Using Immuno-RNA Fluorescence In Situ Hybridization to Visualize SARS-CoV-2
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 weergaven • 2:59 min • July 8th, 2025
Loading...
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het detecteren van viraal RNA in met coronavirus geïnfecteerde Vero-cellen met behulp van hybridisatiekettingreactie (HCR). De techniek maakt gebruik van fluorescentielabel probes om signalen te versterken voor visualisatie onder een fluorescentiemicroscoop.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Virologie
Achtergrond
- Vero-cellen zijn een interferon-deficiënte zoogdiercellijn.
- Viraal RNA komt in de gastheer voor als subgenomische RNA's (sgRNA's).
- HCR is een methode die signaalversterking bij RNA-detectie mogelijk maakt.
- Fluorescerende probes maken visualisatie van specifieke RNA-targets mogelijk.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het detecteren van coronavirus-RNA in geïnfecteerde cellen.
- Het visualiseren van de aanwezigheid van viraal RNA met behulp van fluorescentiemicroscopie.
- Het verhogen van de sensitiviteit van RNA-detectie door middel van signaalamplificatie.
Gebruikte methoden
- Gefixeerde en gepermeabiliseerde Vero-cellen werden voor het experiment gebruikt.
- Hybridisatiekettingreactie (HCR) initiator-sondes werden ingezet.
- Fluorescent gelabelde oligonucleotide hairpin-sondes werden geïntroduceerd.
- Antilichamen werden gebruikt om het cytoskelet van de gastheercel te visualiseren, en DAPI werd gebruikt voor kernkleuring.
Belangrijkste resultaten
- Virus-geïnfecteerde cellen vertoonden rode fluorescentie in het cytoplasma.
- De methode versterkte succesvol de signalen rondom het doel-RNA.
- Fluorescentiemicroscopie maakte een duidelijke visualisatie van viraal RNA mogelijk.
- Het protocol bood een robuuste aanpak voor RNA-detectie in cellen.
Conclusies
- De HCR-methode is effectief voor het detecteren van viraal RNA in geïnfecteerde cellen.
- Deze techniek verhoogt de gevoeligheid en specificiteit van RNA-visualisatie.
- De studie draagt bij aan het begrip van virale infecties op moleculair niveau.
Veelgestelde vragen
Wat zijn Vero-cellen?
Vero-cellen zijn een type cellijn afgeleid van de nier van een Afrikaanse groene aap, die veelvuldig wordt gebruikt in virologisch onderzoek.
Wat is hybridisatiekettingreactie (HCR)?
HCR is een methode die wordt gebruikt om signalen voor RNA-detectie te versterken, waardoor een verbeterde visualisatie van specifieke RNA-targets mogelijk is.
Hoe werkt de fluorescentielabeling in deze methode?
Fluorescentie-gelabelde probes binden aan het doel-RNA en het HCR-proces versterkt het signaal, waardoor dit zichtbaar wordt onder een fluorescentiemicroscoop.
Wat is het belang van het gebruik van DAPI in deze studie?
DAPI is een fluorescente kleurstof die bindt aan DNA, waardoor celkernen gevisualiseerd kunnen worden in combinatie met RNA-detectie.
Wat zijn de implicaties van dit onderzoek?
Dit onderzoek biedt inzichten in virale infecties en verbetert technieken voor het bestuderen van RNA in diverse biologische contexten.
Industriële Relevantie voor Managers
Hybridization Chain Reaction (HCR)-FISH in combinatie met immunofluorescentie maakt ruimtelijk opgeloste detectie van subgenomisch SARS-CoV-2 RNA in geïnfecteerde cellen mogelijk, wat mechanistische studies naar gastheer-virusinteracties ondersteunt. Deze benadering verhoogt het voorspellende vertrouwen bij vroege ontdekkingen door kwantitatieve data op enkelcelniveau te leveren over de lokalisatie van viraal RNA. De methode is geschikt voor portfoliotriage en targetvalidatie in onderzoekslijnen voor infectieziekten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking en targetvalidatie
- Maakt directe visualisatie van viraal RNA mogelijk om infectiemechanismen op cellulair niveau te onderzoeken.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door gastheer-pathogeen-interacties en virale replicatieplaatsen te verduidelijken.
- Levert functioneel bewijs voor targetvalidatie in antiviraal onderzoek.
- Vergemakkelijkt de voorspellende betrouwbaarheid bij het selecteren van relevante cellulaire modellen voor verdere studie.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde celgebaseerde systemen voor voor downstream compound screening-workflows.
- Levert robuuste, kwantitatieve fluorescentiesignalen voor assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid.
- Stelt high-content imaging-platforms in staat om antivirale effectiviteit op enkelcelniveau te evalueren.
- Ondersteunt een betrouwbare evaluatie van compound-effecten op de lokalisatie en abundantie van viraal RNA.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante systemen door SARS-CoV-2-infectie in zoogdiercellen te modelleren.
- Biedt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie via kwantitatieve RNA-detectie.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling door moleculaire read-outs te koppelen aan fenotypische uitkomsten.
- Biedt mechanische risicoreductie voor de ontwikkeling van translationele biomarkers in pipelines voor infectieziekten.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek door hypothesetoetsing, kwantitatieve read-outs en assay-gereedheid voor antiviraal onderzoek mogelijk te maken.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesegestuurde analyse van virale replicatie en de respons van de gastheer.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve fluorescentie-outputs voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytiek: Levert ruimtelijke en kwantitatieve metingen van viraal RNA voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Slaat de brug tussen ontdekkingsbevindingen en preklinische modellen door moleculaire eindpunten te valideren.
- Bedrijfsmæssig hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor RNA-visualisatie voor diverse virale targets.
Operationele en ondernemingsbrede impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van virale targets.
- Operationele waarde: Standaardiseert RNA-detectieworkflows voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalefficiëntie in antivirale portfolio's.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van antivirale kandidaten mogelijk op basis van kwantitatieve cellulaire read-outs.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiemicroscopie en RNA-hybridisatietechnieken.
- Toegang tot hoogwaardige beeldvormingsinstrumenten en analyse-software is noodzakelijk.
- Standaardisatie van sonde-ontwerp en beeldvormingsprotocollen tussen teams is vereist.
- Aanpassing voor verschillende celtypen of virale targets kan noodzakelijk zijn.
- Optimale resultaten zijn afhankelijk van de kwaliteit van de monstervoorbereiding en de specificiteit van de sonde.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Waarom is het testen van de nulhypothese cruciaal voor de validatie van HCR-FISH-targets?
Het testen van de nulhypothese garandeert dat waargenomen fluorescentiesignalen van HCR-FISH statistisch significant zijn en niet het gevolg zijn van achtergrondruis of aspecifieke binding, wat bijdraagt aan een robuuste validatie van targets in antiviraal onderzoek.
Hoe verbetert de isolatie van onafhankelijke variabelen de workflows voor de detectie van SARS-CoV-2 RNA?
Het isoleren van variabelen, zoals de probeconcentratie en incubatiecondities, stelt teams in staat om veranderingen in het fluorescentiesignaal specifiek toe te schrijven aan de aanwezigheid van viraal RNA, wat het vertrouwen in de workflow-optimalisatie en de betrouwbaarheid van de assay vergroot.
Wat maken kwantitatieve fluorescentiemetingen mogelijk in studies naar viraal RNA?
Kwantitatieve fluorescentiemetingen leveren objectieve gegevens over de abundantie en lokalisatie van viraal RNA, waardoor vergelijkende analyses tussen experimentele condities mogelijk worden en datagestuurde besluitvorming in de vroege ontdekkingsfase wordt ondersteund.
Waarom zijn replicatie-eisen belangrijk voor de ontwikkeling van cross-functionele assays?
Replicatie zorgt ervoor dat HCR-FISH-resultaten reproduceerbaar zijn tussen verschillende operators en laboratoria, wat crossfunctionele samenwerking en standaardisatie in assay-ontwikkelingspipelines faciliteert.
Welke statistische analysecapaciteiten zijn vereist vóór de implementatie van HCR-FISH bij screening?
Robuuste statistische analyse is vereist om signaal-ruisverhoudingen te beoordelen, de gevoeligheid van de assay te bepalen en de reproduceerbaarheid van fluorescentie-uitlezingen te valideren voordat HCR-FISH in screening-workflows wordt geïntegreerd.
08:26
Transcriptionele Analyse van ontluikende RNA FISH van In Vivo Trofoblast Giant Cells of In Vitro Korte termijn culturen van Ectoplacental Cone Explantaten
Gerelateerde video's
0 Bekeken
06:44
Confocale beeldvorming van Double-Stranded RNA en patroon erkenning receptoren in negatief-Sense RNA-virusinfectie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
08:58
RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om microbiële kolonisatie en infectie in caenorhabditis elegans darmen te visualiseren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
20:47
Een techniek om tegelijkertijd Visualiseer virus-specifieke CD8 + T-cellen en virus-geïnfecteerde cellen In situ
Gerelateerde video's
0 Bekeken
10:16
Detectie van virale RNA door fluorescentie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
13:22
Detectie van het genoom en de transcripties van een persistente DNA Virus in neuronale weefsels door Fluorescent In situ Hybridisatie Gecombineerd met Immunokleuring
Gerelateerde video's
0 Bekeken
05:23
Visualisatie van SARS-CoV-2 met behulp van Immuno RNA-Fluorescentie In Situ Hybridisatie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
10:25
Detectie van SARS-CoV-2 neutraliserende antilichamen met behulp van high-throughput fluorescerende beeldvorming van pseudovirusinfectie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
07:08
Een Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG en IgM SARS-CoV-2 Neutralisatie assay voor een Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System
Gerelateerde video's
0 Bekeken
08:41
Live beeldvorming en kwantificering van virale infectie bij K18 hACE2 transgene muizen met reporter-expressing recombinant SARS-CoV-2
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026