Cel-gebaseerde Calcium Assay voor medium tot hoge throughput screening van TRP Channel functies met behulp van FlexStation 3

Het algemene doel van deze procedure is om de toepassing van Flex Station three aan te tonen voor het bestuderen van het farmacologische profiel van het transient receptor potential- of TRPA1-kanaal. Dit wordt bereikt door eerst cellen voor te bereiden die TRPA1-kanalen tot expressie brengen in 96-well microtiterplaten.

Nadat de cellen in een microplaatwasser zijn gewassen, worden de cellen geladen met de calciumgevoelige fluorescente kleurstof Fluo-4. Na een beladingsperiode voor de cellen volgen vervolgens meerdere aanvullende wasbeurten. De volgende stap van de procedure is het voorbereiden van de compoundplaat, inclusief een TRIP1 agonist en een vermeende TRIP1 antagonist.

Als laatste stap worden de softwareparameters ingesteld voor het lezen van de plaat in het Flex Station three-systeem. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die dosis-responserelaties laten zien voor de activering van trip A one door flu fonemisch zuur en inhibitie door de antagonist-verbinding A. Hoewel deze methode inzicht kan geven in 21-activeringsmechanismen door calciuminstroom te meten, kan zij ook worden toegepast om functies van andere calciumdoorlaatbare eye-kanalen en deep protein-gekoppelde receptoren te bestuderen met behulp van calciumsensitieve frozen dyes of maly-potentiaalstoffen.

Het belangrijkste voordeel van deze tactiek ten opzichte van bestaande methoden, zoals calcium-imaging en handmatige patch-mapping, is dat deze tijdbesparende techniek high-throughput screening mogelijk maakt voor de functie en modulatie van calciumkanalen, ijzerkanalen en andere Ca-mobiliserende receptoren. Kweek vóór de start van dit protocol HEK 293-cellen die stabiel zijn getransfecteerd met trip A one tot een dichtheid van 70 tot 90%, zoals beschreven in het geschreven protocol. Om de celpreparatie voor de calciumassay te starten, worden 96-wells platen gecoat door 50 µL poly-L-ornithine in elke well te pipetteren; incubeer de platen vervolgens gedurende ten minste 15 minuten bij 37 °C.

Spoel de cellen na incubatie één keer af met de fosfaatgebufferde zoutoplossing van KO. Na trypsinisatie van de HEC 2 93-cellen wordt de gewenste hoeveelheid cellen overgebracht naar een steriele conische buis van 15 milliliter en gecentrifugeerd. Verwijder het supernatant en resuspendeer de resulterende celpellet.

Dispenseer in het DMEM-kweekmedium aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum 100 µL van de cel-suspensie in elke put van de 96-wellplaat. Laat de plaat met behulp van een meerkanaals pipet gedurende ten minste 30 minuten in de zuurkast staan voordat deze voor 20 tot 44 uur in de bevochtigte celkweekincubator wordt geplaatst. Bereid voor de voorbereiding van de calciumassay eerst de oplossingen voor zoals beschreven in het geschreven protocol.

Zodra dit is voorbereid, mengt u 10 µL van 1 mM flu oh 4:00 AM met 10 µL onic. F1 27, en breng de volledige inhoud over naar 5 mL flu. Oh vier assaybuffer aangevuld met 0,1% bovine serumalbumine.

Was vervolgens de cellen die zijn gekweekt in 96-wellplaten tweemaal met HBSS in een volume van 80 µL per well met behulp van een microplaatwasser. Voeg na het wassen met een multichannelpipet de Fluo-4 AM-laadoplossing toe in een volume van 50 µL per well en incubeer de plaat één uur bij 37 °C. Bereid tijdens de beladingstijd van één uur een reeks 3x-oplossingen van agonisten, een reeks 3x-oplossingen van een antagonist en een groot volume 300 µM agonist in de Fluo-4 assaybuffer.

Pipetteer 300 µL van de verdunde verbindingoplossingen in een 96-well compoundplaat. Zorg er waar mogelijk voor dat de seriële verdunning van een verbinding en de overeenkomstige positieve en negatieve controles in dezelfde kolom van de compoundplaat worden geplaatst. Aangezien het Flex station drie één enkele kolom tegelijk afleest, pipetteert u als laatste stap bij de celvoorbereiding 300 µL van de 300 µM agonistoplossing naast elke well die de antagonist bevat.

Was de geladen cellen drie keer met de flu oh four zuurbuffer met behulp van de microplaatwasser na de laatste wasbeurt. Laat 80 µL van de flu oh four zuurbuffer in elke put achter. Om met het aflezen van de plaat te beginnen, schakelt u het Flex Station three systeem in en start u de soft max Pro 5.2 software.

Sla het experiment op onder een nieuwe bestandsnaam bij de instellingen. Kies de flex-modus en voer de parameters in om het agonistisch en antagonistisch effect te meten, zoals vermeld in de schriftelijke procedure. Plaats vervolgens een nieuwe doos met tips, de compoundplaat en de leesplaat in de overeenkomstige trays van het flex-station. Drie.

Start het aflezen van de plaat door op de leesknop in de Soft Max Pro-software te klikken. De Flex Station three leest één kolom tegelijk uit en voegt verbindingen toe op de vooraf geprogrammeerde tijdstippen zonder het afleesproces te onderbreken. Zodra de run is voltooid, kunnen de experimentele gegevens direct worden verwerkt met de Soft Max PRO-software of worden gekopieerd en geplakt in een spreadsheetprogramma zoals Microsoft Excel.

Om de gegevens te analyseren, worden concentratie-respons-curven gegenereerd voor de TRPA1-agonist fluofenomeenzuur en voor de vermeende TRPA1-antagonist verbinding A met behulp van de methode van de kleinste kwadraten, zoals beschreven in de geschreven procedure. TRPA1 is een calciumpermeabel kationkanaal waarvan activering leidt tot een calciuminstroom die kan worden gedetecteerd met de calciumsensitieve kleurstof Fluo-4 AM. Representatieve traces van de tijdskuren van fluorescentiewijzigingen in reactie op een reeks concentraties fluofenomeenzuur (FFA) worden getoond bij hogere concentraties. FFA veroorzaakte fluorescentiestijgingen vertonen een veel snellere kinetiek dan bij lagere concentraties, ondanks vergelijkbare piekwaarden van de fluorescentie.

Om deze verschillen te onderscheiden, is de concentratie-responskurve opgesteld door de initiële snelheden van de fluorescentie-toename te meten. Na toevoeging van verschillende concentraties FFA werd de halfmaximale effectieve concentratie van FFA bepaald op 55,4 micromolair. De concentratie-responsrelatie van inhibitie van de FFA-opgewekte calciumrespons door een vermeende TRPA1-antagonist, verbinding A, wordt eveneens getoond.

Een dosis reduceerde onafhankelijk de respons van de trip A one-cellen op FFA met een halfmaximale inhiberende concentratie van 4,3 micromolair. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de farmacologische profielen van triple A one en gerelateerde kanalen kunt bestuderen met behulp van de flag station drie.