Name: Organotypische Collageen I Assay: een Smeedbaar Platform to Cell Gedrag beoordelen in een 3-dimensionale Context (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Leer een driedimensionaal collageenmatrixassay met fibroblasten om celmigratie en tumorcelinvasie te bestuderen. Deze methode bootst weefselstroma na en is geschikt voor fluorescentiemicroscopie en immunohistochemie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Oprichting van fibroblast culturen van de huid explantaten <ol><li> 4 mm stansbiopsieën verkregen uit menselijk onderarm worden in MEM aangevuld 100 eenheden / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 0,25 ug / ml Fungizone. </li><li> Trim alle spek en fijn de biopsie in kleine stukjes snijden door tuimelen een aantal 24 scalpelmes tegen de bodem van de petrischaal. </li><li> Plaats weefsel slurry in een 25 cm2 weefselkweekfles met primaire fibroblast groei media (MEM aangevuld met 10% FCS, 100 units / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 25 ug / ml Fungizone) toegevoegd totdat het oppervlak van cuvet bedekt maar vloeibaar diepte onvoldoende is voor weefsel te zweven. </li><li> Na 3 dagen incubatie bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2, 3 ml primair fibroblast groei media. </li><li> Na nog eens 3 dagen incubatie veranderingsmedia met verse primaire fibroblast growth media of cells zijn bijna confluent zij 01:04 worden gesplitst in nieuwe media. (Fungizone kan worden weggelaten vanaf dit punt). </li></ol> 2. Fase I - Voorbereiding van collageen I van rat staart Opmerking: Protocol voor ongeveer 12-14 adolescent (vers of bevroren) rat staarten <ol><li> Bereid rattenstaart door wassen in 70% ethanol en verwijder pezen als volgt: </li><li> Verwijder het vel van rattenstaart door het snijden in het midden van de staart van boven naar beneden met een scalpel en pellen langs de lengte van de staart. </li><li> Maak pees uit de kern van het proximale gebied van de staart. </li><li> Verwijder pees naar het distale gebied van de staart vermijden mantel met getande forceps. </li><li> Extract 1 g van pees / 250 ml 0,5 M azijnzuur door roeren bij 4 ° C gedurende 48 uur. </li><li> Centrifugeer het extract (7.500 xg) gedurende 30 minuten en gooi de pellet. </li><li> Voeg een gelijk volume van 10% (w / v) NaCl aan de supernatant en roer gedurende 30-60 minuten. </li><li centrifuge xg gedurende minuten verwijder het supernatant en opnieuw oplossen van precipitaat in m azijnzuur bij verhouding door roeren uur c.><li> Dialyseer de collageenoplossing tegen veranderingen van 6-8 6L ~ 17,5 mM azijnzuur (1 ml ijsazijn per liter koud water, change 2 x daags). </li><li> Centrifugeer gedialyseerd collageen bij 30.000 xg gedurende 1,5 uur. </li><li> Verwijder supernatant en plaats in steriele kolf. </li><li> Stel de collageen I ~ concentratie 2 mg / ml met 0,5 mM azijnzuur bij 4 ° C. </li></ol> 3. Fase II - Het opzetten van de 3D-matrix met ingebouwde fibroblasten (laten contracteren voor 8 dagen). <ol><li> Monteer het mengsel met koud reagentia bij 4 ° C in een vooraf gekoelde fles. Houd collageen I op ijs. </li><li> Voor een T75 fles van confluente primaire fibroblasten (~ aantal cellen 1 x 10 6) gebruik: <ul><li> 25 ml rattenstaart collageen (ca. conc 2mg/ml) </li><li> 3 ml 10xMEM </li><li> 0,22 M NaOH: ten eerste, voeg 2 ml, dan druppelsgewijs onder roeren, totdat het collageen wordt oranje, </li><li> maar niet roze (meestal maximaal 3 ml). Geschatte p H = 7,2. </li><li> Opmerking: Het is belangrijk dat de medium / gel blijft neutraal of enigszins zure fibroblasten niet samentrekken de gel bij blootstelling zelfs licht alkalische omstandigheden. </li></ul></li><li> Trypsinise de fibroblasten, draaien op 400 xg gedurende 5 minuten en verwijder supernatant. </li><li> Gedurende 5 minuten laten draaien boven: Bereid 12 x 35 mm plastic schaaltjes - normaal 12 gerechten bereiken van een fles van fibroblasten / collageen mix. </li><li> Resuspendeer fibroblasten in 3 ml FCS en onmiddellijk toe te voegen aan het collageen mix en roer. </li><li> Plaat ongeveer 2,5 ml van collageen / fibroblast per schaal zo snel mogelijk. Proberen bellen en collageen omgeving voorkomen. </li><li> Laat de collageen bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 in lucht gedurende 10 minuten. </li><li> Voeg 1 ml fibroblast groeith media (DMEM + 10% FCS). </li><li> Maak de collageen / fibroblast matrix van de wanden van de capsule met een pipet. </li><li> Volgende dag: Voeg 1 ml fibroblast groei media (DMEM + 10% FCS). </li><li> Wijzig media om de andere dag. Toestaan ​​collageen / fibroblast matrix contract ongeveer 8 dagen, totdat ze passen in een 24-wells schaal (Contractie van ~ 3,5 cm tot 1,5 cm in diameter, zie figuur 1). </li></ol> Opmerking: De concentratie collageen moet worden aangepast aan de toepassing. Hoe meer Verdun de collageen-oplossing, hoe sneller het zal worden gecontracteerd door de fibroblasten. Kleine verschillen in krimp percentage wordt ervaren met verschillende batches van collageen bij dezelfde concentratie. Ook verschillende fibroblastculturen de collageen gels met verschillende snelheden samentrekken en meer fibroblasten presenteren, hoe sneller de snelheid van contractie. Concentratie en fibroblast collageen dichtheid kan derhalve aangepast aan de snelheid van contractie wijzigenen de uiteindelijke dichtheid van de collageen gel. 4. Fase II - Plating cellen plaats bovenop de matrix Let op: Steriliseer alle tangen en apparatuur met ethanol voor gebruik. <ol><li> Met behulp van stompe tang, beweeg gecontracteerde matrix 24-well schotel. Zorg ervoor dat dit niet het geval vouwen. </li><li> Bereid suspensie van cellen plaats bij ongeveer 4 x 10 4 / ml en 1 ml plaat (na trypsinising, spin cellen te ontdoen van trypsine) bovenop de matrix. Werkelijke aantal benodigde cellen afhankelijk van de gebruikte celtype. Celmedium moet normaal kweekmedium voor de cellen van belang. </li><li> Toestaan ​​cellen tot confluentie groeien bovenop de matrix, ongeveer 3-5 dagen. </li></ol> 5. Fase III - Overdracht van de matrix om een ​​rooster voor een invasie (ongeveer 0 tot 21 dagen) <ol><li> Snijd roestvrij stalen roosters op een statief te maken en voor autoclaaf te gebruiken (zie figuur 2). </li><li> Plaats steriele net in6 cm schaaltje, voeg groeimedia tot boven het rooster (circa 10.5ml). Plaats matrix op het net en Zuig media zodat de onderkant van de matrix in contact met media, maar niet ondergedompeld. Dit wordt aangeduid als de lucht / vloeistof interface, die een verloop dat invasie bevordert creëert. Vervang medium om de twee dagen (zie figuur 2). </li><li> Levende cellen kunnen contextuele beeldvorming met fluorescerende cellen worden afgebeeld in dit stadium of eerder. De gecontracteerde of collagenen I kunnen worden afgebeeld met behulp van tweede harmonische generatie (SHG, zie figuur 3). Multi-fotonexcitatie gecombineerd met breedveld detectie we dat SHG kan ten minste 100 urn worden afgebeeld in de matrix, terwijl cellen die GFP cytoplasmatische kan worden afgebeeld ten minste 200 um diep. </li></ol> Opmerking: Met betrekking tot de kwantificering van invasie, de dag waarop matricies worden geplaatst op de roosters definieert dag 0. Plaatsing op roosters genereert een helling van celcultuur media die invasie int bevordert o de matrix. Monsters kunnen worden afgebeeld op de volgende 1 - 21 dagen (of langer) om biologische processen zoals invasie, proliferatie, overleving of differentiatie (zie referentielijst) beoordelen. 6. Fase IV - Fixatie <ol><li> 5 ml van 4% PFA in een Falcon buis. </li><li> Breng de matrix op een vlakke ondergrond. Snijd de matrix in de helft met een frisse schone scalpel (zoals u zult de doorsnede zich vlekken), tilt u de matrix met scalpel en transfer naar 4% PFA, fix 's nachts. </li><li> Organotypische matrices zijn nu klaar om vlek met antilichaam / naar keuze vlek (zie figuur 3). </li></ol> 7. Representatieve resultaten: <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3089/3089fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1 Voorbeeld van fibroblast-gecontracteerde collageen I. Mengsel van fibroblast en rattenstaart collageen los van de petrischaal en mogen contracteren meer dan 6-8 dagen. Figuur 2 "src =" / files/ftp_upload/3089/3089fig2.jpg "/&gt; Figuur 2 Organotypische assay progressie. Een schematische opzet van organotypische en progressie. B, Voorbeeld van collageen / fibroblast matrix bovenop roestvrij staal, steriel raster lucht / vloeistof interface. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3089/3089fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3 Toepassingen van organotypische assay. A, B niet-invasieve en invasieve pancreas ductaal adenocarcinoom (PDAC) cellen binnen te vallen na verloop van tijd met organotypische matrix. C, levende huid gelijk met een gestratificeerde epidermis op een fibroblast-gecontracteerde collagene dermale component. D, binnendringende C8161 melanoomcellen zijn om een fibroblast -gecontracteerd collagene dermale equivalent. E, invasieve PDAC cellen (groen) interactie en binnenvallen met fibroblasten (rood) binnen de organotypische matrix. F

<ol><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li>
<li>Edward, M., Gillan, C., Micha, D., Tammi, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+regulation+of+fibroblast+hyaluronan+expression%3A+a+mechanism+to+facilitate+tumour+growth+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Tumour regulation of fibroblast hyaluronan expression: a mechanism to facilitate tumour growth and invasion.</a> Carcinogenesis. 26, 1215-1223 (2005).</li>
<li>Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+human+breast+cancer+cells+in+vivo+requires+both+paracrine+and+autocrine+loops+involving+the+colony-stimulating+factor-1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Invasion of human breast cancer cells in vivo requires both paracrine and autocrine loops involving the colony-stimulating factor-1 receptor.</a> Cancer Res. 69, 9498-9506 (2009).</li>
<li>Serrels, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+study+of+E-cadherin+and+membrane+dynamics+in+living+animals%3A+implications+for+disease+modeling+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time study of E-cadherin and membrane dynamics in living animals: implications for disease modeling and drug development.</a> Cancer Res. 69, 2714-2719 (2009).</li>
<li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li>
<li>Edward, M., Quinn, J. A., Pasonen-Seppanen, S. M., McCann, B. A., Tammi, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Methylumbelliferone+inhibits+tumour+cell+growth+and+the+activation+of+stromal+hyaluronan+synthesis+by+melanoma+cell-derived+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">4-Methylumbelliferone inhibits tumour cell growth and the activation of stromal hyaluronan synthesis by melanoma cell-derived factors.</a> Br. J. Dermatol. 162, 1224-1232 (2010).</li>
<li>Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+characteristics+of+transformed+keratinocytes+from+mouse+and+human+skin+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation characteristics of transformed keratinocytes from mouse and human skin in vitro and in vivo.</a> J. Invest. Dermatol. 81, 168s-175s (1983).</li>
<li>Nystrom, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J. Pathol. 205, 468-475 (2005).</li>
<li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs%3A+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J. Cell. Biol. 185, 11-19 (2009).</li>
<li>Amjad, S. B., Carachi, R., Edward, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte+regulation+of+TGF-beta+and+connective+tissue+growth+factor+expression%3A+a+role+in+suppression+of+scar+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte regulation of TGF-beta and connective tissue growth factor expression: a role in suppression of scar tissue formation.</a> Wound Repair Regen. 15, 748-755 (2007).</li>
<li>Gaggioli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-led+collective+invasion+of+carcinoma+cells+with+differing+roles+for+RhoGTPases+in+leading+and+following+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells.</a> Nat. Cell. Biol. 9, 1392-1400 (2007).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Hier wordt een werkwijze voor productie van een 3-dimensionale matrix geschikt voor studies van invasieve celmigratie 6-8. De matrix bestaat uit collageen type 1 fibrillen, die gesloten gedurende verscheidene dagen door primaire humane epidermale fibroblasten. Het collageen wordt bereid door zure extractie, niet enzymatische digestie, die reactiviteit behoudt de poly-peptide uiteinden en bevordert verknoping van collageenvezels in grotere aggregaten na neutralisatie van bufferomstandigheden 9. Dit resulteert in een gereconstitueerd gel die de eigenschappen van collageen beter nabootst in vivo en heeft grote gevolgen voor de invasieve eigenschappen van cellen gekweekt in de gels. Het maakt niet uit of vers of bevroren uitgangsmateriaal wordt gebruikt, maar het gebruik van adolescente ratten staart is belangrijk, omdat collageen cross-linking is meer labiel bij jongere dieren. Collageen I van jongere dieren is dan ook makkelijker uit te pakken naar, en re-vormt wet een hogere geluidskwaliteit. Het collageen matrix kan worden gefixeerd en gekleurd met antilichamen gericht tegen invasieve tumorcellen of stromale fibroblasten 2,10 en zijn zeer nuttig voor het testen van de werkzaamheid van geneesmiddelen die invasie 5,6 kunnen staan. Hoewel dit protocol stelt het gebruik van primaire menselijke huidfibroblasten, is het mogelijk om primaire fibroblasten uit andere weefseltypen, afhankelijk van het type weefsel dat wordt onderzocht. Het is ook mogelijk na te gaan kweken met geïmmortaliseerde fibroblasten, inclusief cellen die stabiel zijn getransfecteerd met fluorescerend eiwit conjugaten. Op deze wijze zowel stromale cellen en tumorcellen kunnen gelabeld cel-cel interacties visualiseren tijdens invasie 11.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogusnummer </th><th> Opmerkingen (optioneel) </th></tr><tr><td> 10x MEM </td><td> Gibco </td><td> 21430 </td><td> - </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> 367176-500G </td><td> Bereid 0,22 M voorraad in water </td></tr><tr><td> FCS </td><td> PAA Laboratories </td><td> A15-101 </td><td> - </td></tr><tr><td> 35 mm schalen </td><td> Valk </td><td> 353001 </td><td> Voor stap 3.4 </td></tr><tr><td> 60 mm schalen </td><td> Valk </td><td> 353004 </td><td> Voor stap 5.2 </td></tr><tr><td> Spring pincet stompe </td><td> Samco </td><td> E003/02 </td><td> Getande, niet glad </td></tr><tr><td> 16% paraformaldehyde </td><td> Electron Microscopy Services </td><td> 15710 </td><td> Verdun tot 4% in PBS voorafgaand aan gebruik </td></tr><tr><td> Schermen voor cd-1, maat 40 mesh </td><td> Sigma </td><td> S07707-5EA </td><td> Roestvrij stalen roosters, 5 per pak </td></tr><tr><td> Dialysebuis </td><td> Medicell International </td><td> 7607 2295 </td><td> 12 tot 14 kD </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Oxoid </td><td> BR0014G </td><td> - </td></tr><tr><td> Azijnzuur </td><td> Sigma </td><td> 242853 </td><td> - </td></tr><tr><td> 24 goed gerecht </td><td> Valk </td><td> 353047 </td><td> Voor stap 4.1 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> In Vitrogen </td><td> 15290018 </td><td> - </td></tr></tbody></table>

organotypische collageen i assay: een smeedbaar platform to cell gedrag beoordelen in een 3-dimensionale context

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Celmigratie fundamenteel is voor vele aspecten van de biologie, zoals ontwikkeling, wondgenezing, de cellulaire responsen van het immuunsysteem, en metastase van tumorcellen. Migratie onderzocht op dekglaasjes om cellulaire dynamica vatbaar voor onderzoek maken met lichtmicroscopie. Echter duidelijk geworden dat vele aspecten van celmigratie afhankelijk van de beschikbaarheid van de lokale omgeving zoals de elasticiteit, eiwitsamenstelling en poriëngrootteverdeling, niet nauwgezet worden vertegenwoordigd door stijve tweedimensionale substraten zoals glas en plastic 1. Verder heeft interactie met andere celtypen, waaronder stromale fibroblasten 2 en immuuncellen 3, is aangetoond dat een cruciale rol spelen in de invasie van kankercellen. Onderzoek op moleculair niveau steeds meer aanwijzingen dat moleculaire dynamica, inclusief respons op geneesmiddelen behandeling van identieke cellen significant verschillend in vergelijking <em&gt; In vitro en in vivo 4. Idealiter zou het best om celmigratie bestuderen in de natuurlijke context in levende organismen, maar dit is niet altijd mogelijk. Intermediate weefselkweeksystemen, zoals cel afgeleide matrix, matrigel, organotypische kweek (hier beschreven) weefselexplantaten, organoids en xenografts, zijn daarom belangrijk experimentele tussenproducten. Deze systemen bij benadering bepaalde aspecten van een in vivo omgeving, maar zijn meer ontvankelijk voor experimentele manipulatie zoals het gebruik van stabiel getransfecteerde cellijnen, medicamenteuze behandeling regimes, op lange termijn en hoge-resolutie beeldvorming. Deze tussenproducten zijn vooral bruikbaar als probes om testterreinen valideren en stellen parameters die voor beeld de dynamische respons van cellen en fluorescente reporters voor onderneming imaging in vivo 5. Als zodanig kunnen zij een belangrijke rol dienen in minder noodzakelijk experimenten living dieren.

Een methode wordt beschreven voor de bereiding van een 3-dimensionale matrix van collageen type I en primaire humane fibroblasten. Deze organotypische gel dient als nuttige substraat invasieve celmigratie beoordelen omdat het bootst basiskenmerken van weefsel stroma en vatbaar is voor vele vormen van microscopie.

Organotypische Collageen I Assay: een Smeedbaar Platform to Cell Gedrag beoordelen in een 3-dimensionale Context

Celmigratie is fundamenteel voor veel aspecten van de biologie, waaronder ontwikkeling, wondgenezing, de cellulaire responsen van het immuunsysteem en ...

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van een weefselachtige driedimensionale collageenmatrix om cel functies te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst collageen te extraheren uit rattenstaartpezen. Vervolgens worden de collageenvezels gereconstitueerd in aanwezigheid van fibroblasten, zodat de fibroblasten de collageengel kunnen doen samentrekken.In de derde stap worden de tumorcellen in de laatste fase op de matrix geplaatst. De matrix wordt geïncubeerd op een metalen rooster om een lucht-vloeistofinterface te creëren, waardoor invasie van de tumorcellen in de matrix mogelijk wordt. Ten slotte kunnen immunohistochemische kleuring en fluorescentiemicroscopie worden uitgevoerd om de synthese van de matrix en de celmigratie te analyseren, inclusief de invasie van tumorcellen en de interacties tussen verschillende celtypen.Deze methode is daarom bij uitstek geschikt voor het bestuderen van invasie en metastase, maar ook voor het bestuderen van tumorontwikkeling. Op een complexe driedimensionale S kunnen we aspecten onderzoeken zoals differentiatie, celoverleving en celgroei. In het bijzonder kunnen we kijken naar de wijze waarop tumorcellen interageren met het stroma tijdens cruciale fasen van de invasie.Een van de vroegste stappen bij kankermetastase zelf is het opzetten van fibroblastculturen uit huidimplantaten. Plaats eerst een paar druppels MEM, aangevuld met penicilline, streptomycine en fungizone, op de bodem van een Petrischaal. Plaats vervolgens punchbiopten van vier millimeter, afgenomen van een menselijke onderarm, in de schaal.Hak tenslotte het biopsaat in kleine stukjes door een scalpelblad nummer 24 tegen de bodem van de petrischaal te bewegen. Plaats het weefselmengsel in een weefselkweekfles van 25 centimeter squared. Giet vervolgens primair fibroblast-groeimedium over het weefsel.Dit is voldoende om het oppervlak van de kolf te bedekken, maar onvoldoende om het weefsel te laten drijven. Incubeer de kolf gedurende drie dagen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2, en voeg na nog eens drie dagen incubatie drie milliliter primair fibroblastgroeimedium toe. Vervang het medium door vers primair fibroblastgroeimedium.Als de cellen bijna confluent zijn, kunnen ze in een verhouding van één op vier worden overgeplaatst naar nieuwe kolfjes met vers medium. Begin met het wassen van de rattenstaarten in 70% Ethanol; koel een fles 0,5 molar azijnzuur af tot vier graden Celsius om de pezen uit de rattenstaarten te verwijderen. Verwijder vervolgens de huid van elke individuele rattenstaart.Koppel vervolgens de pees los van de kern van het proximale deel van de staart. Verwijder ten slotte de pees richting het distale deel van de staart met een pincet. Nadat de pezen zijn verwijderd, voegt u 250 milliliters 0,5 molar azijnzuur toe aan een glazen erlenmeyer.Extraheer één gram pees per 250 milliliter zuur door na extractie van de pees 48 uur lang te roeren bij vier graden Celsius. Centrifugeer de oplossing van zuur en pees 30 minuten lang bij 7.500 ×g bij vier graden Celsius en gooi vervolgens de pellet weg. Voeg daarna een gelijk volume 10% w/v NaCl toe aan het supernatant en roer na de tweede stap nog 30 tot 60 minuten.Centrifugeer de oplossing om een pellet te vormen. Deze keer bij 10,000 ×g, verwijder het supernatant en los het precipitaat opnieuw op in 0.25 M azijnzuur onder voortdurend roeren gedurende 24 uur bij 4 °C. Dialyseer vervolgens de collageenoplossing tegen zes tot acht wissels van 6 liter ongeveer 17.5 mM azijnzuur.Centrifugeer na de dialyse de collageenpellet bij 30,000 ×g gedurende 1,5 uur. Breng vervolgens het supernatant over in een steriele fles en pas de collageenconcentratie aan tot ongeveer 2 mg/mL met het vooraf gekoelde 0,5 mM azijnzuur, en bewaar het collageen daarna op ijs. Selecteer eerst drie T 75-flessen met confluente primaire fibroblasten.Plaats een container FCS bij vier degree Celsius om te koelen. Voeg vervolgens 75 milliliters van het eerder bereide rattenstaartcollageen toe aan een vooraf gekoelde steriele glazen fles van 100 milliliter. Voeg daarna negen milliliters 10 XMEM toe terwijl het mengsel wordt geroerd.Voeg zes milliliter 0,22 normaal natriumhydroxide toe, waarbij de toevoeging wordt vertraagd bij de laatste milliliter om ervoor te zorgen dat de uiteindelijke kleur tussen oranje en roze ligt. Behandel de fibroblasten met trypsine en pellet de cellen vervolgens bij 400 ×g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Assemble tijdens het centrifugeren 36 plastic schaaltjes van 35 millimeter. Resuspendeer het pellet in 10 milliliters van het vooraf gekoelde FCS en voeg de fibroblasten onmiddellijk toe aan het collageen. Meng en roer het mengsel, en verdeel zo snel mogelijk ongeveer 2,5 milliliters van het collageen-fibroblastmengsel per 35 millimeter schaaltje.Voorkom belletjes en het stollen van het collageen. Plaats de schaaltjes 10 minuten in de incubator zodat het collageen een losse gel kan vormen, en voeg vervolgens één milliliter fibroblast-groeimedium toe aan elk schaaltje. Los daarna de collageen-fibroblastmatrix met een pipet los van de wanden van het schaaltje en plaats de schaaltjes terug in de incubator.Voeg de volgende dag nog een milliliter Fiberblast-groeimedium toe aan de schaaltjes. Vervang daarna om de dag het medium gedurende de volgende acht dagen. Gedurende deze periode moet elke collageen-fibroblastmatrix in diameter krimpen van ongeveer 3,5 centimeter naar ongeveer 1,5 centimeter voordat u met de volgende stap begint; steriliseer alle pincetten en apparatuur met ethanol.Verplaats vervolgens met gest steriliseerde pincetten voorzichtig een gecontracteerde matrix naar een putje van een 24-wellplaat, waarbij u erop let dat de matrix niet dubbelvouwt. Selecteer daarna een kolf met te bestuderen cellen, trypsiniseer de cellen en pelletiseer deze zoals eerder beschreven; resuspendeer de cellen vervolgens in medium. Pipetteer één milliliter van de celsuspensie bovenop de matrix en plaats de gecontracteerde matrix in de incubator totdat de cellen bijna confluent zijn gegroeid op de bovenkant van de matrix. Ongeveer drie tot vijf dagen na het autoclaveren van vooraf gesneden roestvrijstalen rasters voor de creatie van tripods, plaatst u vóór gebruik een steriel raster in een plastic schaaltje van zes centimeter en voegt u voldoende groeimedium toe om het raster te bedekken.Het creëren van de lucht-vloeistofinterface is het meest delicate deel van deze procedure. De matrix moet op het rooster worden geplaatst, waarna het medium voorzichtig moet worden geaspireerd, zodat de matrix aan de onderzijde nog gedeeltelijk is ondergedompeld en van onderaf wordt gevoed. Dit creëert een chemotactische gradiënt en stelt de cellen aan de bovenzijde in staat om de matrix binnen te dringen.Het celgedrag in deze opstelling kan vervolgens gedurende 21 dagen of langer worden beoordeeld. Plaats een matrix op het rooster. Aspireer daarna voorzichtig het medium totdat de onderkant van de matrix in contact staat met het medium, maar er niet door wordt bedekt.De lucht-vloeistofgrensvlak zou er vervolgens vergelijkbaar uit moeten zien als in deze scène. Breng vervolgens een geïnfiltreerde matrix over naar een vlak oppervlak. Snijd de matrix met een nieuw scalpel doormidden, til de matrix vervolgens op met het scalpel en breng deze over naar 4% PFA.Fixeer de matrix overnacht bij kamertemperatuur. In de volgende twee figuren werden cellen van pancreasductaal adenocarcinoom of P DAC-cellen over een organotypische matrix gelaagd. In de eerste figuur zijn niet-invasieve P dac-cellen te zien in een laag bovenop de matrix, terwijl in deze tweede figuur invasieve P dac-cellen te zien zijn die de matrix zijn binnengedrongen. Hier is een levend huidequivalent te zien met een gestratificeerde epidermis op een door fibroblasten gecontracteerd collageen dermaal component. Invasieve PD-cellen in het groen zijn te zien in interactie met fibroblasten in het rood, welke de invasie van de PDX-cellen in de organotypische matrix bevorderen.De invasieve PD-cellen, hier opnieuw in het groen weergegeven, zijn gevisualiseerd binnen de collageenmatrix, die is afgebeeld met behulp van second harmonic generation; in paars zijn plekken van matrixdegradatie zichtbaar als donkere gaten binnen de paarse matrix. In deze figuur C 8 1 61 worden melanoomcellen getoond die een door fibroblasten gecontracteerd collageen dermale equivalent binnendringen, evenals het gedrag van fundamentele processen van fluorescerende eiwitten tijdens deze assay. U kunt deze assay ook gebruiken in combinatie met immunohistochemische kleuring om te kijken naar celproliferatiemarkers en verschillen in celoverleving, enzovoort.

organotypic-collagen-i-assay-malleable-platform-to-assess-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Explantaten de dopaminesysteem en striatum worden gebruikt in een collageenmatrix test voor...

Dissectie en Cultuur van de muis Dopaminerge en het striatum Explantaten in drie-dimensionale Collageen Matrix Assays

Dit artikel behandelt een methode om fluorescerend label collageen dat verder kan worden gebruikt voor zowel vaste en levende beeldvorming van 3D celculturen. Wij bieden ook een geoptimaliseerd protocol om endogene cytoskeleteiwitten van cellen gekweekt in 3D-omgevingen te visualiseren.

Het openbaren van de organisatie van het cytoskelet van invasieve kankercellen in 3D

Celmigratie is een biologisch verschijnsel dat betrokken is bij een overvloed aan fysiologische, zoals wondgenezing en immuunreacties en pathofysiologische processen, zoals kanker. De 3D-matrix van collageen migratie assay is een veelzijdig instrument om de trekkende eigenschappen van verschillende celtypes te analyseren binnen in een 3D-fysiologische-achtige omgeving.

Analyse van cel-migratie binnen Driedimensionale Collagen Matrix

De mechanische eigenschappen en de microstructuur van de extracellulaire matrix sterk beïnvloeden 3D migratie van cellen. Een in vitro werkwijze om de tijdruimtelijk celmigratie gedrag biofysisch variabele omgevingen zowel bevolking en afzonderlijke cel niveaus, gaande beschreven.

Concentrische Gel Systeem om de biofysische rol van matrix Microenvironment op 3D-Cell Migratie Bestudeer

Collageen is een essentieel onderdeel van de ECM en biedt essentiële signalen verscheidene cellulaire processen gaande van migratie differentiatie en proliferatie. Er wordt hier een protocol voor het inbedden van cellen in 3D collageen hydrogels, en een meer geavanceerde techniek voor het genereren van gerandomiseerde of uitgelijnd collageen matrices gebruikt PDMS microkanalen.

Voorbereiding van de 3D Collageen Gels en Microkanalen voor de Studie van 3D-Interacties<em&gt; In Vivo</em

Dit manuscript beschrijft een zachte lithografie gebaseerde techniek uniforme arrays van driedimensionale (3D) epitheliale weefsels gedefinieerde geometrische midden van extracellulaire matrix ingenieur. Deze methode is vatbaar voor een grote verscheidenheid aan celtypen en experimentele contexten en zorgt voor high-throughput screening van identieke herhalingen.

Techniek Driedimensionale epitheelweefsels Embedded binnen extracellulaire matrix

Hier bieden wij een methode voor het analyseren van het gedrag van de groeiende axonen in 3D-matrices, het nabootsen van hun natuurlijke ontwikkeling.

Generatie van 3-D collageen-based hydrogels om axonale groei en gedrag te analyseren tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel

Dit protocol demonstreert het gebruik van een microfluïdisch kanaal met veranderende geometrie langs de vloeistofstroomrichting om extensieve spanning (stretching) te genereren om vezels uit te lijnen in een 3D-collageenhydrogel (&lt; 250 μm dik). De resulterende uitlijning strekt zich uit over enkele millimeters en wordt beïnvloed door de extensieve reksnelheid.

Micro-engineering 3D collageen hydrogels met lange-afstand vezeluitlijning

Hier presenteren we een protocol voor het kweken van IDG-SW3-cellen in een driedimensionale (3D) extracellulaire matrix.

IDG-SW3-celkweek in een driedimensionale extracellulaire matrix

Dit protocol beschrijft de generatie van organoïden uit A549 alveolaire epitheelcellen en MRC-5 longfibroblasten op een extracellulaire matrix hydrogel-steiger, gevolgd door inbedding in 3D-collageengels en blootstelling aan mechanische belasting met behulp van een cel-rekbioreactor om de alveolaire mechanobiologie te onderzoeken.

Generatie van 3D-collageen-ingebedde A549/MRC-5 alveolaire organoïden met behulp van een mechanische cel-rekbioreactor

Leer een driedimensionaal collageenmatrixassay met fibroblasten om celmigratie en tumorcelinvasie te bestuderen. Deze methode bootst weefselstroma na en is geschikt voor fluorescentiemicroscopie en immunohistochemie.

Organotypische Collageen I Assay: een Smeedbaar Platform to Cell Gedrag beoordelen in een 3-dimensionale Context

Meer video's verkennen