgende dagen aan de groei en CFU tellen 14 mogelijk te maken. </li><li> Leeftijd cellen op platen met tryptofaan uitval synthetisch complete medium met verschillende koolstofbronnen, zoals verschillende concentraties van glucose (calorie beperking door glucose beperking), diverse koolstofbronnen, zoals ethanol, glycerol, azijnzuur 14. Voeg 1 ml glucose / tryptofaan-oplossing (20% glucose en 1mg/ml tryptofaan) om de groei en de CFU tellen mogelijk te maken. </li><li> Andere voedingsstoffen manipulatie, zoals stikstof. </li></ul> 3. DNA-schade en mutatie frequentie tijdens chronologische veroudering Canavanine weerstand (Can r) en CAN1 sequencing Spontane mutatie frequentie kan worden geëvalueerd door het meten van de frequentie van de Canavanine weerstand (Can r) in chronologische veroudering culturen. Mutaties in het CAN1 (YEL063) gen, waarin het plasma arginine permease codeert, maken cellen resistent zijn tegen de arginine analoge L-canavanine.Can r kolonies verzameld op verschillende tijdstippen kunnen ook worden opgeslagen voor de extractie van genomisch DNA en de daarop volgende volgorde van de CAN1 gen, die kunnen zorgen voor mutaties spectrum van gegevens (met mutatie Surveyor, SoftGenetics). Base substituties (Trp + terugslaan) Stammen met trp1-289 bevatten, een amber mutatie (C403T) in de TRP1 coderende sequentie. Meting van de frequentie van trp1-289 tot Trp + reversion 15 maakt de schatting van de basis vervangen tarief tijdens de gist chronologische veroudering. Frame-shift mutaties De Leie - stam EH150 (Mata, lys2ΔBglII, trp1-Δ, his3-Δ200, ura3-52, ade2-1o) herbergt een lys2ΔBgl II mutatie die werd gebouwd door het invoegen van vier nucleotiden op een Bgl II restrictie-enzym site in de LYS2 gen te creëren . De resulterende +4 verschuiving in de open reading frame resulteert in auxotrofie voor lysine die kan worden omgekeerd door kleine insertie / deletie mutaties 16-17. Bruto chromosomale herschikkingen (GCRs) Voor het detecteren van bruto chromosomale herschikkingen (GCRs) genereerden wij een mutante stam, waarin HXT13 (YEL069), dat codeert voor een zeer redundant hexose transporter, werd verstoord door een URA3 cassette 18. HXT13 ligt 7,5 kb telomere te CAN1 op chromosoom V. Mutaties in zowel CAN1 en URA3 genen maken cellen weerstand tegen L-Canavanine en 5-fluoroorotic zuur (5FOA), respectievelijk. Gezien de lage frequentie van punt mutaties die optreden in beide genen, de analyse van de Can r 5FOA r frequentie geeft een schatting van GCRs die resulteren in het verlies van beide genen. Homologe recombinatie en homeologous Voor het bewaken van het niveau van de homologe (100%) en homeologous recombinatie (91%) tijdens de chronologische veroudering, we gegenereerd mutanten waarin gelineariseerde plasmiden (HIS3:: intron-IR-URA3) dragen ofwel 100% homoloog inverted repeats (IRS) (pSR406 ) of 91% homeologous IRS (pSR407) aan de HIS3 locus 19. Recombinatie tussen de IRS kan de expressie van functionele HIS3 eiwit. <ol><li> Parallel met de normale levensvatbaarheid assay (zoals hierboven beschreven), wordt een geschikte hoeveelheid van cellen van de veroudering cultuur, <ol><li> voor Can r mutatie, te beginnen met ~ 2x10 7 cellen (200 ul van dag 3 cultuur); </li><li> voor Trp + reversion, te beginnen met ~ 10 8 cellen (500-1000 ul van dag 3 cultuur); </li><li> voor de Lys + frame-shift mutatie, te beginnen met ~ 10 8 cellen (500-1000 ul van dag 3 cultuur); </li><li> voor GCRs, start met een 2-3x10 8 cellen (2-3 ml van dag 3 cultuur); </li><li> voor homologe recombinatie en homeologous, begin bij en tilde; 5x10 7 cellen (200-500 ul van dag 3 cultuur); </li></ol> Pas de plating bedrag volgens de daling van de totale levensvatbaarheid en de toename van de mutatie frequentie tijdens chronologische veroudering (tabel 2). In het geval van stammen met hypermutator fenotype (zoals die met gebreken bij DNA-herstel), dienovereenkomstig te verminderen de bemonstering bedrag. </li><li> Pellet van de cellen met bench-top centrifuge machine (6000 rpm gedurende 5 minuten). </li><li> Resuspendeer cellen in 1 ml geautoclaveerd water, en pellet de cellen weer. </li><li> Resuspendeer cel pellet in 100 ui van het water. Plaat cellen, <ol><li> voor Can r mutatie, op arginine-dropout synthetisch compleet medium platen (SDC-Arg, aangevuld met 60 ng / ml L-Canavanine sulfaat); </li><li> voor Trp + reversion, op tryptofaan-dropout platen (SDC-Trp); </li><li> voor de Lys + frame-shift mutatie, op lysine-dropout platen (SDC-Lys); </li><li> voor GCRs op arginine-dropout platen (SDC-Arg), aangevuld met 5FOA (1 mg / ml) en L-Canavanine sulfaat (60 ug / ml); </li><li> voor homologe recombinatie en homeologous op histidine-dropout platen aangevuld met galactose (2%). </li></ol></li><li> Count CFU&#39;s na 3-4 dagen incubatie bij 30 ° C. De mutatie frequentie wordt genormaliseerd naar het aantal levensvatbare cellen. </li></ol> Aanvulling op de in situ levensvatbaarheid assay, leeftijd-afhankelijke Trp + reversion, Lys + frame-shift mutatie, recombinatie, of &#39;Can r kan ook worden bestudeerd in cellen jaar oud op de plaat. <ol><li> Plaat-cellen (~ 10 8 cellen / plaat) op Trp-, Lys-, His-uitval, of L-Canavanine synthetisch compleet medium platen (zoals hierboven beschreven). </li><li> Om de twee dagen (of op het tijdstip van belang), de score van de nieuwe opkomende koloniën. </li><li> Mutatie frequentie wordt geschat door het normaliseren van nieuwe opkomende koloniën aan het totale aantal levensvatbare cellen van het specifieke dag. </li></ol> 4. Translesie synthese (TLS) De leeftijd-afhankelijke mutatie frequentie te verhogen kan betekenen verhoogde macromolecuul schade, verminderde cellulaire bescherming / reparatie, en de toegenomen foutieve DNA herstel (zoals Polζ-afhankelijke translesie synthese, TLS) bij het ouder worden. Bijvoorbeeld, de lange levensduur sch9 Δ mutanten vertonen verhoogde expressie van SOD2, en verminderde de expressie van de foutgevoelige DNA-reparatie-enzym Rev.1 20. Hier beschrijven we een test te combineren beschadigde DNA template en hele nucleaire extract om de TLS te evalueren in vitro. <ol><li> Bereid kernextract zoals beschreven door Wang et al., 21;. Kwantificeren de eiwitconcentratie door BCA assay (Pierce). </li><li> Voeg 0, 5, 10 of 20 ug van nucleaire extracten tot 50 ui (uiteindelijk volume) reacties met TLS buffer (20 mM HEPES, 7 mM MgCl2, 1 mM DTT, 25 mM NaCl, pH 7,8), 200 μMdNTPs en 100 nm 5&#39;-32 P-gelabelde 12-mer primer (5&#39;-TGG CGA TAC GGA-3 &#39;), gegloeid om een 48-mer template met daarin DNA-schade van belang (5&#39;-TCG ATA CTG GTA CTA ATG ATT AAC GAC TXA AGC ACG TCC GTA CCA TCG-3 &#39;, waarin X is de aangetaste locatie, bijvoorbeeld abasic site, 8-oxo-G, etc.). </li><li> Incubeer het mengsel bij 30 ° C gedurende 30 min, beëindigen de reactie met de toevoeging van 2,5 ul EDTA (20 mm) en 2 pl proteinase K (10 mg / ml). </li><li> Zuiver DNA met fenol extractie en ethanol precipitatie. </li><li> Resuspendeer DNA in 50 ul van gel laadbuffer (98% formamide, 20 mM EDTA, en kleurstof). </li><li> Het oplossen van de translesie synthese producten op 19% polyacrylamide gels. </li><li> Kwantificeren van de TLS met phosphorimaging (figuur 1). </li></ol> 5. Representatieve resultaten We meestal de CFU tellingen waren vroeger op dag 3 als 100 procent overleving in de standaard vloeistof CLS-analyse. Het percentage overleving in de volgende dagen kan worden uitgerust met het gemiddelde (50% overleving) te berekenen en maximum (10% overleving) levensduur 12. Levensduur resultaten van de in situ levensvatbaarheid test zijn over het algemeen overeen met die welke met behulp van de vloeistof CLS-test, maar met verminderde de gemiddelde levensduur, die deels te wijten aan het feit dat cellen voortdurend worden blootgesteld aan voedingsstoffen. Aanwezigheid van glucose remt de activiteit van cellulaire bescherming toonde door de verminderde transactivatie van stress respons transcriptiefactor, zoals Msn2 / 4 en Gis1 12. Leeftijdsafhankelijke mutatie frequentie is sterk afhankelijk van de stam achtergrond, genetische manipulatie, kweekomstandigheden, en leeftijd. Tabel 2 toont de typische resultaten die zijn verkregen in het wild-type stam (DBY746). <table border="1"><tbody><tr><th> Bestanddeel </th><th> g / L </th></tr><tr><td> D-glucose </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Ammoniumsulfaat </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Basis van stikstof (-AS/-AA) </td><td> 1.8 </td></tr><tr><td> NaH2PO4 </td><td> 1.4 </td></tr><tr><td></td><td> mg / L </td></tr><tr><td> Adenine </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Arginine </td><td> 40 </td></tr><tr><td> L-Asparaginezuur </td><td> 100 </td></tr><tr><td> L-Glutaminezuur </td><td> 100 </td></tr><tr><td> L-Histidine </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Isoleucine </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-Leucine </td><td> 120 </td></tr><tr><td> L-Lysine </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-Methionine </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Fenylalanine </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-Serine </td><td> 400 </td></tr><tr><td> L-Threonine </td><td> 200 </td></tr><tr><td> L-Tryptofaan </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Tyrosine </td><td> 40 </td></tr><tr><td> L-Valine </td><td> 150 </td></tr><tr><td> Uracil </td><td> 80 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Synthetic volledige glucose-medium, SDC (aanpassen aan pH 6.0 met NaOH). 4-voudige overmaat van histidine, zijn leucine, tryptofaan, en uracil opgenomen om het auxotrofie van de DBY746 stam te compenseren. <table border="1"><tbody><tr><th></th><th> Dag 3 (gemiddelde ± SEM) </th><th> Tot (gedurende het ouder worden) </th></tr><tr><td> Kunnen r </td><td> 1.76 ± 0.12 x10 -6 </td><td> 6-8 x10 -6 </td></tr><tr><td> Trp + reversion </td><td> 6.60 ± 1.70 x10 -8 </td><td> 1,60 x10 -6 </td></tr><tr><td> Lys + frame-shift mutatie </td><td> 3.00 ± 0.78 x10 -8 </td><td> 0,70 x10 -6 </td></tr><tr><td> GCRs </td><td> 0.62 ± 0.10 x10 -8 </td><td> 0,30 x10 -6 </td></tr><tr><td> Homologe recombinatie </td><td> 5.55 ± 2.74 x10 -6 </td><td> 27,00 x10 -6 </td></tr><tr><td> Homeologous recombinatie </td><td> 0.12 ± 0.04 x10 -6 </td><td> 0,48 x10 -6 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Typische mutatie frequenties van wild-type cellen (DBY746) tijdens de chronologische veroudering. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3030/3030fig1.jpg" /> Figuur 1. Resultaat van translesie synthese (TLS) 20. Nucleaire extracten van 3 dagen oud, stationaire fase wild-type (DBY746) en sch9 Δ mutant cellen werden geïncubeerd met onbeschadigde of abasic site-DNA bevat sjablonen voor 30 min bij 30 ° C. TLS producten worden aangeduid met solide (met onbeschadigde template) of gestippeld (met beschadigde sjabloon) lijnen. Er was geen translesie synthese waargenomen in nucleaire uittreksel uit sch9 Δ mutanten. Gratis primers worden aangeduid met de open pijl.

<ol><li>Longo, V. D., Finch, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+medicine%3A+from+dwarf+model+systems+to+healthy+centenarians%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evolutionary medicine: from dwarf model systems to healthy centenarians.</a> Science. 299, 1342-1346 (2003).</li>
<li>Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+healthy+life+span--from+yeast+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extending healthy life span--from yeast to humans.</a> Science. 328, 321-326 (2010).</li>
<li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+of+individual+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183, 1751-1752 (1959).</li>
<li>Muller, I., Zimmermann, M., Becker, D., Flomer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calendar+life+span+versus+budding+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Calendar life span versus budding life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mech. Ageing Dev. 12, 47-52 (1980).</li>
<li>Jazwinski, S. M., Egilmez, N. K., Chen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+control+and+cellular+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Replication control and cellular life span.</a> Exp. Gerontol. 24, 423-436 (1989).</li>
<li>Pohley, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formal+mortality+analysis+for+populations+of+unicellular+organisms+%28Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">A formal mortality analysis for populations of unicellular organisms (Saccharomyces cerevisiae.</a> Mech Ageing Dev. 38, 231-243 (1987).</li>
<li>Longo, V. D., Gralla, E. B., Valentine, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+activity+is+essential+for+stationary+phase+survival+in+Saccharomyces+cerevisiae.+Mitochondrial+production+of+toxic+oxygen+species+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase activity is essential for stationary phase survival in Saccharomyces cerevisiae. Mitochondrial production of toxic oxygen species in vivo.</a> J Biol Chem. 271, 12275-12280 (1996).</li>
<li>Longo, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae.+Studies+of+superoxide+dismutase%2C+Ras+and+Bcl-2+%5B%5D%22">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Studies of superoxide dismutase, Ras and Bcl-2 [dissertation]</a>. , University of California Los Angeles. California Los Angeles. (1997).</li>
<li>Fabrizio, P., Pozza, F., Pletcher, S. D., Gendron, C. M., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+longevity+and+stress+resistance+by+Sch9+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of longevity and stress resistance by Sch9 in yeast.</a> Science. 292, 288-290 (2001).</li>
<li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2, 73-81 (2003).</li>
<li>Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+model+system+for+age-dependent+DNA+damage+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer.</a> Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).</li>
<li>Wei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+extension+by+calorie+restriction+depends+on+Rim15+and+transcription+factors+downstream+of+Ras%2FPKA%2C+Tor%2C+and+Sch9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Life span extension by calorie restriction depends on Rim15 and transcription factors downstream of Ras/PKA, Tor, and Sch9.</a> PLoS Genet. 4, e13-e13 (2008).</li>
<li>Fabrizio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166, 1055-1067 (2004).</li>
<li>Wei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tor1%2FSch9-regulated+carbon+source+substitution+is+as+effective+as+calorie+restriction+in+life+span+extension%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tor1/Sch9-regulated carbon source substitution is as effective as calorie restriction in life span extension.</a> PLoS Genet. 5, e1000467-e1000467 (2009).</li>
<li>Capizzi, R. L., Jameson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+table+for+the+estimation+of+the+spontaneous+mutation+rate+of+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">A table for the estimation of the spontaneous mutation rate of cells in culture.</a> Mutat Res. 17, 147-148 (1973).</li>
<li>Heidenreich, E., Novotny, R., Kneidinger, B., Holzmann, V., Wintersberger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-homologous+end+joining+as+an+important+mutagenic+process+in+cell+cycle-arrested+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Non-homologous end joining as an important mutagenic process in cell cycle-arrested cells.</a> Embo J. 22, 2274-2283 (2003).</li>
<li>Heidenreich, E., Wintersberger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-dependent+and+selection-induced+mutations+in+respiration-competent+and+respiration-deficient+strains+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Replication-dependent and selection-induced mutations in respiration-competent and respiration-deficient strains of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Gen Genet. 260, 395-400 (1998).</li>
<li>Chen, C., Kolodner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gross+chromosomal+rearrangements+in+Saccharomyces+cerevisiae+replication+and+recombination+defective+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Gross chromosomal rearrangements in Saccharomyces cerevisiae replication and recombination defective mutants.</a> Nat Genet. 23, 81-85 (1999).</li>
<li>Datta, A., Adjiri, A., New, L., Crouse, G. F., JinksRobertson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+crossovers+between+diverged+sequences+are+regulated+by+mismatch+repair+proteins+in+Saccaromyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitotic crossovers between diverged sequences are regulated by mismatch repair proteins in Saccaromyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 16, 1085-1093 (1996).</li>
<li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+homologue+Sch9+promotes+age-dependent+mutations+by+a+superoxide+and+Rev1%2FPolzeta-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism.</a> J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).</li>
<li>Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+recombinant+genes+and+preparation+of+cell-free+extracts+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of recombinant genes and preparation of cell-free extracts in yeast.</a> Methods Mol Biol. 313, 317-331 (2006).</li>
<li>Fabrizio, P., Pletcher, S. D., Minois, N., Vaupel, J. W., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronological+aging-independent+replicative+life+span+regulation+by+Msn2%2FMsn4+and+Sod2+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Chronological aging-independent replicative life span regulation by Msn2/Msn4 and Sod2 in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Lett. 557, 136-142 (2004).</li>
<li>Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+quiescent+and+nonquiescent+cells+from+yeast+stationary-phase+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of quiescent and nonquiescent cells from yeast stationary-phase cultures.</a> J Cell Biol. 174, 89-100 (2006).</li>
<li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+mutation+in+SCH9+prevents+recombination+errors+and+premature+genomic+instability+in+a+Werner%2FBloom+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Longevity mutation in SCH9 prevents recombination errors and premature genomic instability in a Werner/Bloom model system.</a> J Cell Biol. 180, 67-81 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Vloeistof veroudering culturen ergens exposeren hergroei / hijgen fenotype 13, die de CLS analyse bemoeilijkt. Hergroei treedt meestal op als er meer dan 90-99% van de bevolking heeft verloren levensvatbaarheid. Dit fenotype wordt vaak geassocieerd met een verhoogde oxidatieve stress en / of verminderd bescherming in de cel. Bijvoorbeeld, de frequentie van dit fenotype meer dan verdubbeld in cellen ontbreekt cytosolische superoxide dismutase en vermindert in de langlevende mutanten (bijv. sch9 Δ of ras2 Δ) of mutanten overexpressie superoxide dismutases 22. In de praktijk, definiëren we hergroei als een toename van de levensvatbaarheid of stabilisatie van de levensvatbaarheid van 3 opeenvolgende bemonsteringen in de hoge sterfte tijdens de fase van chronologische veroudering. Leeftijdsafhankelijke frequenties van de verschillende DNA-mutaties variëren sterk, afhankelijk van de stam achtergrond, genetische manipulatie, kweekomstandigheden, evenals hergroei / hijgen en extreem lage overleving. Pre-experimenten worden uitgevoerd op de tijdstippen, zoals de gemiddelde en maximale overleving met diverse plating dichtheid voor mutatieassays tot mutatie frequentie bereik te bepalen voordat performingthe full scale levensduur analyse. De wild-type stam moeten altijd worden opgenomen in een levensduur of mutatie frequentie studie parallel aan een behandeling of genetische mutant, zodanig dat inter-experiment-variaties kan worden verklaard. Meerdere biologische replica&#39;s moet worden opgenomen in de studie, en, zowel vloeibare als in situ levensvatbaarheid / mutatieassays moet worden uitgevoerd ter bevestiging van de resultaten. In plaats van zich te concentreren op een specifiek type van de DNA-mutatie, profilering van leeftijdsafhankelijke genomische instabiliteit met behulp van meerdere testen in combinatie, kunnen licht werpen op specifieke DNA-schade en DNA-schadeherstel systeem (s) die bijdragen aan leeftijdsafhankelijke genomische instabiliteit. Bijvoorbeeld, is een aanzienlijke stijging van de bruto chromosomale herschikkingen (GCRs), vergeleken met die van andere DNA-mutaties, waargenomen in wild-type gist suggereert een elevationof dubbele draad te breken en / of een bijzondere waardevermindering in niet-homologe eind mee (NHEJ) tijdens gist chronologische veroudering (tabel 2). De CAN1 mutatie spectrum (sequencing van de CAN1 gen) verkregen in de wild-type veroudering gist stelde een verhoging van de oxidatieve schade tijdens chronologische veroudering en foutgevoelige DNA-herstel, en dat, in een lange levensduur sch9 Δ mutanten, minder oxidatieve DNA-schade en veel minder foutgevoelig translesie synthese waargenomen 20. Beschreven methoden hier kan verder worden besteed aan leeftijd-afhankelijke genomische instabiliteit te bestuderen. Zo kan bijvoorbeeld rustige en niet-latente cellen worden geïsoleerd uit gist stationaire-fase culturen met behulp van de dichtheid gradiënt methode beschreven door Allen et al.. 23. In combinatie met de mutatie assays hier beschreven, hebben we gemeld dat een groot deel van leeftijd-afhankelijke mutaties ontstaat uit slapende cellen, in plaats van de te verdelen, beschadigde of apoptotische cellen 20,24.

studeren age-afhankelijke genomische instabiliteit met behulp van de s. cerevisiae chronologische levensduur model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies die gebruik maken van de Saccharomyces cerevisiae ouder model hebben ontdekt levensduur regelgeving pathways die gedeeltelijk bewaard in hogere eukaryoten 1-2. De eenvoud en kracht van de gist ouder model kan ook worden onderzocht op DNA-schade en genoom onderhoud, alsmede hun bijdragen aan ziekten tijdens Aging Study. We beschrijven hier een systeem om leeftijd-afhankelijke DNA-mutaties, waaronder base substituties, frame-shift mutaties, grove chromosomale herschikkingen, en homologe / homeologous recombinatie, evenals nucleair DNA-herstel-activiteit door het combineren van de gist chronologische levensduur met simpele DNA-onderzoek schade en mutatie assays. De hier beschreven methoden moeten vergemakkelijken de identificatie van genen / pathways die genomische instabiliteit en de mechanismen die leeftijd afhankelijke DNA-mutaties en kanker ten grondslag liggen bij zoogdieren te reguleren.

Hier beschrijven we een set van DNA-mutatie assays die kunnen worden gecombineerd met de gist chronologische levensduur model om de genen / paden die reguleren of bijdragen aan de genomische DNA instabiliteit tijdens Aging Study.

Studeren Age-afhankelijke genomische instabiliteit met behulp van de S. cerevisiae Chronologische levensduur Model

Studies met gebruik van het verouderingsmodel van *Saccharomyces cerevisiae* hebben reguleringspaden voor de levensduur blootgelegd die gedeeltelijk geconserveerd zijn in hogere eukaryoten1-2. ...

Het algemene doel van deze procedure is om leeftijdsafhankelijke genomische instabiliteit in gist te bestuderen door de chronologische levensduur te combineren met een reeks eenvoudige assays voor DNA-schade en mutaties. Dit wordt bereikt door eerst elke twee dagen monsters te nemen van chronologisch verouderende culturen en de levensvatbaarheid te controleren via colony forming unit of CFU-vorming. De volgende stap van de procedure is het onderzoeken van DNA-mutaties door monsters te nemen van verouderende culturen en de cellen uit te platen op een mutatiespecifiek selectiemedium.Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die veranderingen in DNA-mutaties tijdens de chronologische veroudering van gist aantonen door de resultaten van de mutatieanalyse te normaliseren ten opzichte van de levensvatbaarheid. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het verouderingsonderzoek, zoals de mechanismen die veroudering en genomische instabiliteit met elkaar verbinden. Om de chronologische levensduur of CLS van gist te bepalen, inoculeert u eerst een enkele gistkolonie in één milliliter synthetisch compleet glucose-medium, of SDC-medium, en incubeert u dit gedurende de nacht onder schudcondities bij 30 °C. Verdun de overnight-cultuur de volgende dag in 10 milliliter vers SDC-medium tot een OD 600 van 0,05 tot 0,1 en incubeer dit drie dagen lang onder schudcondities bij 30 °C.Op dag drie, wanneer de cellen zich in de stationaire fase bevinden, wordt elk Eloqua 10.000 keer verdund in autoclaafwater. Neem vervolgens twee aliquots van 10 µL uit de kolf en plaatst 10 µL van elke verdunde cultuur op een A-Y-E-P-D plaat. Incubeer de plaat bij 30 °C totdat er kolonies ontstaan. Het aantal ontstane kolonies of colony forming units uit de cultuur van dag drie wordt beschouwd als 100% overleving.Ga door met het wegnemen van aliquoten uit de verouderende cultuur op opeenvolgende dagen voor het uitplaten. Pas de verdunningsfactoren dienovereenkomstig aan om ongeveer 20 tot 100 kolonies in de CFU-assay te waarborgen. De bemonstering wordt gestopt wanneer de levensvatbaarheid van de cultuur is gedaald tot onder de 1% (typisch tussen dag 11 en 13); de cellevensvatbaarheid kan ook worden bestudeerd in cellen die op platen zijn verouderd.Om deze assay te starten, inoculeert u een enkele kolonie in één milliliter synthetisch compleet glucosemedium en incubeert u dit gedurende de nacht onder schudcondities bij 30 °C. Wanneer de cultuur is gegroeid tot ongeveer 10⁸ cellen per milliliter, verdunt u de cultuur met autoclaafwater tot 100 tot 200 cellen per 10 µL en 1000 cellen per 10 µL. Bereid voor elke stam een set van acht tot 20 tryptofaan-dropout SDC-platen voor, gelabeld volgens de uitplaatdichtheid.Om ervoor te zorgen dat 10 tot 100 kolonies kunnen worden geteld, rekening houdend met de afnemende levensvatbaarheid tijdens het verouderingsproces, plaatst u twee aliquoten van 10 tot 30 µL van de verdunde cultuur op elke plaat. Incubeer de set platen bij 30 °C gedurende de duur van de levensduuranalyse. Verwijder op de dag van het uitplaten en vervolgens elke twee dagen één plaat en voeg druppelsgewijs 0,5 mL tryptofaan toe om de levensvatbare cellen te laten groeien. Incubeer de plaat nog eens 48 tot 72 uur bij 30 °C.Na 48 tot 72 uur. Tel de CFU om de levensvatbaarheid op de dag van tryptofaan-toevoeging te bepalen voor het analyseren van DNA-schade en mutatiefrequentie tijdens chronologische veroudering. Een aantal stammen met speciale kenmerken worden parallel aan de wildtype-stam gekweekt voor de gist-CLS-assay.De spontane mutatiefrequentie kan worden geëvalueerd door de frequentie van L-canavanine-resistentie in een chronologisch verouderende cultuur te meten. Mutaties in het CAN1-gen, dat de plasma-argininepermease codeert, maken cellen resistent voor de arginine-analoog L-canavanine. Canavanine-resistente cellen zullen groeien op synthetisch compleet medium-platen zonder arginine, aangevuld met L-canavaninesulfaat. De meting van de TRIP-positieve reversiefrequentie in een stam met een amber-mutatie in de TRIP1-coderende sequentie maakt het mogelijk om de snelheid van base-substitutie tijdens chronologische veroudering van gist te schatten.Positieve reversiecellen zullen groeien op tryptophan-dropoutplaten. De lyse-negatieve stam EH1-50 bevat een shift van plus vier in het open leesraam, wat resulteert in lysine-auxotrofie, en dit kan worden omgekeerd door kleine insertie- of deletiemutaties. De revertanten zullen worden geselecteerd op lysine-dropoutplaten om grove chromosomale herschikkingen of gcr te detecteren.Er wordt gebruikgemaakt van een mutante stam waarin HX T 13, gelegen op 7,5 kilobases telomeerzijde van can1 op chromosoom vijf, is onderbroken door een U3-cassette; mutaties in zowel de can1- als de U3-genen maken de cellen respectievelijk resistent tegen L-canavanine en 5-fluororotinezuur. Aangezien de frequentie van puntmutaties in beide genen laag is, biedt de analyse van de frequentie van resistentie tegen zowel L-canavanine als 5-fluororotinezuur een schatting van gcr om het niveau van homologe en niet-homologe recombinatie te monitoren. Tijdens chronologische veroudering worden mutanten gegenereerd die ofwel 100% homologe geïnverteerde herhalingen of 91% homologe herhalingen bevatten.IRS bij de his3-locus zorgt ervoor dat recombinatie tussen de IRS de expressie van functioneel his3-eiwit mogelijk maakt. Daarom zullen cellen waarin recombinatie heeft plaatsgevonden groeien op histidine-dropoutplaten aangevuld met galactose. Op dag drie, wanneer de cellen zich in de stationaire fase bevinden, wordt een passende hoeveelheid cellen uit elke verouderingscultuur verwijderd.Aangezien voor alle assays dezelfde procedure wordt gebruikt, wordt er slechts één monster verwerkt. Voor de doeleinden van deze video worden de cellen gepelletteerd door middel van centrifugatie in een tafelcentrifuge. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in één milliliter autoclaafwater pellet.Verwijder opnieuw het supernatant en resuspendeer de celpellet in 100 µL water; plaat de cellen op de juiste platen om te selecteren op de gewenste reverts. Incubeer de platen bij 30 °C en tel na drie tot vier dagen de CFU's; de mutatiefrequentie wordt genormaliseerd naar het aantal levensvatbare cellen. Deze grafiek toont representatieve resultaten van een typische assay voor de chronologische levensduur, waarbij de chronologische overleving van wildtypecellen wordt vergeleken met die van S CH nine delta TOR one delta en RAs two delta mutanten.In vloeibare cultuur vertonen mutanten met een tekort aan TOR one s, CH nine of RAs two een verlengde chronologische levensduur. Bovendien vertonen deficiënties in s CH nine en RAs two een additief effect op de bevordering van de levensduur en chronologische overleving in de aanwezigheid van diverse koolstofbronnen. Het gebruik van de NC two levensvatbaarheidsassay wordt getoond in de volgende grafiek.Op dag één werden SDC wild-type culturen verdund en uitgeplaat op SC trip dropout-platen zonder koolstofbron. SC trip dropout-platen aangevuld met glucose, ethanol of glycerol-oraatplaten werden elke twee dagen geïncubeerd bij 30 °C. Van elke set werd één plaat teruggehaald en er werden passende voedingsstoffen toegevoegd om groei en kolonievorming mogelijk te maken.De leeftijdsafhankelijke mutatiefrequentie varieert sterk afhankelijk van de stam, de achtergrond, genetische manipulatie, kweek, condities en leeftijd. Deze tabel toont typische resultaten verkregen in een wild-type stam. Representatieve resultaten van translesiesynthese worden getoond in de volgende afbeelding.De leeftijdsafhankelijke toename van de mutatiefrequentie kan verband houden met veranderingen in foutieve DNA-reparatie met gebruik van nucleaire extracten en diverse DNA-templates. We kunnen de translesiesynthese of TLS evalueren in chronologisch verouderde cellen. Nucleaire extracten van drie dagen oude stationaire fase, wild-type en SCH9Δ-mutante cellen werden geanalyseerd.TLS-producten met een onbeschadigde template worden aangegeven door doorgetrokken lijnen en TLS-producten met een beschadigde template worden aangegeven door stippellijnen. Er werd geen translesie-synthese waargenomen in nucleaire extracten van de langlevende s CH nine delta-mutant; vrije primers worden aangegeven door de open pijl. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het uitvoeren van chronologische levensduuranalyse en DNA-mutatieanalyse in gist.

studying-age-dependent-genomic-instability-using-s-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Chronologische veroudering in gist verwijst naar het verlies van cel levensvatbaarheid geassocieerd met de tijd in de stationaire fase. Hier beschrijven we een high-throughput methode voor het kwantitatief bepalen van gist chronologische levensduur.

Kwantificeren van Gist Chronologisch Life Span door uitgroei van Aged cellen

In dit artikel geven we een algemeen protocol voor het meten van de replicatieve levensduur van gist moeder cellen.

Het meten van replicatieve levensduur in de gist

We beschrijven hier de werking van een microfluïdische apparaat dat continue en hoge-resolutie microscopische beeldvorming van enkele ontluikende gistcellen kunnen gedurende hun volledige replicatie en / of chronologische levensduur.

Continue hoge-resolutie Microscopische waarneming van Replicatieve Aging in Budding gist

Mutatie tarieven bij jonge Saccharomyces cerevisiae cellen gemeten door fluctuatie tests worden gebruikt om mutatie frequenties voorspellen voor moeder cellen van verschillende replicative leeftijden. Magnetische sortering en flow cytometrie worden vervolgens gebruikt om de feitelijke mutatie frequenties en leeftijd van moedercellen meten afwijkingen identificeren voorspelde mutatiefrequentie.

De combinatie van magnetische sorteren van Moeder Cellen en Schommelingen Tests om Genome Instabiliteit Tijdens mitose Aging in Analyze Saccharomyces cerevisiae

Dit artikel een protocol geoptimaliseerd voor het vervaardigen van microfluïdische chips en de opstelling van microfluïdische experimenten om de levensduur en cellulaire fenotypen van afzonderlijke gistcellen te meten.

Met behulp van microfluïdische apparaten te meten Levensduur en Cellulaire Phenotypes in Single Budding gistcellen

Hier beschrijven we de replicaset methode, een benadering tot kwantitatief maatregel C. elegans levensduur/overleving en de healthspan in een high-throughput en robuuste manier, waardoor screening van vele voorwaarden zonder in te boeten op kwaliteit van de gegevens. Dit protocol details van de strategie en biedt een software-instrument voor de analyse van gegevens van de replicaset.

De Replica Set, methode: Een High-throughput benadering van kwantitatief maatregel Caenorhabditis elegans levensduur

Hier is een protocol om genetische interacties te identificeren door middel van een verhoogde kopie nummer suppressor scherm in Saccharomyces cerevisiae. Deze methode stelt onderzoekers in staat om te identificeren, klonen, en testen suppressors in kortstondige gist mutanten. We testen het effect van de toename van het kopieeraantal van SIR2 op de levensduur in een autofagie null mutant.

Een suppressor scherm voor de karakterisering van genetische links reguleren chronologische levensduur in Saccharomyces cerevisiae

Het beeldvormingsplatform "The Lifespan Machine" automatiseert de levenslange observatie van grote populaties. We laten de stappen zien die nodig zijn om levensduur-, stressbestendigheids-, pathogenese- en gedragsverouderingstesten uit te voeren. De kwaliteit en reikwijdte van de gegevens stellen onderzoekers in staat om interventies bij veroudering te bestuderen ondanks de aanwezigheid van biologische en omgevingsvariatie.

High-throughput gedragsverouderings- en levensduurtesten met behulp van de Lifespan Machine

Beschrijven we een kwalitatieve analyse voor gist hechting en agar invasie als een maat voor invasieve en pseudohyfale differentiatie. Deze eenvoudige test kan gebruikt worden om de invasieve fenotype van verschillende mutanten, alsmede de effecten omgevingsfactoren te beoordelen en signaalwegen op gist differentiatie.

Test voor Adhesie en Agar invasie in S. cerevisiae

GFP-fusie-eiwitten worden op grote schaal gebruikt om de organellen visualiseren door confocale microscopie. Echter, screening voor mutaties die de morfologie van organellen invloed vereist in het algemeen individueel mutagenese en is tijdrovend. Hier tonen we een methode om simultaan te nemen organel-GFP markers in bijna 5.000 niet-essentiële genen in gist.

Een high-throughput methode om wereldwijd de studie van de morfologie organel in S. cerevisiae

Leer hoe je leeftijdsafhankelijke genomische instabiliteit bestudeert in S. cerevisiae met behulp van chronologische levensduuranalyse en DNA-mutatie-assays. Deze methode onthult mechanismen die veroudering en genoominstabiliteit met elkaar verbinden.

Studeren Age-afhankelijke genomische instabiliteit met behulp van de S. cerevisiae Chronologische levensduur Model

Meer video's verkennen