Studeren Age-afhankelijke genomische instabiliteit met behulp van de S. cerevisiae Chronologische levensduur Model
29 september 2011
Hier beschrijven we een set van DNA-mutatie assays die kunnen worden gecombineerd met de gist chronologische levensduur model om de genen / paden die reguleren of bijdragen aan de genomische DNA instabiliteit tijdens Aging Study.
Het algemene doel van deze procedure is om leeftijdsafhankelijke genomische instabiliteit in gist te bestuderen door de chronologische levensduur te combineren met een reeks eenvoudige DNA-schade- en mutatie-assays. Dit wordt bereikt door eerst elke twee dagen culturen met chronologisch veroudering te bemonsteren en de levensvatbaarheid te controleren door kolonievormingseenheden of CFU-vorming. De volgende stap in de procedure is om de DNA-mutaties te onderzoeken door verouderende culturen te bemonsteren en cellen op selectiemedium specifiek voor mutaties te plateren.
Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die veranderingen in DNA-mutaties tijdens chronologisch veroudering van gist laten zien door de resultaten van de mutatie-assay te normaliseren op de levensvatbaarheid. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het verouderingsveld, zoals de mechanismen die veroudering en genomische instabiliteit in aria verbinden. Om de chronologische levensduur of CLS van gist te meten, incubeert u eerst een enkele gistkolonie in één milliliter synthetisch compleet glucose of SDC-medium en incubeert u deze met schudden bij 30 graden Celsius. Verdun de overnachtelijke cultuur in 10 milliliters vers SDC-medium tot een OD 600 van 0,05 tot 0,1 en incubeer met schudden bij 30 graden Celsius gedurende drie dagen.
Op dag drie, wanneer de cellen in stationaire fase zijn, verdunt u elke Eloqua 10.000 keer in autoclaafwater, verwijdert u vervolgens twee aliquots van 10 microliter uit de fles en plateert u 10 microliter van elke verdunde cultuur op een A-Y-E-P-D-plaat. Incubeer de plaat bij 30 graden Celsius totdat kolonies ontstaan. Het aantal ontstane kolonies of kolonievormingseenheden van de cultuur op dag drie wordt beschouwd als 100% overleving.
Ga door met het verwijderen van aliquots uit de verouderende cultuur op de volgende dagen voor plateren. Pas de verdunningsfactoren aan om ervoor te zorgen dat er ongeveer 20 tot 100 kolonies in de CFU-assay zijn. Het bemonsteren wordt gestopt wanneer de levensvatbaarheid van de cultuur is gedaald tot minder dan 1%, meestal tussen dag 11 en 13, kan ook de levensvatbaarheid van de cellen worden bestudeerd in cellen die op platen zijn verouderd.
Om deze assay te beginnen, incubeert u een enkele kolonie in één milliliter synthetisch compleet glucosemedium en incubeert u deze met schudden bij 30 graden Celsius. Wanneer de cultuur is gegroeid tot ongeveer 10 tot de achtste cellen per milliliter, verdunt u de cultuur met autoclaafwater tot 100 tot 200 cellen per 10 microliter en 1000 cellen per 10 microliter. Bereid voor elke stam een set van acht tot twintig tryptofaan-dropout SDC-platen voor, gelabeld volgens plateerdichtheid.
Om ervoor te zorgen dat er 10 tot 100 kolonies kunnen worden geteld in afwachting van verminderde levensvatbaarheid tijdens veroudering, plateert u twee aliquots van 10 tot 30 microliter verdunde cultuur op elke plaat. Incubeer de plaatset bij 30 graden Celsius gedurende de duur van de levensduuranalyse op de dag van plateren en vervolgens om de twee dagen, verwijdert u één plaat en voegt u druppelsgewijs 0,5 milliliter tryptofaan toe om levensvatbare cellen te laten groeien. Incubeer de plaat bij 30 graden Celsius gedurende een extra 48 tot 72 uur.
Na 48 tot 72 uur. Tel de CFU voor de levensvatbaarheid voor de dag van tryptofaan-editie om vier DNA-schade- en mutatiefrequentie tijdens chronologisch veroudering te meten. Een aantal vreemde met speciale kenmerken wordt parallel met de wild-type stam gekweekt voor de gist CLS-assay.
Spontane mutatiefrequentie kan worden geëvalueerd door de frequentie van canna vanning-resistentie in een chronologisch verouderende cultuur te meten. Mutaties in het can een-gen, dat de plasma-arginine-permeaas codeert, maken cellen resistent tegen het arginine-analogon L Canavan. Canavan-resistente cellen zullen groeien op arginine-dropout synthetisch compleet mediumplaten die zijn aangevuld met L Canavan sulfaat. De meting van trip-positieve revertiefrequentie in een stam die een ambermutatie in de trip-eenheid bevat, stelt de schatting van de snelheid van basensubstitutie tijdens chronologisch veroudering van gist trip mogelijk.
Positieve revertanten zullen groeien op tryptofaan-dropoutplaten. De lys negatieve stam EH een 50 bevat een plus vier-verschuiving in de open leesframe, wat resulteert in ox-atrofie voor lysine, en dit kan worden omgekeerd door kleine insertie- of deletiemutaties. De revertanten worden geselecteerd op lysine-dropoutplaten om grove chromosomale herschikkingen of gcr te detecteren.
Er wordt een mutante stam gebruikt waarin HX T 13, gelegen op 7,5 kilobasen telomeer van can een op chromosoom vijf, is gedisrupteerd door een U drie-cassette. Mutaties in zowel can een als U drie-genen maken cellen resistent tegen L Canavan en vijf fluoro-orotinezuur, respectievelijk. Aangezien de frequentie van puntmutaties die in beide genen voorkomen laag is, biedt de analyse van de frequentie van resistentie tegen zowel El Canavan als vijf fluoro-orotinezuur een schatting van gcr om het niveau van homologe en homologe recombinatie te monitoren. Tijdens chronologisch veroudering worden mutanten gegenereerd die ofwel 100% homologe omgekeerde herhalingen of 91% homologe dragen.
IRS op het his drie-locus. Recombinatie tussen de IRS maakt de expressie van functioneel his drie-eiwit mogelijk. Daarom zullen cellen waarin recombinatie heeft plaatsgevonden groeien op histidine-dropoutplaten die zijn aangevuld met galactose. Op dag drie, wanneer de cellen zich in stationaire fase bevinden, zal een geschikte hoeveelheid cellen uit elke verouderende cultuur worden verwijderd.
Aangezien dezelfde procedure voor alle assays wordt gebruikt, zal slechts één monster worden verwerkt. Pel de cellen voor dit videodoel door ze in een tafelcentrifuge te centrifugeren. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in één milliliter autoclaafwaterpellet.
Verwijder opnieuw het supernatant en resuspendeer het celpellet in 100 microliter water. Plateer de cellen op de juiste platen
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode om leeftijdsafhankelijke genomische instabiliteit in gist te bestuderen door chronologische levensduuranalyse te combineren met DNA-mutatietests. De benadering stelt onderzoekers in staat om de genen en paden die betrokken zijn bij genomische DNA-instabiliteit tijdens het verouderingsproces te onderzoeken.
Belangrijkste onderdeel van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Genomiek
- Veroudering
- Gistbiologie
Achtergrond
- Genomische instabiliteit is een kenmerk van veroudering.
- Gist dient als modelorganisme voor het bestuderen van verouderingsprocessen.
- Inzicht in DNA-mutaties kan inzicht geven in verouderingsmechanismen.
- Eerdere studies hebben genomische instabiliteit gelinkt aan verschillende verouderingsgerelateerde paden.
Doel van het onderzoek
- Om de relatie tussen veroudering en genomische instabiliteit in gist te beoordelen.
- Om een reeks DNA-mutatietests voor dit doel te ontwikkelen.
- Om mutatiefrequentieresultaten te normaliseren op cellevensvatbaarheid.
Gebruikte methoden
- Elke twee dagen chronologische verouderingsculturen bemonsteren.
- Levendbaarheid beoordelen door middel van kolonievormende eenheid (CFU) vorming.
- Cellen plateren op mutatiespecifiek selectiemedium.
- Spontane mutatiefrequentie en chromosomale herschikkingen meten.
Belangrijkste resultaten
- Veranderingen in DNA-mutaties werden waargenomen tijdens chronologische veroudering.
- Specifieke mutaties gelinkt aan veroudering werden geïdentificeerd.
- Resultaten duiden op een correlatie tussen genomische instabiliteit en levensduur.
- Verschillende giststammen vertoonden verschillende mutatiefrequenties.
Conclusies
- De ontwikkelde tests zijn effectief voor het bestuderen van genomische instabiliteit bij veroudering.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de mechanismen die veroudering en genomische instabiliteit verbinden.
- Deze benadering kan worden toegepast op verder onderzoek op het gebied van veroudering.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to mechanistically de-risk aging-related targets by linking genomic instability to lifespan phenotypes in a genetically tractable system. It supports predictive confidence in target validation by quantifying age-dependent DNA damage outputs that correlate with mammalian carcinogenesis pathways. The yeast chronological lifespan model provides a scalable, reproducible platform for early discovery screening of compounds or genetic modifiers affecting genome maintenance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses linking aging pathways to DNA mutation accumulation and chromosomal instability.
- Operational Value: Functionally validate targets involved in DNA repair, recombination, and lesion synthesis using yeast genetic models.
- Scientific Value: Support predictive confidence by measuring base substitutions, frameshifts, GCRs, and recombination as quantitative biomarkers of genomic integrity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepare validated biological systems for downstream compound screening by establishing age-stratified yeast cultures with known mutation profiles.
- Operational Value: Enable assay standardization and reproducibility through CFU-normalized mutation frequency readouts across aging timepoints.
- Operational Value: Support screening readiness and platform reuse via simple selection media (canavanine, 5-FOA, tryptophan, lysine, histidine) compatible with high-throughput plating.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Align yeast genomic instability readouts with disease-relevant systems by modeling conserved mechanisms of translesion synthesis and homologous recombination.
- Operational Value: Ensure translational continuity from discovery through preclinical validation by tracking mutation frequency changes that parallel mammalian aging phenotypes.
- Scientific Value: Facilitate risk-adjusted advancement decisions by identifying genetic modifiers that suppress age-dependent mutagenesis and extend chronological lifespan.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification by providing mechanistic insights into genome maintenance pathways that influence cellular longevity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of aging-related genes (e.g., TOR, Sch9, Ras2) in modulating DNA damage accumulation and repair fidelity.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via mutation-specific plating and viability normalization for compound or strain comparison.
- Analytics: Enables comparative analysis of DNA repair activity through nuclear extract-based translesion synthesis assays using defined DNA templates.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling conserved genomic instability mechanisms observed in mammalian aging and cancer.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for longitudinal study of genetic or pharmacological interventions on genome stability across the aging timeline.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through mechanistic de-risking of genomic instability contributors to aging phenotypes.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of mutation frequency measurements normalized to viable cell counts.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by linking target modulation to reduced mutagenesis and extended lifespan in a conserved model system.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of aging-related targets based on their impact on DNA maintenance pathways and genomic fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics, chronological lifespan maintenance, and mutation assay design.
- Dependent on incubation infrastructure for 30°C shaking cultures and plate-based selection assays.
- Necessitates cross-team standardization of dilution factors, plating densities, and viability normalization protocols.
- Involves adaptation considerations when translating yeast-specific readouts (e.g., canavanine resistance) to mammalian surrogate endpoints.
- Practical limitations include extended assay duration (11–13 days) and reliance on genetic markers for specific mutation types.
