Name: Live-Imaging van de dorsale wortel Axonen na Rhizotomy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Leer hoe je dorsale wortelregeneratie bestudeert met live-imaging in thy1-YFP transgene muizen na rhizotomy. Deze methode maakt herhaalde observatie van axonregeneratie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken dr. Alan Tessler voor commentaar en redactionele hulp. Dit werk werd ondersteund door NIH NS062320.

1. Microscoop set-up en imaging voorbereiding <ol><li> Onze beeldvorming set up bestaat uit een Leica MZ16 fluorescerende stereomicroscoop met een snelle sluiter en een gekoelde CCD-camera bestuurd door Metamorph software. </li><li> Bereid een thermostatisch geregelde verwarming pad en aan te passen vermogen tot 32,5 ° C te houden van het dier lichaamstemperatuur tijdens en na de operatie. </li><li> Warm steriele Ringer-oplossing of kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) tot 32,5 ° C bij voorbaat voor de irrigatie van het ruggenmerg tijdens de operatie. </li><li> Verdoven het dier met een intraperitoneale injectie van xylazine (8 mg / kg) en ketamine (120 mg / kg) cocktail. </li><li> Scheren van de bovenrug met kleine dieren clippers en de verspreiding een kleine druppel van ontharen lotion over het geschoren gebied met wattenstaafje doekjes. Minuten later, verwijder de toegepaste lotion met 70% ethanol gedrenkt gaas sponzen. </li></ol> 2. Laminectomie en chirurgische blootstelling van de dorsale wortel L5 <ol><li> Leg het dier op een verwarmde (32,5 ° C) pad en desinfecteren van de huid met 70% ethanol doorweekt swabs. </li><li> Onder helderveld verlichting op de stereomicroscoop, voert u een middellijn incisie (2 - tot 3-cm) in de huid van de rug. Gebruik indien nodig wattenstaafje doekjes om het bloeden te stoppen. </li><li> Afspiegeling van de wervelkolom spieren aan de onderliggende lumbale wervels bloot te leggen. </li><li> Expose de L3-S1 spinale segmenten door met de rechter-zijdige hemi-laminectomie met kleine rongeurs. Een gedeeltelijke laminectomie bloot 4-6 segmenten van de lumbale en sacrale ruggenmerg wordt gecreëerd door het verwijderen van de rechter dorsale gedeelte van de wervels L5 op het niveau van de crista iliaca van de heup (locatie van L5 DRG) rostraal aan de wervels L2 (2 wervels caudaal van de laatste rib). Perfuseren de holte met een oplossing warm steriele Ringer's. </li><li> Plaats het dier op een steunkussen (gerold katoen gaas) aan de wervelkolom plat. Gebruik terugtrekken haken aan het blootgestelde gebied te verbreden. </li><li> Op dit punt (ongeveer 30 minuten na de eerste ip injectie van verdoving, een supplement (0.5X) dient subcutaan geïnjecteerd te worden in stand te houden van het dier volledig verdoofd. Alternatief, gas anesthesie (2-4% isofluraan in 0.5L/min zuurstof ) kan worden gebruikt voor herhaalde verdoving tijdens de imaging-sessies langer dan 1 uur. </li></ol> 3. Rhizotomy / dorsale wortel te verpletteren <ol><li> Schakel over naar fluorescentie excitatie te visualiseren YFP label (+) axonen. </li><li> Met behulp van de punt van een Sub-Q (26ga.) naald, het uitvoeren van een kleine incisie in de dura bovenliggende het L5 dorsale wortel (DR). Perfuseren herhaaldelijk met Ringer-oplossing en schoon zachtjes met wattenstaafje doekjes. </li><li> Identificeer de site worden verpletterd en steek de ene kant van een fijne pincet (Dumont # 5) subdurally. </li><li> Sluit het pincet voorzichtig maar stevig, houdt de mediale gedeelte van de wortel L5 gedurende 10 seconden, en dan zachtjes laat de tang. </li><li> Was herhaaldelijk met fysiologische oplossing en schone zachtjes met wattenstaafje doekjes. </li></ol> 4. Beeldacquisitie en post-op procedures <ol><li> Verkrijgen van meerdere beelden van het hele blootgestelde gebied met inbegrip van de crush site en de DREZ voor en direct na de crush bij zowel lage als hoge vergroting. </li><li> De beelden werden hetzij als afzonderlijke foto's of als meerdere streams van 10 tot 20 frames verworven binnen de 30 - tot 40-ms belichtingstijd. In-focus foto's worden vervolgens geselecteerd, en een overzicht montage wordt gemaakt later met behulp van Photoshop. </li><li> Te minimaliseren littekenvorming, strak toepassen van een stukje dunne synthetische matrix membraan (Biobrane), gevolgd door kunstmatige dura, op de top van de blootgestelde ruggenmerg. Zorg ervoor dat in stukken gesneden om precies te passen in de blootgestelde ruggenmerg venster, zodat ze aanhanger van het ruggenmerg. </li><li> Sluit de spieren met steriele 5-0 hechtingen en sluit de middellijn incisie met gewikkelde clips. </li><li> Injecteer Ringer-oplossing (0.3-tot 0,5-ml subcutaan), en beheren Buprenorfine als postoperatieve analgesie (0,05 mg / kg) subcutaan om 12 uur voor 2 dagen. </li><li> Houd het dier op een verwarmingselement (34 ° -35 ° C) totdat hersteld. </li></ol> 5. Herhaalde beeldvorming <ol><li> Verdoven van het dier en verwijder de wond clips en hechtingen. </li><li> Het opheffen van kunstmatige dura en dunne synthetische matrix membraan patches en bewaar ze op in een steriele buis met Ringer's oplossing voor later hergebruik. </li><li> Verwijder eventuele geaccumuleerde bindweefsel litteken met het gebogen uiteinde van een Sub-Q naald en fijne tang. Perfuseren vaak met de oplossing warm Ringer's. </li><li> Opnieuw bloot te leggen van de operatieve gebied, met inbegrip verpletteren site en DREZ, verplaatsen YFP + axonen afgebeeld in vorige sessies, en herhaal de procedures beschreven in hoofdstuk 4. </li></ol> 6. Representatieve resultaten: Wij hebben geconstateerd dat, terwijl ze niet regenereren na een doorsnijding blessure, bijna alle YFP + axonen groeide via de site vanletsel door 3 dagen na het verpletteren (figuur 1) 11. Typisch, de volgende dag na het pletten, zagen we sterven-back degeneratie van de proximale stomp axonen en versnippering / degeneratie van de axonen dezelfde distaal van de te verpletteren, waarin werd bevestigd dat axonen had behoren beschadigd (bijvoorbeeld figuur 1, dag 3 en 5) . Een aantal aanvullende criteria worden toegepast op ondubbelzinnig regenererende axonen te onderscheiden van axonen die werden gespaard of hadden hersteld van de blessure. Deze omvatten het volgende: (1) regenererende axonen vertonen een uitbreiding van de niet-fluorescerende gedeelte van de YFP + axon op de crush terrein als gevolg van proximale en distale degeneratie (in tegenstelling tot vernauwing van de niet-gelabelde kloof door TL cytoplasma bijvullen van de crush website Als axonen overleefde het letsel), (2) regenererende axonen zijn veel dunner, minder fel tl-licht, en meer dan golvende axons dat de schade overleefd, (3) herstel van neurieten zijn dunner en meer vaag fluorescerende dan de degenererende fluorescerende brokstukken van axonen, waardoor zij uitgebreid; (4) in tegenstelling tot overleven of gespaard axonen, regenererende axonen stoppen bij de DREZ, en (5) in tegenstelling tot overleven of gespaard axonen, regenererende axonen vertonen geen knopen van Ranvier. Figuur 1 toont vier oppervlakkige YFP + axonen direct na het verpletteren (A1; gekleurde pijlen). Drie dagen na de verpletteren, alle vier de axonen te verlengen een neurieten dat groeit door de crush site (A2). Vijf dagen na verpletteren, neurieten stabiel blijven en er is geen extra groei van deze of andere proximale axonen (A3). Het regenereren neurieten dat de crush website langgerekte door veel dikker en helderder fluorescerende fragmenten van een degenererende axon (dat wil zeggen, endoneurial buizen) overgestoken, en komen op de DREZ al 4 dagen na de crush (ongeveer 3 mm / 2 dagen) 11. Herhaalde beeldvorming van deze axonen en hun tips om de twee of drie dagen voor nog twee weken (figuur 2) bleek dat zij niet naar voren groeien of intrekken, maar bleef onbeweeglijk. De enige merkbare verandering was zwelling van de tips en schachten van een aantal axonen. Deze observaties laten zien dan ook verrassend snel en chronische immobilisatie van de regenererende axonen op de DREZ. <img src="/files/ftp_upload/3126/3126fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1: Herhaalde beeldvorming van L5 DR YFP + axonen op de site van dorsale wortel te verpletteren over 5 dagen. Het mediale deel van de wortel L5 werd neergeslagen (rode pijlpunt) en afgebeeld op de dagen 0, 3 en 5 na de crush. De oppervlakte van het te verpletteren wordt uitvergroot in de juiste panelen (A1-A3). <img src="/files/ftp_upload/3126/3126fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2:. Herhaalde beeldvorming van axonen aangekomen bij de DREZ meer dan 20 dagen na de L5 wortel verpletteren Dag 4, drie axonen (gekleurde pijlen) aangekomen bij de DREZ. De toppen van deze axonen blijven op dezelfde locatie en hebben een soortgelijk uiterlijk in de daaropvolgende beeldvorming sessies op dag 7, 9, 13, 15 en 20. Posities van een axon tip in vergelijking met andere axon tips en bezienswaardigheden (sterretjes) werden gebruikt om de axon beweeglijkheid tussen beeldvorming sessies te bepalen.

<ol><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Watching+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Watching the neuromuscular junction.</a> J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).</li>
<li>Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+branch+removal+at+developing+synapses+by+axosome+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding.</a> Neuron. 44, 651-661 (2004).</li>
<li>Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+vivo+visualization+of+the+growth+of+pre-+and+postsynaptic+elements+of+neuromuscular+junctions+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse.</a> J Neurosci. 10, 894-908 (1990).</li>
<li>Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li>
<li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).</li>
<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li>
<li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat Med. 11, 572-577 (2005).</li>
<li>Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+vivo+imaging+of+single+axons+in+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord.</a> Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).</li>
<li>Davalos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+in+vivo+imaging+of+densely+populated+glia%2C+axons+and+blood+vessels+in+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).</li>
<li>Maio, D. D. i <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+vivo+imaging+of+dorsal+root+regeneration%3A+Rapid+immobilization+and+presynaptic+differentiation+at+the+CNS%2FPNS+border%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border.</a> Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Imaging DR regeneratie direct in levende muizen vormt een bijzondere uitdaging, omdat het een substantiële dorsale laminectomie nodig heeft om axongroei monitoren over een groot gebied, gevolgd door meerdere invasieve chirurgische en anesthetische procedures in de daaropvolgende beeldvorming sessies. Verschillende strategieën geholpen om deze uitdagingen te overwinnen. De eerste, succesvolle beeldvormend onderzoek vereist het verminderen van de muis de mortaliteit (circa 25%) door het minimaliseren van de duur van de an...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> H lijn thy1-YFP (2-4 maanden oud, zowel mannen als vrouwen) </td><td> Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) </td><td> 003782 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine (AnaSed injectie, steriele oplossing) </td><td> Lloyd Laboratories, (Shenandoah, LA) </td><td> 4811 </td><td> 8 mg / kg </td></tr><tr><td> Ketamine (Ketamine hydrochloride injectie, USP) </td><td> Hospira, Inc (Lake Forest, IL) </td><td> 2051 </td><td> 120 mg / kg </td></tr><tr><td> Buprenorfine (Buprenex injecteerbare) (0,05 mg / kg) </td><td> Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc (Richmond, VA) </td><td> 7571 </td><td></td></tr><tr><td> Kleine dieren tondeuses </td><td> Oster Professional, (McMinnville, TN) </td><td> 76059-030 </td><td></td></tr><tr><td> Ontharen lotion </td><td> Church &amp; Dwight Co (Princeton, NJ) </td><td> NAIR met babyolie </td><td></td></tr><tr><td> Gaas sponzen </td><td> Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) </td><td> 22-362-173 </td><td></td></tr><tr><td> Wattenstaafje swabs </td><td> Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) </td><td> 14-960-3Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml spuiten </td><td> Becton, Dickson and Company Franklin Lakes, New Jersey) </td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr><td> Subcutane (Sub-Q) naalden, 26ga. </td><td> Becton, Dickson en Company (Franklin Lakes, New Jersey) </td><td> 305115 </td><td></td></tr><tr><td> Spring schaar en pincet </td><td> Fine Science Tools, (Foster City, CA) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2,5-mm gebogen rongeurs </td><td> Fine Science Tools, (Foster City, CA) </td><td> 16221-14 </td><td></td></tr><tr><td> Ringer-Lactaat injectie USP </td><td> B. Braun Medical Inc, (Irvine, CA) </td><td> BBR-L7502 </td><td></td></tr><tr><td> Steriele zoutoplossing </td><td> APP Pharmaceuticals, (Schaumburg, IL) </td><td> 918610 </td><td></td></tr><tr><td> Dun kunststof matrix membraan (Biobrane) </td><td> Bertek Pharmaceuticals, (Morgantown, WV) </td><td> 62794-096-251 </td><td></td></tr><tr><td> Kunstmatige dura </td><td> Gore Verhinderen MVP Dura Substitute, WL Gore and Associates, (Flagstaff, AZ) </td><td> 1MVP40 </td><td></td></tr><tr><td> 5-0 zijden hechtdraden </td><td> Ethicon, Inc (Somerville, NJ) </td><td> K-580 </td><td></td></tr><tr><td> Wond clips </td><td> Perfect - Ets Bruneau, (Burnea, Frankrijk) </td><td> A75 </td><td></td></tr><tr><td> TL-stereomicroscoop </td><td> Leica Microsystems, (Wetzlar, Duitsland) </td><td> MZ16 </td><td></td></tr><tr><td> CCD-camera </td><td> Hamamatsu, (Bridgewater, NJ) </td><td> ORCA-Rx2 </td><td></td></tr><tr><td> Temperatuurregelaar </td><td> Wereld precisie-instrumenten (Sarasota, FL) </td><td> ATC 1000 </td><td></td></tr><tr><td> Metamorph software </td><td> Molecular Devices, (Sunnyvale, CA) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Photoshop </td><td> Adobe Systems, San Jose, CA </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live-imaging van de dorsale wortel axonen na rhizotomy

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

De primaire sensorische axonen gewond door spinale wortel verwondingen niet te regenereren in het ruggenmerg, wat leidt tot chronische pijn en blijvende zintuiglijke verlies. Regeneratie van dorsale wortel (DR) axonen in het ruggenmerg wordt voorkomen op de dorsale wortel entry zone (DREZ), de interface tussen het centrale zenuwstelsel en PNS. Ons begrip van de moleculaire en cellulaire gebeurtenissen die regeneratie te voorkomen op DREZ is onvolledig, deels omdat complexe veranderingen die gepaard gaan met een zenuwbeschadiging zijn afgeleid uit post-mortem analyses. Dynamische cellulaire processen, zoals regeneratie van axonen, worden het best bestudeerd met technieken die real-time gebeurtenissen met meerdere waarnemingen van ieder levend dier te vangen. Ons vermogen om neuronen te controleren serieel in vivo is dramatisch toe als gevolg van revolutionaire innovaties in de optica en de muis genetische manipulatie. Verscheidene lijnen van thy1-GFP transgene muizen, waarin de subsets van neuronen genetisch zijn geëtiketteerd in verschillende fluorescerende kleuren, maken individuele neuronen af te beelden in vivo 1. Deze muizen zijn uitgebreid gebruikt voor in vivo beeldvorming van de hersenen de spieren 2-4 en 5-7, en hebben nieuwe inzichten in de fysiologische mechanismen die statische analyses niet konden hebben opgelost. Beeldvormend onderzoek van neuronen in het ruggenmerg wonen nog maar kort geleden begonnen. Lichtman en zijn collega&#39;s voor het eerst gedemonstreerd op hun haalbaarheid door het bijhouden van gewonde dorsale kolom (DC) axonen met een wide-field microscopie 8,9. Multi-foton in vivo beeldvorming van diep gepositioneerd DC axonen, heeft microglia en bloedvaten ook bereikt 10. In de afgelopen jaren, hebben wij de pioniers bij de toepassing van in vivo beeldvorming tot regeneratie van axonen DR gebruik van wide-field microscopie en H lijn van thy1-YFP muizen monitor. Deze studies hebben geleid tot een nieuwe hypothese over de reden waarom DR axonen worden verhinderd regenereren in het ruggenmerg 11. In H lijn van thy1-YFP muizen, zijn te onderscheiden YFP + axonen oppervlakkig geplaatst, die het mogelijk maakt meerdere axonen tegelijk worden gecontroleerd. We hebben geleerd dat DR axonen te komen tot DREZ beter worden afgebeeld in de lumbale dan in cervicale ruggenmerg. In dit rapport beschrijven we een aantal strategieën die we hebben gevonden nuttig om een ​​succesvolle lange termijn en herhaalde beeldvorming van regenererende axonen DR verzekeren. Deze omvatten methoden die herhaald intubatie en respiratoire onderbreking elimineren, minimaliseren van de operatie-geassocieerde stress en littekenvorming, en het verwerven van een stabiele beelden op hoge resolutie zonder fototoxiciteit.

Een<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging-protocol om de primaire sensorische axonen volgende achterwortelganglia verpletteren monitor is beschreven. De procedures maken gebruik van wide-field fluorescentie microscopie en thy1-YFP transgene muizen, en staan ​​herhaalde beeldvorming van regeneratie van axonen meer dan 4 cm in de PNS en axon interacties met de interface van het CZS.

Live-Imaging van de dorsale wortel Axonen na Rhizotomy

De primaire sensorische axonen die beschadigd zijn door letsel aan de spinale wortels regenereren niet in het ruggenmerg, wat leidt tot chronische pijn en permanent sensorisch verlies. ...

Het algemene doel van deze procedure is het onderzoeken van de regeneratie van de dorsale wortel om een methode te ontdekken waarmee aanzienlijke regeneratie na letsel aan de spinale wortel kan worden geïnduceerd. Dit wordt bereikt door eerst een spinale hemi-laminectomie uit te voeren die de rechter L5 dorsale wortel blootlegt en visualisatie van YFP-gelabelde positieve axonen in het ruggenmerg en de dorsale wortel mogelijk maakt. Vervolgens wordt de L5 dorsale wortel zorgvuldig geplet om minimale bloedingen te garanderen.De plek van de verbrijzeling wordt vervolgens gefotografeerd na de verbrijzeling om de positie van de beschadigde dorsale wortel in laesie te verifiëren. Gedurende verschillende tijdstippen worden de plek van het letsel en de entry zone van de dorsale wortel gefotografeerd om het vermogen van de beschadigde axonen om te regenereren in het ruggenmerg te bepalen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen waaruit blijkt dat regenererende axonen snel worden geïmmobiliseerd en stationair blijven zodra ze de entry zone van de dorsale wortel of DREZ binnengaan.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken, zoals beeldvorming in

live-imaging-of-dorsal-root-axons-after-rhizotomy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Cheah, M., et al. Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates a step-by-step procedure for injecting a viral suspension into the dorsal root ganglia (DRGs) and inducing a controlled axonal injury via a dorsal root crush in an anesthetized rat. The protocol involves exposing the DRGs, delivering a growth-promoting viral vector to facilitate axonal regeneration, and severing axonal...

Modeling Sensory Axon Regeneration in a Rat Using Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury

Source: Shannonhouse, J., et al.In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia. J. Vis. Exp. (2023).The video demonstrates an in vivo calcium imaging technique to monitor neuronal activity in the dorsal root ganglia (DRG) of a transgenic mouse. DRG neurons express a calcium indicator that increases fluorescence intensity upon binding to calcium. Mechanical or thermal stimuli applied to a hind paw generate action potentials that...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in the Intact Dorsal Root Ganglia of a Mouse

Hoewel het perifere zenuwstelsel (PNS) in staat is om significant herstel na een blessure, is weinig bekend over de cellulaire en moleculaire mechanismen die dit fenomeen regeren. Met behulp van levende, transgene zebravis en een reproduceerbare zenuw doorsnijding test, kunnen we dynamische gliacel gedrag te bestuderen tijdens zenuw degeneratie en regeneratie.

Motor Nerve doorsnijding en Time-lapse beeldvorming van gliacellen Gedrag Live zebravis

GABAergic presynaptische remming is een krachtig remmend mechanisme op het ruggenmerg belangrijk motorische en sensorische signalen integratie in ruggenmerg netwerken. Onderliggende primaire afferente depolarisatie kan worden gemeten door registratie van de dorsale wortel potentialen (DRP). Hier laten we een methode van in vivo opname van DRP in muizen.

Meten Spinal Presynaptische Remming in muizen door dorsale wortel Potentiële Recording<em&gt; In Vivo</em

We presenteren een protocol dat gebruikmaakt van twee-foton excitatie time-lapse microscopie om gelijktijdig de dynamica van axon- en myeline-verwondingen in real time te visualiseren. Dit voorgestelde protocol maakt studies mogelijk van zowel intrinsieke als extrinsieke factoren die het lot van centrale gemyeliniseerde axonen na verwonding kunnen beïnvloeden en kunnen bijdragen aan permanente klinische handicaps.

Een Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model Mechanismen van axonale degeneratie Beoordeel in real-time

Dit protocol presenteert het gebruik van een dorsale wortelganglion (DRG) injectie met een virale vector en een gelijktijdige dorsale wortelbeschadiging bij een volwassen rat als een model om sensorische axonregeneratie te bestuderen. Dit model is geschikt voor het onderzoeken van het gebruik van gentherapie om sensorische axonregeneratie te bevorderen.

Ganglion Injection en dorsale Root crush als een model voor Sensory Axon Regeneration

Electroporation is een effectieve aanpak te leveren van genen van belangen in cellen. Door deze aanpak in vivo toe te passen op de neuronen van volwassen muis achterwortelganglia ganglion (DRG), beschrijven we een model voor het bestuderen van axon regeneratie in vivo.

Behandelende zoogdieren Axon regeneratie: In Vivo Electroporation van volwassen muis achterwortelganglia Ganglion

Single-Fiber opname is een effectieve elektrofysiologische techniek die toepasbaar is op de centrale en perifere zenuwstelsels. Samen met de voorbereiding van intact DRG met de bijgevoegde sciatische zenuw, het mechanisme van geleiding falen wordt onderzocht. Beide protocollen verbeteren het begrip van de relatie van het perifere zenuwstelsel met pijn.

Gebruik van in vivo single-Fiber opname en intact dorsale wortel ganglion met bijgevoegde Sciatische zenuw om het mechanisme van geleidings falen te onderzoeken

Dit protocol beschrijft de chirurgische blootstelling van het dorsale wortelganglion (DRG) gevolgd door GCaMP3 (genetisch gecodeerde Ca2 + indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ beeldvorming van de neuronale ensembles met behulp van Pirt-GCaMP3-muizen tijdens het toepassen van een verscheidenheid aan stimuli op de ipsilaterale achterpoot.

In Vivo Calciumbeeldvorming van neuronale ensembles in netwerken van primaire sensorische neuronen in intacte dorsale wortelganglia

Het huidige protocol beschrijft in vivo calciumbeeldvorming voor het meten van de reacties van ensembles van lumbale-6 DRG-neuronen op somatische en viscerale stimuli. Er kunnen grondige vergelijkingen worden gemaakt tussen neuronen die reageren op verschillende stimuli. Dit protocol is waardevol voor het onderzoeken van mechanismen van viscerale pijn en somatische stimulatie, zoals acupunctuur.

In Vivo calciumbeeldvorming van de respons van neuronen in dorsale wortelganglia op somatische en viscerale stimuli

Deze studie presenteert een chirurgische manipulatie om de T-DRG bloot te leggen bij verdoofde muizen voor in vivo calciumbeeldvorming, samen met synchrone ECG-opnames. Deze methode is een geavanceerd hulpmiddel voor het bestuderen van perifere elektrische zenuwstimulatie en thoracale viscerale orgaaninputs, evenals hun interacties op het primaire sensorische niveau.

In vivo thoracale dorsale wortelganglia (DRG) calciumbeeldvorming en ECG-registratie voor het bestuderen van perifere zenuwstimulatie

Leer hoe je dorsale wortelregeneratie bestudeert met live-imaging in thy1-YFP transgene muizen na rhizotomy. Deze methode maakt herhaalde observatie van axonregeneratie mogelijk.

Live-Imaging van de dorsale wortel Axonen na Rhizotomy

Meer video's verkennen