Name: Het gebruik van een optische val voor de Studie van gastheer-pathogeen interacties voor Dynamic live cell imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Leer optische valtechniek voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties met spindelschijf confocale microscopie. Deze methode maakt real-time manipulatie en beeldvorming van levende cellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door interne fondsen van de afdeling Geneeskunde van het Massachusetts General Hospital (J.M.T., M.K.M, M.L.C., J.M.V.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering beurs T32EB006348 (C.E.C.), het ontwikkelingsfonds van het Center for Computational and Integrative Biology van het Massachusetts General Hospital en AI062773 (R.J.H.), beurzen AI062773, DK83756 en DK 043351 (R.J.X.), NSF 0643745 (M.J.L.), NIH R21CA133576 (M.J.L.), en het National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) van de National Institutes of Health (NIH) AI057999 (J.M.V.). We danken Nicholas C. Yoder voor behulpzame discussies en Charles Felts (RPI, Inc.) voor technische ondersteuning.

1. Kweekomstandigheden van pathogenen voor optische vangen <ol><li> Grow A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) op een semi-vaste agar media met SBD (Sabouraud dextrose) bij 30 ° C gedurende 3 dagen. </li><li> Grow C. albicans (SC5314) in YPD (Gist-Peptone Dextrose) vloeibare cultuur met 100 ug / ml ampicilline 's nachts in een shaker incubator bij 30 ° C. </li></ol> 2. De voorbereiding van pathogenen voor TL-etikettering <ol><li> Oogst gewenste hoeveelheid ziektekiemen en over te dragen aan een 1,5 mL reactie buis. </li><li> Voeg 300 ul van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) de reactie buis. </li><li> Sonificeer mengsel gedurende 30 seconden. </li><li> Centrifugeer bij 4000 rpm gedurende 1 minuut. </li><li> Aspireren supernatant, waardoor pellet ongestoord. </li><li> Herhalen (2,4) en (2,5) nog twee keer. </li><li> Resuspendeer in 500μL van PBS. </li></ol> 3. Etikettering van pathogenen met een fluorescerende kleurstof <ol><li> Los 1 mg kleurstof van belang (bijvoorbeeld Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647) in 100 pi dimethylformamide (DMF) (concentratie van 10 mg / ml). </li><li> Voeg 3 ul van kleurstof mengsel reactie buisjes met gewassen ziekteverwekkers. </li><li> Draaien of schudden monster op 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Was monster met PBS 3X door centrifugeren bij 4000 rpm gedurende 1 minuut. </li><li> Resuspendeer in 300 ul PBS. </li></ol> 4. Oogsten T-cellen uit volbloed <ol><li> Verkrijgen van volbloed (vers). </li><li> Warm bloed, PBS + 2% foetaal bovine serum (FBS), en histopaque tot kamertemperatuur. </li><li> Voeg RosetteSep Human CD4 + T-cel Verrijking Cocktail op 50 ul / ml volbloed. </li><li> Draai monster en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verdunnen monster met een gelijk volume van PBS + 2% FBS en meng voorzichtig. </li><li> Laag verdunde monster op de top van histopaque, het minimaliseren van het mengen van </li><li> Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 1200 xg bij kamertemperatuur met de rem af. </li><li> Verwijder de verrijkte cellen. </li><li> Was de verrijkte cellen 2x met PBS + 2% FBS-oplossing. </li><li> Lyse rode bloedcellen gedurende 2 minuten met een rode bloedcellen lyserende buffer </li><li> Voeg 10 ml PBS + 2% FBS en centrifugeer gelyseerde rode bloedcellen bij 1500 rpm gedurende 5 minuten </li><li> Aspireren supernatant, Pas op dat u de pellet te verstoren </li><li> Resuspendeer in IMDM media met 10% foetaal runderserum </li></ol> 5. De voorbereiding van RAW 264,7 macrofagen in de kamer dia's <ol><li> Bereid DMEM (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium) tot 10% FBS, 1% penicilline / streptomycine, en 1% L-glutamine bevatten. </li><li> Warm media, trypsine, en PBS in warme bad tot 37 ° C. </li><li> Was de plaat 2x met PBS </li><li> Aspireren PBS tussen elke wasbeurt. </li><li> Voeg 5 ml trypsine tot op het bord naar de oppervlakte te dekken (voor een 10 cm weefselkweek plaat). </li><li> Incubeer 5 minuten bij 37 ° C. </li><li> Zachtjes klop kant van de plaat om cellen van plaatoppervlak los te maken. Wees niet te trypsine splash buiten van de plaat. </li><li> Voeg 5 ml of equivalente hoeveelheid media trypsine. </li><li> Aspireren mengsel in een reageerbuis. </li><li> Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 3 minuten. </li><li> Aspireren media, Zorg ervoor dat u de pellet te verstoren. </li><li> Resuspendeer in 10 ml media. </li><li> Voeg 400 ul van media om elke kamer van de kamer schuiven. </li><li> Voeg 5 pi van celsuspensie aan elke kamer. </li><li> Groeien 's nachts in de broedstoof bij 37 ° C met 5% CO 2. </li></ol> 6. Toevoeging van pathogenen te proeven <ol><li> Pipetteer 5-10 pi van gelabelde pathogenen van belang (van stap 1-3) in de kamer. </li><li> Meng goed door pipetteren op en neer, Zorg ervoor dat u de bodem van de kamer raken om de macrofagen gehandeld verstoren. </li></ol> 7. Het laden van monster op draaiende schijf confocale microscoop (in video, scannen door middel van onderdelen) <ol><li> Schakel alle componenten om draaiende schijf confocale microscoop. </li><li> Lijn microscoop voor DIC imaging. </li><li> Verwijder de kamer dia uit incubator. </li><li> Plaats de kamer glijden in gespecialiseerde podium. </li><li> Verwijder de bovenkant van de kamer slide (nodig voor DIC imaging). </li></ol> 8. Voorbereiding voor optische trapping (in video-, scan door middel van onderdelen en de manier waarop het is geïntegreerd in de microscoop) <ol><li> Zet de sluiter voor optische val. </li><li> Zet IR-laser. </li><li> Open sluiter (de laser) naar optische val. </li><li> Bevestig de sluiter voor IR laser wordt afgesloten door de controle met IR-kaart. </li></ol> 9. Selectie en manipulatie van een ziekteverwekker met optische val <ol><li> Focus op macrofagen op gehandeld dia. </li><li> Zoek ziekteverwekkers vrij fluctuerende in oplossing grenzend aan macrofagen. </li><li> Verplaats stadium zodanig dat de ziekteverwekker is in de buurt van de val. </li><li> Open sluiter en schakel de val. </li><li> Verhuizen monster op macrofagen in contact te brengen met de stationaire trapped ziekteverwekker. </li><li> Afbeelding met draaiende schijf confocale microscoop, hetzij in DIC, fluorescentie, of een combinatie van beide. Doorgaans wordt trapping gedaan in DIC, en real-time beeldvorming wordt gedaan met fluorescentie. </li></ol> 10. Representatieve resultaten: Uit te oefenen volledige ruimtelijke en temporele controle van pathogenen en kralen in een in vivo en in vitro omgeving, hebben we een custom-built trapping apparaat geïntegreerd op een draaiende schijf confocale microscoop (schematisch weergegeven in Fig. 1). Op volle sterkte, de laser die 350 mW vermogen en na het koppelen van het licht met de verschillende optische componenten in de optische val apparaat, ~ 80 mW vermogen op de TIRF doelstelling, zoals gemeten met een power meter, werd gebruikt om de val formulier in de kamer. Om een ​​object in de kamer ten opzichte van het object gevangen positie, was het toneel verplaatst terwijl de gevangen object stationair met het vangen laser. Het podium werd verplaatst langzaam genoeg snelheden, zodat de weerstand kracht op de gevangen deeltjes niet de maximale vangst van kracht overschrijden. Afzonderlijke populaties van C. albicans (typische grootte - ~ 5 micrometer) werden gemerkt met elk van de drie kleuren (AF488, AF568, en AF647, hetgeen overeenkomt met groen, blauw en rood in de figuur, respectievelijk) om beeldvorming te illustreren met meerdere kanalen fluorescentie tegelijkertijd optisch het vangen van de ziekteverwekker. Een enkele C. albicans werd gevangen en verplaatst in een vierkant patroon door middel van een cluster van andere gist, zoals aangegeven door grijze pijlen, waaruit de mogelijkheid om vast te leggen en te manipuleren de specifieke locatie van een enkel pathogeen gekozen door de exploitant, zelfs in een drukke omgeving (Fig. 2A) . Om te illustreren verder de flexibiliteit van dit systeem om de verschillende vormen morfologiën tentoongesteld door pathogene organismen val, de optische pincet was ook in staat om vast te houden en situeren een C. albicans deeltje met een pseudohyphae. De C. albicans gelabeld met AF647 (rood) was bewogen langs een traject zoals geschetst door de witte pijl en geplaatst naast de fluorescerende GFP-LC3-RAW-cellen (Fig. 2B). De gist deel van de C. albicans werd gevangen als de pseudohyphae getrokken langs. We hebben ook gepositioneerd Aspergillus fumigatus naast een RAW-muis macrofaag cel in om de absolute tijdsbestek van fagocytose te analyseren met deze specifieke cellijn en pathogeen (Fig. 3A). Zodra de ziekteverwekker in contact komt met de cel, is de val uitgezet, en time-lapse imaging wordt gebruikt voor de daaropvolgende cellulaire gebeurtenissen waarnemen (Fig. 3B). De optische val werd ook gebruikt om de primaire T-cellen geïsoleerd uit het bloed vast te leggen en naast doorverwezen naar parels gecoat met anti-CD3 antilichaam in zodat de T-cel naar een immunologische synaps met de kraal (afb. 4) vormen, tonen de extra veelzijdigheid om direct vangen en te manipuleren immuuncellen. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Overzicht en schema van gecombineerde optische val en draaiende schijf confocale microscoop setup. Instrument lay-out met de trapping balk (paars), verlichting pad voor helderveld beeldvorming (oranje), fluorescentie excitatie balk (rood), fluorescentie-emissie (groen), charge-coupled device (CCD) camera, elektron-vermenigvuldigen Charge Coupled Device (EM- CCD) camera, dichroïsche spiegels (D1 en D2), spiegels (M1 en M2), en lenzen (L1, L2, L3, L4). Alle andere onderdelen van de trap-confocale microscoop systeem zijn geëtiketteerd in de figuur. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. (A) Fluorescentie beelden van gevangen en gemanipuleerd C. albicans. Een gevangen fluorescent-gelabelde (Alexa Fluor 488 (AF488), blauw) organisme in een gebied van andere fluorescent gelabelde C. albicans (AF568, groen en AF647, rood). Het podium is verplaatst van de gevangen, blauwe CA deeltje zoals aangegeven door de grijze pijlen. (B) Trapped pseudo-hyfen vorm van C. albicans naast GFP-LC3 RAW cel. Fluorescent gelabelde psuedohyphal vorm van CA (rood, AF647) optisch opgesloten en verhuisde grenzend aan GFP-LC3 uitgedrukt RAW macrofagen. De CA organisme wordt verplaatst langs het traject, zoals aangegeven door de witte pijl. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Trapping en positionering van A. fumigatus naast een fagocytaire RAW cel. (A) Helderveld beelden van een gevangen A. fumigatus, zoals aangegeven door de witte pijl, verplaatst en gepositioneerd langs het pad, zoals aangegeven door de rode pijl. De gevangen pathogeen is enigszins onscherp te wijten aan de val te duwen het organisme iets boven het brandvlak. A. fumigatus wordt verplaatst totdat het grenst geplaatst om de gewenste RAW cel. (B) grieporescence beeldvorming van fagocytose van A. fumigatus met RAW cel. Nadat de gevangen pathogeen is naast een RAW-cel geplaatst, is de fagocytose proces geactiveerd. Op 30 s, het membraan van de RAW-cel begint te veranderen en een beker te vormen rond het deeltje. Op 60 s, is de beker volledig gevormd. Van jaren '90 tot 150s, de A. fumigatus is verzwolgen, en door 180 s, het deeltje volledig geïnternaliseerd <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Trapping primaire T-cel synaps vormen met anti-CD3 gecoate kralen. DIC beelden van een primaire T-cel ontroerd door de optische val naar een positie naast een kraal gecoat met anti-CD3 antilichaam. De cel vormt dan een immunologische synaps, die niet gemakkelijk te onderscheiden zijn in de beelden.

<ol><li>Grakoui, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+A+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li>
<li>Monks, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395, 82-86 (1998).</li>
<li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+comparative+innate+immunity%3A+Learning+on+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and comparative innate immunity: Learning on the fly.</a> Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).</li>
<li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Optical trapping.</a> Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li>
<li>Ashkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping+and+manipulation+of+neutral+particles+using+lasers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 94, 4853-4860 (1997).</li>
<li>Ashkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+and+trapping+of+particles+by+radiation+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Acceleration and trapping of particles by radiation pressure.</a> Phys Rev Lett. 24, 156-159 (1970).</li>
<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping+and+manipulation+of+viruses+and+bacteria+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria Science.</a> Nature. 235, 1517-1520 (1987).</li>
<li>Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+M13+bacteriophage+tethering+and+stretching%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single M13 bacteriophage tethering and stretching.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 4892-4897 (2007).</li>
<li>Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin%27s+cover-neck+bundle+folds+forward+to+generate+force%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA.%22%5BJournal%5D)">Kinesin's cover-neck bundle folds forward to generate force.</a> Proc Natl Acad Sci USA.. 105, 19247-19252 (2008).</li>
<li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+tether+formation+from+outer+hair+cells+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Membrane tether formation from outer hair cells with optical tweezers.</a> Biophys J. , 1386-1395 (2002).</li>
<li>Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B1%CE%B2+T+cell+receptor+is+an+anisotropic+mechanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The αβ T cell receptor is an anisotropic mechanosensor.</a> J Biol Chem. 284, 31028-31028 (2009).</li>
<li>Mohanty, S., Mohanty, K., Gupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+interaction+of+RBC+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Dynamics of interaction of RBC with optical tweezers.</a> Opt. Express. 13, 4745-4751 (2005).</li>
<li>Tam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+and+manipulation+of+pathogens+with+an+optical+trap+for+live+cell+imaging+of+intercellular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions.</a> PLoS One. 5, e15215-e15215 (2010).</li>
<li>Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillosis+case-fatality+rate%3A+Systematic+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis.%22%5BJournal%5D)">Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature.</a> Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).</li>
<li>Wey, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hospital-acquired+candidemia+-+the+attributable+mortality+and+excess+length+of+stay%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Intern.+Med%22%5BJournal%5D)">Hospital-acquired candidemia - the attributable mortality and excess length of stay.</a> Arch. Intern. Med. 148, 2642-2645 (1988).</li>
</ol>

Geen belangenverstrengeling gemeld.

In dit werk gebruiken we een optische val om pathogenen met afmetingen tussen 3 μm - 5 μm te vangen. Hoewel de pathogenen waarin ons laboratorium geïnteresseerd is doorgaans deze afmetingen hebben, is het hier beschreven optische pincetsysteem flexibel genoeg om een breed scala aan groottes te vangen. Optische vallen zijn inderdaad gebruikt om deeltjes te vangen variërend van enkele atomen tot cellen met een diameter van ongeveer 10 μm. Bovendien was dit optische vangsysteem in staat om deeltjes van verschillende vormen ...

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;A. fumigatus&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Albino stam, B-5233/RGD12-8, gift van K.J. Kwon-Chung, NIH</td></tr><tr><td>C. albicans</td><td></td><td></td><td>SSY50-B mutant, gift van Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 stam, gift van Gerald Fink, Whitehead Institute</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A20006</td><td></td></tr><tr><td>dimethylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Vers bloed</td><td></td><td></td><td>Gift van R.J.W. Heath, MGH, HMS</td></tr><tr><td>Nikon omgekeerde microscoop</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Model Ti-E </td></tr><tr><td>Trapping laser, ChromaLase</td><td>Blue Sky Research</td><td>CLAS-106-STF02-02</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie-excitatielaser</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td>Model Innova 70C </td></tr><tr><td>Breadboards voor trapping-componenten</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>MB1224, MB1218</td><td></td></tr><tr><td>Optische luchttafel</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektronische sluiter met pedaalbediening</td><td>Uniblitz</td><td></td><td>Aangekocht bij Vincent Associates, Rochester, NY</td></tr><tr><td>Single-mode optische vezel</td><td>Oz Optics</td><td>PMJ-3S3S-1064-6</td><td></td></tr><tr><td>Vezelpositioneerder</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>PAF-X-5-C</td><td></td></tr><tr><td>Vezelcollimator</td><td>Oz Optics</td><td>HPUCO-23-1064-P-25AC</td><td></td></tr><tr><td>Lenzen voor telescoop</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>AC254-150-B</td><td>Brandpuntsafstand van 150 mm</td></tr><tr><td>Translatiepodia (x, y, z)</td><td>Newport Corp.</td><td>M-461-XYZ</td><td></td></tr><tr><td>IR-dichroïsche spiegel</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET750-sp-2p8</td><td></td></tr><tr><td>Objectief (100X)</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>NA = 1.49, olie-immersie, TIRF-objectief</td></tr><tr><td>Confocale kop</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-XI</td><td></td></tr><tr><td>Polarisator</td><td>Nikon Instruments</td><td>MEN51941</td><td></td></tr><tr><td>Wollaston-prisma</td><td>Nikon Instruments</td><td>MBH76190</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD camera</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>CCD-camera (ORCA ER)</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>C4742-80-12AG</td><td></td></tr><tr><td>Filterwiel</td><td>Ludl</td><td>99A353</td><td></td></tr><tr><td>Filterwiel</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>LB10-NWE</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas met kamer</td><td>Lab-Tek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>111-51D</td><td>Gecoat met anti-CD3</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>10313</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runderserum (HyClone)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr></tbody></table>

het gebruik van een optische val voor de studie van gastheer-pathogeen interacties voor dynamic live cell imaging

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamische live-cell imaging maakt directe visualisatie mogelijk van real-time interacties tussen cellen van het immuunsysteem1, 2; echter heeft het gebrek aan ruimtelijke en temporele controle tussen de fagocytische cel en de microbe het lastig gemaakt om gerichte observaties te doen van de initiële interacties van de gastheerrespons op pathogenen. Historisch gezien zijn intercellulaire contactgebeurtenissen zoals fagocytose3 in beeld gebracht door twee celtypen te mengen en vervolgens continu het gezichtsveld te scannen om toevallige intercellulaire contacten in het juiste stadium van interactie te vinden. De stochastische aard van deze gebeurtenissen maakt dit proces moeizaam, en het is met deze benadering moeilijk om vroege of vluchtige gebeurtenissen in cel-celcontact te observeren. Deze methode vereist het vinden van celparen die op het punt staan contact te maken, om ze vervolgens te observeren tot ze hun contact voltooien, of juist niet. Om deze beperkingen aan te pakken, maken wij gebruik van optische trapping als een niet-invasieve, niet-destructieve, maar snelle en effectieve methode om cellen in kweek te positioneren.
Optische vallen, of optische pincetten, worden steeds vaker ingezet in biologisch onderzoek om cellen en andere micron-grote deeltjes in drie dimensies vast te leggen en fysiek te manipuleren4. Stralingsdruk werd voor het eerst waargenomen en toegepast in optische pincet-systemen in 19705, 6, en werd voor het eerst gebruikt om biologische monsters te controleren in 19877. Sindsdien zijn optische pincetten uitgegroeid tot een technologie om een verscheidenheid aan biologische fenomenen te onderzoeken8-13.
We beschrijven een methode14 die live cell imaging verbetert door een optische pincet te integreren met spinning disk confocale microscopie met temperatuur- en vochtigheidscontrole, om een uitstekende ruimtelijke en temporele controle over pathogene organismen in een fysiologische omgeving te bieden, zodat interacties met gastheercellen naar wens van de operator kunnen worden gefaciliteerd. Levende, pathogene organismen zoals Candida albicans en Aspergillus fumigatus, die potentieel dodelijke, invasieve infecties kunnen veroorzaken bij immuungecompromitteerde personen15, 16 (bijv. patiënten met AIDS, chemotherapie en organtransplantaties), werden optisch gevangen met behulp van niet-destructieve laserintensiteiten en verplaatst naar de nabijheid van macrofagen, die de pathogeen kunnen fagocyteren. Movies met een hoge resolutie, gebaseerd op doorgelaten licht en fluorescentie, bevestigden de mogelijkheid om vroege gebeurtenissen van fagocytose in levende cellen waar te nemen. Om de brede toepasbaarheid binnen de immunologie aan te tonen, werden ook primaire T-cellen gevangen en gemanipuleerd om synapsen te vormen met anti-CD3-gecoate microsferen in vivo, waarbij tevens time-lapse imaging van de synapsvorming werd verkregen. Door een methode te bieden voor fijne ruimtelijke controle van levende pathogenen ten opzichte van immuuncellen, kunnen cellulaire interacties worden vastgelegd via fluorescentiemicroscopie met minimale verstoring van de cellen, wat krachtige inzichten kan opleveren in de vroege responsen van de aangeboren en adaptieve immuniteit.

Er wordt een methode beschreven om levende pathogenen individueel te selecteren, te manipuleren en te beelden met behulp van een optische pincet gekoppeld aan een spinning disk-microscoop. De optische pincet biedt ruimtelijke en temporele controle over de organismen en plaatst deze naast gastheercellen. Fluorescentiemicroscopie legt dynamische intercellulaire interacties vast met minimale verstoring van de cellen.

Het gebruik van een optische val voor de Studie van gastheer-pathogeen interacties voor Dynamic live cell imaging

Dynamische live-cell imaging maakt directe visualisatie mogelijk van real-time interacties tussen cellen van het immuunsysteem1, 2; echter, het gebrek aan ruimtelijke en ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om optische trapping in combinatie met spinning disc confocale microscopie te gebruiken om interacties tussen gastheer en pathogeen in realtime waar te nemen. Dit wordt bereikt door eerst de betreffende pathogenen toe te voegen aan een kamerdeksglas. Vervolgens wordt een partikel geselecteerd en gevangen met de optische trap.Ten slotte wordt het deeltje naar de betreffende cel geleid. Zoals hier te zien is. Optische trapping kan een effectieve methode zijn voor het beheersen van twee deeltjes om dynamische intracellulaire interacties te observeren.Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden over interacties tussen gastheer en pathogeen op het gebied van infectieziekten en immunologie, waaronder wat het effect op fagocytose is wanneer volledige controle over de ruimtelijke relaties tussen gastheercellen en pathogenen wordt verkregen, en of de volgorde waarin pathogenen door een fagocytische cel worden opgenomen de fagosomale rijping beïnvloedt. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de vangstcondities moeten worden geoptimaliseerd voor verschillende cel- en kraaltypes. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien het proces voor het opzetten en integreren van een spinning disc complex is.Confocale uitlijning met een optische val is moeilijk te conceptualiseren vanwege de precieze uitlijning die vereist is voor alle optische componenten. Oogst het pathogeen van belang. In dit voorbeeld worden 300 µL van overnacht in bouillon gekweekte Candida albicans uit de cultuur gehaald en worden de pathogenen overgebracht naar een reactiebuis van 1,5 mL.Was vervolgens de pathogenen drie keer gedurende vijf minuten bij ongeveer 1300 Gs op kamertemperatuur, waarbij telkens het supernatant wordt weggezogen en het pellet ongestoord blijft, resuspendeer in PBS en sonicize. Resuspendeer het pellet na de derde wasbeurt in 500 µL PBS. Los vervolgens één milligram van de kleurstof entrust op in 100 µL dimethylformamide voor een eindconcentratie van 10 mg/mL.Voeg vervolgens drie µL van het kleurmengsel toe aan de reactiebuis met de gewassen pathogenen. Plaats folie rond de buizen aangezien de kleurstoffen lichtgevoelig zijn en schud het monster gedurende één uur bij 37 °C, om het monster daarna pelleten en drie keer wassen in PBS zoals eerder beschreven. Resuspendeer de pellet na de laatste wasbeurt in 300 µL PBS.Warm het medium en PVS op tot 37 °C in een waterbad. Was een weefkweekplaat van 10 cm, gecoat met RAW 264.7 macrofagen, twee keer met PBS, waarbij het PBS tussen elke wasbeurt wordt weggezuigd. Bedek vervolgens het plaatsoppervlak met 5 mL trypsine en incubeer de plaat gedurende vijf minuten bij 37 °C.Tik vervolgens voorzichtig tegen de zijkant van de plaat om de cellen van het platoppervlak los te maken. Wees zorgvuldig om te voorkomen dat de trypsine buiten de plaat spat. Voeg nu vijf milliliter medium toe aan de plaat en breng het mengsel over naar een reactiebuis.Na het pelleten wordt het medium afgezogen, waarbij men er voorzichtig op let de pellet niet te verstoren, waarna de pellet wordt geresuspendeerd in 10 milliliters medium. Voeg 400 microliters medium toe aan elke kamer van een chamber slide en voeg vervolgens vijf microliters van de cel-suspensie toe aan elke kamer. Laat de cellen overnacht groeien in een incubator bij 37 degrees Celsius met 5%CO2.Haal de chamber slide uit de incubator en pipetteer 5 tot 10 µL van de eerder voorbereide fluorescent gelabelde pathogenen van belang in elke kamer met macrofagen. Meng de macrofagen en pathogenen grondig door herhaaldelijk te pipetteren, waarbij u er zorg voor draagt dat u de bodem van de kamer niet raakt om de gehechte macrofagen niet te storen. Schakel alle componenten van de spinning disc confocale microscoop in.Bereid de microscoop voor door olie aan de olie-immersieobjectief lens toe te voegen. Plaats de chamber slide in de gespecialiseerde tafel en verwijder vervolgens de bovenkant van de chamber slide; stel de microscoop af voor DIC-beeldvorming. Zet de sluiter voor de optische val en de IR-laser aan.Open vervolgens de sluiter van de laser naar de optische pincet. Bevestig met de IR-kaart dat de sluiter voor de IR-laser gesloten is. Focus nu op de macrofagen op de gehecht slide.Zoek vervolgens de pathogenen die vrij in de oplossing vlak naast de macrofagen zweven. Het moeilijkste deel van deze procedure is het vinden van het juiste object om in de monsterkamer te volgen, vanwege de adhesiekrachten tussen het object en het dekglas in de monsterkamer. Om dat object te verplaatsen, moet u de tafel bewegen terwijl het object door de trap-laser wordt vastgehouden; het is daarnaast belangrijk om op te merken dat u de tafel met een voldoende lage snelheid moet bewegen, zodat de sleepkracht van de tafel de maximale vangkracht van de trap niet overschrijdt.Verplaats de tafel zodanig dat het pathogeen zich in de nabijheid van de val bevindt. Open vervolgens het sluiter en activeer de val. Verplaats het monster om de macrofagen in contact te brengen met een stationair gevangen beeld van het pathogeen.De pathogenen werden met een spinning disc confocale microscoop afgebeeld, gebruikmakend van DIC, fluorescentie of een combinatie van beide. Aparte populaties van Canada albicans, die doorgaans ongeveer vijf micron groot zijn, werden groen, blauw en rood gelabeld. Om de beeldvorming te illustreren, werd één enkele C albicans gevangen en in een vierkant patroon door een cluster van andere gisten bewogen, zoals aangegeven door de grijze pijlen; dit demonstreert het vermogen om de specifieke locatie van een door de operator gekozen enkel pathogeen vast te leggen en te manipuleren, zelfs in een dichtbevolkte omgeving. Om de flexibiliteit van dit systeem om de verschillende vormmorfologieën van pathogene organismen in deze figuur vast te leggen verder te illustreren, werd de optische pincet gebruikt om een C albicans-deeltje met een pseudo hypha vast te houden en te positioneren.De C albicans is gelabeld met rode kleurstof en bewoog zich langs een traject zoals aangegeven door de witte pijl en werd naast fluorescerende GFPL C3-ruwe cellen geplaatst. In het groen. Het gistgedeelte van de albicans bleef vastzitten terwijl de pseudohyfe meesleepte.Aspergillus fumigatus werd eveneens naast een rauwe muismacrofaagcel geplaatst om het absolute tijdsverloop van fagocytose met deze specifieke cellijn en pathogeen te analyseren. In deze figuur laten helderveldbeelden zien hoe de gevangen aspergillus, aangegeven door de witte pijl, werd verplaatst en gepositioneerd langs het pad dat door de rode pijl wordt aangegeven. De gevangen pathogeen is enigszins buiten focus omdat de val het organisme iets boven het brandvlak duwt.Aspergillus werd verplaatst tot het zich naast de gewenste ruwe cel bevond. Zodra het pathogeen contact maakte met de cel, werd de val uitgeschakeld. Het fagocytoseproces werd geactiveerd en er werd gebruikgemaakt van time-lapse imaging om de daaropvolgende cellulaire gebeurtenissen te observeren.Na 30 seconden begon het membraan van de ruwe cel te veranderen en een cupje rond het partikel te vormen. Na 60 seconden was het cupje volledig gevormd. Tussen 90 en 150 seconden werd de Afu Gotti omsloten en tegen 180 seconden was het partikel volledig geïnternaliseerd.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een optische val met een draaiende schijf kunt creëren, en hoe een dergelijk instrument het mogelijk maakt om pathogenen niet-invasief te controleren voor live-cell imaging na de ontwikkeling ervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van gastheer-pathogeeninteracties om de rol van ruimtelijke relaties tussen gastheercellen en pathogenen te onderzoeken, en de invloed hiervan op de daaropvolgende immuunrespons.

use-an-optical-trap-for-study-host-pathogen-interactions-for-dynamic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Cellulaire processen zoals celmigratie van oudsher bestudeerd op twee-dimensionale, stijve kunststof oppervlakken. Dit rapport beschrijft een techniek voor het direct visualiseren eiwit lokalisatie en het analyseren van eiwitten dynamiek in cellen migreren in een meer fysiologisch relevante, drie-dimensionale matrix.

Live-cell imaging van het migreren van cellen die fluorescent-gemerkte eiwitten in een drie-dimensionale Matrix

Het hierin beschreven systeem maakt een traditionele optische val en onafhankelijk holografische optische trapping lijn, staat het creëren en manipuleren van meerdere vallen. Dit zorgt voor de creatie van complexe geometrische arrangementen van refractieve deeltjes terwijl ook toelaat gelijktijdig met hoge snelheid, hoge-resolutie metingen van de activiteit van biologische enzymen.

Bouw van een hoge resolutie microscoop met conventionele en holografische optische Trapping Capabilities

Live cell imaging van alphaherpes virusinfecties maakt analyse van de dynamische gebeurtenissen van gerichte transport en intercellulaire verspreiding. Hier presenteren we methodieken die recombinante virale stammen die fluorescerende fusie-eiwitten tot visualisatie van virale assemblages tijdens infectie van primaire neuronen te faciliteren.

Live cell imaging van Alphaherpes Virus Anterograad Transport en Spread

Hier beschrijven we de instrumenten en werkwijzen voor het detecteren enkele fluorescentie-gemerkt eiwitmoleculen interactie met een enkel DNA-molecuul opgehangen tussen twee optisch gevangen microsferen.

De combinatie van Single-molecule Manipulatie en Imaging voor de Studie van eiwit-DNA interacties

Presenteren we een installatie van optisch pincet gekoppeld aan een lichte blad Microscoop, en de uitvoering daarvan om te sonderen cel mechanica zonder kralen in de Drosophila embryo.

Indringende cel mechanica met kraal-vrije optisch pincet in de Drosophila Embryo

We beschrijven een methode om GFP-gelabeld γδ IELs met behulp van intravital Imaging van muizen dunne darm te visualiseren door omgekeerde spinnen schijf confocale microscopie. Deze techniek maakt het bijhouden van levende cellen in het slijmvlies voor maximaal 4 uur en kan worden gebruikt om een verscheidenheid van intestinale immuun-epitheel interacties te onderzoeken.

Intravital beeldvorming van epitheliale lymfocyten in muizen dunne darm

Dit live-bacteriële celbeeldvormingsprotocol maakt visualisatie mogelijk van interacties tussen meerdere bacteriële soorten op het eencellige niveau in de tijd. Time-lapse imaging maakt het mogelijk om elke bacteriesoort in monocultuur of cocultuur te observeren om interspecies interacties te ondervragen in bacteriële gemeenschappen met meerdere soorten, waaronder individuele celmotiliteit en levensvatbaarheid.

Kinetische visualisatie van single-cell interspecies bacteriële interacties

Hier presenteren we een protocol om de intracellulaire mechanische eigenschappen van geïsoleerde embryonale zebraviscellen in driedimensionale opsluiting te onderzoeken met directe krachtmeting door een optische val.

Directe krachtmetingen van subcellulaire mechanica in opsluiting met behulp van optische pincetten

Vorming van actomyosinebundels in vitro en het meten van myosine ensemblekrachtgeneratie met behulp van een optisch pincet wordt gepresenteerd en besproken.

Myosine Ensemble Mechanics onderzoeken in Actin Filament Bundles met behulp van optische pincetten

Visuele, single-molecule biochemie bestudeerd door microfluïdische kamers wordt aanzienlijk vergemakkelijkt met behulp van glazen vaten, gasdichte spuiten, stabiele verbindingen van slangen met stroomcellen en eliminatie van bellen door schakelkleppen tussen de spuiten en slangen te plaatsen. Het protocol beschrijft dubbele optische vallen die visualisatie van DNA-transacties en intermoleculaire interacties mogelijk maken.

Gebruik van dual optische pincet en microfluïdica voor single-molecule studies

Leer optische valtechniek voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties met spindelschijf confocale microscopie. Deze methode maakt real-time manipulatie en beeldvorming van levende cellen mogelijk.

Het gebruik van een optische val voor de Studie van gastheer-pathogeen interacties voor Dynamic live cell imaging

Meer video's verkennen