Waarom is het selectief doden van extracellulaire bacteriën belangrijk voor targetvalidatie?

Selectieve eliminatie van extracellulaire bacteriën door lysostafine zorgt ervoor dat alleen intracellulaire pathogenen worden gekwantificeerd, waardoor overschatting van de antimicrobiële effectiviteit wordt voorkomen. Dit onderscheid is cruciaal voor de validatie van targets die betrokken zijn bij intracellulaire overlevingspaden. Het maakt een nauwkeurige beoordeling mogelijk van verbindingen die specifiek binnen gastheercellen werken, wat bijdraagt aan een betrouwbare target de-risking in de vroege ontdekkingsfase.

Hoe past de isolatie van de onafhankelijke variabele (extracellulaire bacteriën) in de discovery pipeline?

Door lysostafine te gebruiken om extracellulaire bacteriën te isoleren en te verwijderen als gecontroleerde variabele, verduidelijkt de assay de bijdrage van de intracellulaire bacteriële belasting aan infectie-fenotypes. Deze isolatie stelt onderzoekers in staat om veranderingen in CFU-aantallen direct toe te schrijven aan testverbindingen of genetische manipulaties. Het ondersteunt mechanische risicoreductie door verstorende extracellulaire effecten in doelvalidatiestudies te elimineren.

Wat maken kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabele (CFU-tellingen) mogelijk bij antimicrobiële screening?

Kwantitatieve CFU-metingen na lysis van de gastheercel bieden een dosis-respons-uitlezing van de intracellulaire bacteriële belasting, waardoor een directe vergelijking van de potentie van verbindingen mogelijk is. Deze metingen ondersteunen het genereren van dosis-respons-curves en de berekening van EC50-waarden voor lead-optimalisatie. Het kwantitatieve karakter van de assay faciliteert de transitie van hit-to-lead door verbindingen met een statistisch significante intracellulaire activiteit te identificeren.

Waarom zijn replicatie-eisen van belang voor cross-functionele samenwerking bij deze assay?

Replicatie over putjes en experimenten waarborgt de betrouwbaarheid van de gegevens, wat essentieel is voor de afstemming tussen de teams voor microbiologie, farmacologie en genezalfmetabolisme. Consistente resultaten van intracellulaire CFU vergroten het vertrouwen in de overdraagbaarheid van de assay tussen locaties en projecten. Gestandaardiseerde replicatie ondersteunt preklinische studies ter ondersteuning van regelgevende procedures door de robuustheid en reproduceerbaarheid van de assay aan te tonen.

Welke statistische analysemogelijkheden zijn vereist voordat deze assay wordt geïmplementeerd in lead-identificatie?

Implementatie vereist de mogelijkheid om statistische vergelijkingen (bijv. t-toetsen, ANOVA) uit te voeren tussen behandelingsgroepen om significante verschillen in de intracellulaire bacteriële belasting te bepalen. De assay ondersteunt de berekening van het gemiddelde aantal CFU, de standaarddeviatie en de variatiecoëfficiënt voor kwaliteitscontrole. Deze mogelijkheden zijn noodzakelijk om de sensitiviteit van de assay vast te stellen, drempelwaarden voor hits te definiëren en datagestuurde go/no-go beslissingen in screeningscampagnes te ondersteunen.

Lysostaphin-Based Enzyme Protection Assay: An In Vitro Method to Quantify Intracellular Staphylococcus aureus Load by Enzyme-Mediated Selective Killing of Extracellular Bacteria

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biologische Technieken

0 weergaven • 4:04 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Begin with a monolayer of epithelial cells in a suitable culture medium. These cells express integrins - membrane-spanning surface receptors. The culture media contains epithelial cell-secreted fibronectin - a glycoprotein.

Add a suspension of Staphylococcus aureus - a gram-positive pathogenic bacteria - to the culture plate. These bacteria contain fibronectin-binding proteins, or FnBPs, anchored in their cell wall.

Incubate the plate to initiate bacterial infection, wherein the fibronectin binds to the bacteria's FnBP and the integrins on the epithelial host cells. This tripartite FnBP-fibronectin-integrin interaction mediates bacterial internalization in the host.

Treat the cells with lysostaphin - an endopeptidase enzyme - and incubate. Lysostaphin selectively enters the cell walls of extracellular bacteria. It cleaves the pentaglycine bridges in the peptidoglycans, thereby lysing them while the intracellular bacteria remain protected from lysostaphin.

Supplement the culture with a proteolytic enzyme to deactivate the remaining lysostaphin, preventing it from killing the intracellular bacteria in the steps.

Add a lysis buffer to the culture, which ruptures the host epithelial cells and releases intracellular bacteria in the cell lysate. Subsequently, plate the cell lysate containing bacteria on a suitable culture plate and incubate.

The bacteria grow and multiply to form bacterial colonies, which can be analyzed to estimate the extent of bacterial internalization in the host cells.

Before cell inoculation, observe every well of the 24-well plate by low magnification microscopy to ensure that the cells are healthy and growing as expected. Then, remove and discard the spent cell culture medium from the 24-well plate, and add 500 microliters of the bacterial suspension to each well containing 100% confluent cells. Incubate the cells for 2 hours at 36 degrees Celsius and 5% carbon dioxide.

To quantify the intracellular bacteria with the improved enzyme protection assay, prepare 4X lysis buffer, 2% Triton X-100, trypsin-EDTA, and lysostaphin stock and working solutions as mentioned in the text manuscript.

Next, prepare 6.25 milliliters of complete infection medium supplemented with lysostaphin, by adding 6 milliliters of complete infection medium to 250 microliters of the lysostaphin working solution. Then, add 250 microliters of the complete infection medium supplemented with lysostaphin into each well, and gently agitate the plate by swiveling the plate by hand.

To allow the lysostaphin to kill the extracellular bacteria, incubate the cells for 1 hour at 36 degrees Celsius and 5% carbon dioxide. Then, inactivate the lysostaphin by adding 10 microliters of proteinase K at 20 micrograms per milliliter into each well, and incubating the cells for 2 minutes at room temperature.

Gerelateerde video's

0 Bekeken

Laatst bijgewerkt: 15 augustus 2026

Lysostaphin-Based Enzyme Protection Assay: An In Vitro Method to Quantify Intracellular Staphylococcus aureus Load by Enzyme-Mediated Selective Killing of Extracellular Bacteria

Overzicht

Belangrijke studiecomponenten

Wetenschappelijk gebied

Achtergrond

Doel van de studie

Gebruikte methoden

Belangrijkste resultaten

Conclusies

Veelgestelde vragen

Industriële Relevantie voor Management

Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D

Vroege ontdekking & targetvalidatie

Screening & Assayontwikkeling

Translationeel & Preklinisch Onderzoek

Integratie van Pipeline & Workflow

Operationele & Bedrijfsimpact

Overwegingen bij de implementatie

Veelgestelde vragen over biopharma

Studeren Interacties van Staphylococcus aureus Met Neutrofielen door flowcytometrie en Time Lapse Microscopie

Een In Vitro Model voor het bestuderen van het Effect van Fotodynamische therapie 5-Aminolevulinic Zuur-gemedieerde op Staphylococcus aureus Biofilm

Kwantificeren van de cytotoxiciteit van Staphyloccus aureus tegen menselijke polymorfonucleaire leukocyten

An Assay for Bacterial Extracellular Protein-Mediated Cytotoxicity on PMNs

Cytotoxicity Assay of Staphylococcus aureus Strains on Neutrophils following Phagocytosis

A Peg Plate Biofilm Assay for Screening Antibacterial Agents

Stress-geïnduceerde antibiotica gevoeligheid testen op een chip

Kwalitatieve en Kwantitatieve Testen voor detectie en karakterisering van proteïne Antimicrobials

Gericht op biofilm geassocieerde Staphylococcus aureus Met behulp van Resazurin Gebaseerd Drug-gevoeligheid Assay

Verbeterde enzymbeschermingstest om staphylococcus aureus internalisatie en intracellulaire werkzaamheid van antimicrobiële verbindingen te bestuderen