Het gebruik van een optische val voor de Studie van gastheer-pathogeen interacties voor Dynamic live cell imaging

Het algemene doel van het volgende experiment is om optische opsluiting in combinatie met spinning disc confocale microscopie te gebruiken om interacties tussen gastheer en pathogeen in realtime te observeren. Dit wordt bereikt door eerst de pathogenen van belang toe te voegen aan een gekamerde dekglas. Vervolgens wordt een deeltje geselecteerd en vastgelegd met de optische vang.

Ten slotte wordt het deeltje naar de belangrijkste cel geleid. Zoals hier te zien is. Optische opsluiting kan een effectieve methode zijn voor het controleren van twee deeltjes voor het observeren van dynamische intracellulaire interacties.

Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden over interacties tussen gastheer en pathogeen op het gebied van infectieziekten en immunologie, inclusief wat het effect is op fagocytose wanneer volledige controle over ruimtelijke relaties tussen gastheercellen en pathogenen wordt verkregen, evenals of de volgorde waarin pathogenen worden opgenomen door een fagocytische cel, invloed heeft op de phagosomale rijping. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat de opsluitingscondities voor verschillende cel- en kralentypes moeten worden geoptimaliseerd. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, evenals het proces om een spinning disc in te stellen en te integreren.

Confocale lichtbundel naar een optische vang is moeilijk te conceptualiseren vanwege de precieze uitlijning die nodig is voor alle optische componenten. Verzamel het gewenste pathogeen. Bijvoorbeeld, hier, 300 microliters van Canada albicans die overnacht in bouillon is gekweekt, wordt uit de cultuur verwijderd en worden de pathogenen overgebracht naar een reactiebuis van 1,5 milliliter.

Was vervolgens de pathogenen drie keer gedurende ongeveer 1300 Gs gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, aspireer de supernatant en laat de pellet ongestoord elke keer opnieuw gesuspendeerd PBS en soniceren. Na de derde wasbeurt, stel de pellet opnieuw op in 500 microliters PBS. Los vervolgens één milligram van de vertrouwenskleurstof op in 100 microliters dimethylformamide voor een uiteindelijke concentratie van 10 milligram per milliliter.

Voeg vervolgens drie microliters van de kleurstofmix toe aan de reactiebuis met de gewassen pathogenen. Plaats folie rond de buizen omdat de kleurstoffen lichtgevoelig en schud het monster gedurende één uur bij 37 graden Celsius, en pellet en was vervolgens het monster in PB S3 keer zoals eerder. Sla de pellet opnieuw op in 300 microliters PBS na de laatste wasbeurt.

Verwarm media tryin en PVS tot 37 graden Celsius in een waterbad. Was. Een 10 centimeter weefselkweekplaat bedekt met ruwe 2 6 4 0,7 macrofagen twee keer met PBS waarbij de PBS tussen elke wasbeurt wordt afgezogen. Bedek vervolgens het oppervlak van de plaat met vijf milliliter trypsine en incubeer de plaat gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius.

Sla vervolgens zachtjes tegen de zijkant van de plaat om de cellen los te maken van het plaatoppervlak. Wees voorzichtig om de trypsine niet buiten de plaat te laten spatten. Voeg nu vijf milliliter media toe aan de plaat en breng het mengsel over naar een reactiebuis.

Nadat de cellen zijn gepelleteerd, aspireer het media en zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord en stel de pellet opnieuw op in 10 milliliter media. Voeg 400 microliters media toe aan elke kamer van een kamerslide, en voeg vervolgens vijf microliters van de celsuspensie toe aan elke kamer. Laat de cellen overnacht in een incubator bij 37 graden Celsius groeien met 5%CO2.

Haal de kamerslide uit de incubator, pipet vijf tot 10 microliters van de eerder bereide fluorescerende pathogenen van belang in elke kamer van macrofagen. Meng de macrofagen en pathogenen grondig door op en neer te pipetten, zorg ervoor dat u de bodem van de kamer niet raakt en de gehechte macrofagen verstoort. Schakel alle componenten van de spinning disc confocale microscoop in.

Bereid de microscoop voor door olie toe te voegen aan de olijfolie-objectieflens. Plaats de kamerslide in het gespecialiseerde stadium en verwijder vervolgens de bovenkant van de kamerslide om de microscoop uit te lijnen voor DIC-beeldvorming. Schakel de sluiter in voor de optische vang en de IR-laser.

Open vervolgens de sluiter op de laser naar de optische vang. Bevestig dat de sluiter voor de IR-laser gesloten is door te controleren met de IR-kaart. Richt u nu op de macrofagen op de gehechte slide.

Zoek vervolgens de pathogenen die vrij in de oplossing naast macrofagen zweven. Het moeilijkste deel van deze procedure is het vinden van het juiste object om in de monsterkamer te volgen vanwege de hechtingskracht tussen het object en het dekglas in de monsterkamer. Om dat object te verplaatsen, moet u het stadium verplaatsen terwijl het object wordt vastgehouden door de verkeerslaser, en het is ook belangrijk op te merken dat u het stadium langzaam genoeg moet verplaatsen, zodat de sleepkracht van het stadium de maximale vangsterkte niet overschrijdt.

Verplaats het stadium zodat het pathogeen zich in de buurt van de vang bevindt. Open vervolgens de sluiter en activeer de vang. Verplaats het monster om de macrofagen in contact te brengen met een stilstaand gevangen pathogeenbeeld.

De pathogenen met een spinning disc confocale microscoop zijn ofwel in DIC-fluorescentie of een combinatie van beide, afzonderlijke populaties van Canada albicans, die typisch ongeveer vijf micrometer groot zijn, zijn gemarkeerd in groen, blauw en rood. Om de beeldvorming te illustreren, werd een enkele C albicans vastgelegd en bewogen in een vierkant patroon door een cluster van andere gisten, zoals aangegeven door de grijze pijlen, wat de mogelijkheid aantoont om de specifieke locatie van een enkel pathogeen dat door de operator is gekozen, vast te leggen en te manipuleren, zelfs in een drukke omgeving. Om verder de flexibiliteit van dit systeem te illustreren om de verschillende vormmorfologieën te vangen die door pathogene organismen in deze figuur worden getoond, werd de optische pincet gebruikt om een C albicans-deeltje met een pseudohyphe vast te houden en te plaatsen.

De C albicans is gelabeld met rode kleurstof en bewogen langs een traject zoals geschetst door de witte pijl en geplaatst naast fluorescerende GFPL C3-ruwe cellen. In groen. Het gistengedeelte van de albicans werd vastgelegd ter