Fluorescence Immunostaining of Rat Hippocampal Neurons within a Microfluidic Chip
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 3:50 min • July 8th, 2025
Take a microfluidic chip containing rat hippocampal neurons.
The chip features somatic and axonal reservoirs, with compartments divided by microgrooves, effectively compartmentalizing the neurons and isolating the somatic and axonal regions.
Remove the media and add formaldehyde. Incubate to fix the neurons and preserve their structure.
Remove excess formaldehyde and wash with buffer. Then, add a detergent to permeabilize the neurons.
Replace the detergent with a blocking solution to block non-specific binding sites.
Remove the blocking solution and incubate with primary antibodies that bind to specific neuronal synaptic markers, which are integral membrane proteins on synaptic vesicles.
Remove the unbound antibodies and wash with buffer.
Incubate with fluorophore-tagged secondary antibodies that bind to the primary antibodies targeting synaptic markers.
Remove unbound secondary antibodies and wash with buffer.
Under a confocal microscope, image the chip to visualize the fluorescent neuronal synaptic markers.
To begin fluorescence immunostaining, remove most of the media from the chip, keeping the interior compartments hydrated. Immediately, add 100 microliters of fixation solution to the top wells of the axonal and somatic compartments.
After one minute, add 100 microliters of fixation solution to the bottom wells, and fix the cells for 30 minutes at room temperature. Remove most of the solution from the wells, and immediately add 150 microliters of PBS to each of the top wells of the axonal and somatic compartments. Wait two minutes for the PBS to flow into the bottom wells, then, remove the PBS and rinse the wells twice more using this same process.
Following the last rinse, remove most of the PBS from the wells of the chip, and immediately add 150 microliters of PBS with 0.25% Triton X-100 to each of the top wells of the axonal and somatic compartments.
Wait for 15 minutes, and then, remove most of the liquid from the wells. Immediately add 150 microliters of blocking solution to each of the top wells of the axonal and somatic compartments. After 15 minutes, remove most of the liquid from the wells, and immediately add 100 microliters of the primary antibody solution to each of the top wells of the axonal and somatic compartments.
Cover the chip to minimize evaporation, and incubate the cells in the primary antibody for one hour at room temperature. Next, rinse the chip by removing most of the solution, and immediately adding 150 microliters of PBS to each of the top wells of the axonal and somatic compartments. After five minutes, remove the PBS from both wells, and repeat the rinse two more times.
Now, remove most of the liquid from the wells, and immediately add 100 microliters of secondary antibody in PBS to each of the top wells of the axonal and somatic compartments. Cover the chip to minimize evaporation, and incubate the chip for one hour at room temperature. As previously shown, rinse the chip three times with PBS. Then, mount and image the chips as described in the accompanying text protocol.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor fluorescentie-immunokleuring van hippocampale neuronen van ratten met behulp van een microfluïdische chip. Het proces omvat het fixeren van de neuronen, het permeabiliseren ervan en het aanbrengen van antilichamen om synaptische markers te visualiseren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Immunohistochemie
Achtergrond
- Microfluïdische chips maken compartimentering van neuronen mogelijk.
- Fluorescentie-immunokleuring is een sleuteltechniek voor het bestuderen van neuronale structuren.
- Synaptische markers zijn cruciaal voor het begrijpen van neuronale communicatie.
- Correcte fixatie en permeabilisatie zijn essentieel voor een effectieve kleuring.
Doel van het onderzoek
- Om een protocol te demonstreren voor het visualiseren van synaptische markers in neuronen.
- Om microfluïdische technologie te gebruiken voor verbeterde neuronale compartimentalisatie.
- Om een stapsgewijze handleiding te bieden voor onderzoekers in de neurowetenschappen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van de microfluidische chip met hippcampale neuronen van ratten.
- Fixatie van neuronen met formaldehyde.
- Permeabilisatie met Triton X-100.
- Toepassing van primaire en secundaire antilichamen voor kleuring.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van neuronale synaptische markers onder een confocale microscoop.
- Aantoonde effectiviteit van de microfluidische chip bij het compartimenteren van neuronen.
- Voorzien in een reproduceerbaar protocol voor fluorescentie-immunokleuring.
- Benadrukt het belang van elke stap in het kleuringsproces.
Conclusies
- De methode maakt gedetailleerde studie van synaptische structuren in neuronen mogelijk.
- Microfluïdische technologie verhoogt de precisie van neuronale experimenten.
- Dit protocol kan worden aangepast voor verschillende typen neuronale studies.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Deze methode maakt een precieze ruimtelijke analyse van neuronale subcompartimenten mogelijk, wat bijdraagt aan de validatie van targets in modellen voor neurodegeneratieve ziekten. Door de expressie van synaptische markers in axonen versus somata te isoleren, biedt het mechanische risicoreductie voor drug discovery-programma's voor het CZS. Het microfluïdische formaat verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid voor assay-ontwikkeling in de vroege ontdekkingsfase.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de lokalisatie van synaptische eiwitten te onderzoeken als functionele readout voor target-engagement.
- Operationele waarde: Compartimentalisatie vermindert biologische ruis, waardoor de signaal-ruisverhouding bij de detectie van biomarkers verbetert.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt het toetsen van hypothesen over axonale transportmechanismen of synaptische integriteit in ziektemodellen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve fluorescentie-uitlezingen van synaptische markers voor compound-screening.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde fixatie- en permeabilisatiestappen waarborgen de consistentie van de assay over verschillende runs.
- Operationele waarde: Het microfluïdische ontwerp maakt parallelle verwerking van condities mogelijk, wat de doorvoer voor lead-identificatie verhoogt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt correlatie van synaptische markerpatronen met elektrofysiologische of gedragsmatige fenotypes mogelijk.
- Operationele waarde: Compartiment-specifieke kleuring ondersteunt de afstemming van translationele biomarkers in axonopathie-modellen.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert mechanische risicoreductie door pre- versus postsynaptische bijdragen aan drug-effecten te isoleren.
Pipeline- & Workflowintegratie
De methode past binnen de vroege ontdekkingsfase om neuronale targets te valideren vóór lead-optimalisatie, met name voor CNS-indicaties waarbij subcellulaire lokalisatie voorspellend is voor functionele uitkomsten.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden door de distributie van pre- en postsynaptische markers in geïsoleerde axonen te visualiseren.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via gestandaardiseerde, reproduceerbare immunokleuring van neuronale compartimenten.
- Analytiek: Levert kwantitatieve metingen van de fluorescentie-intensiteit om de effecten van behandelingen op synaptische markers te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Legt een verbinding met preklinische continuïteit door subcellular resolutie van target engagement in ziekterelateerde neuronen mogelijk te maken.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Het microfluïdische chipformaat maakt hergebruik mogelijk over meerdere neuronale modellen en antilichaampanels.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door doelwitmodulatie te koppelen aan subcellulaire synaptische veranderingen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde fluidische toediening van reagentia.
- Strategische waarde: Vermindert biologische risico's in een laat stadium door doelwiteffecten te valideren in anatomisch opgeloste neuronale domeinen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling via compartimentspecifieke biomarker-uitlezingen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in neuronale culturen en microfluïdische handelingen.
- Afhankelijk van toegang tot confocale microscopie en fluorescentiedetectiesystemen.
- Vereist standaardisatie van antilichaamincubatie- en wasprotocollen tussen de compartimenten.
- Aanpassing aan neuronen afgeleid van menselijke iPSC's kan optimalisatie van fixatie- en permeabilisatietijden vereisen.
- Praktische beperking: de penetratie-efficiëntie van antilichamen moet worden gevalideerd voor grote of complexe synaptische targets.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Immunokleuring van biocytine gevuld en Verwerkte secties voor Neurochemische Markers
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Voorbereiding van de muis netvlies Cryo-profielen voor Immunohistochemistry
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Combinatie van multiplex fluorescentie in situ hybridisatie met fluorescerende immunohistochemie op vers ingevroren of vaste hersensecties van muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
An Immunofluorescence Staining Technique to Detect Adult Hippocampal Neurogenesis
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Compartmentalized Primary Murine Neuron Culture Using Plastic Microfluidic Chips
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Immunostaining of Interneurons in a Rat Hippocampal Section
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Immunostaining of Neurons in Mouse Brain Slices Following Fluorescence In Situ Hybridization
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Snelle Genotypering van dieren Gevolgd door Vaststelling Primaire culturen van neuronen in de hersenen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Real-time beeldvorming van Axonale Vervoer van Quantum Dot-label BDNF in primaire neuronen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Primer voor Immunohistochemie op Cryosectioned Rat Brain Tissue: Voorbeeld kleuring voor Microglia en Neuronen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026