Name: Cel-gebaseerde Calcium Assay voor medium tot hoge throughput screening van TRP Channel functies met behulp van FlexStation 3 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Leer een calcium-gebaseerde assay voor TRPA1-kanaalonderzoek met de FlexStation 3. Deze methode maakt medium tot hoge doorvoerscreening van farmacologische profielen mogelijk voor nieuwe therapeutische inzichten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken dr. John Hancock, dr. Ray Grill, dr. Andrew Morris en dr. Olga Chumakova voor hun ondersteuning. Het FlexStation 3-systeem maakt deel uit van de UTHSC Cytodynamic Imaging Facility. We danken tevens dr. Ardem Patapoutian en dr. Michael Bandell van het Scripps Research Institute en het Genomics Institute of the Novartis Research Foundation (GNF) voor het verstrekken van de HEK293-hTRPA1 stabiele cellijn. Het onderzoek wordt gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de NIH (GM081658 aan MXZ), het Texas Medical Center Digestive Diseases Center (aan HH) en de Mission Connect/TIRR Foundation (aan HH).

1. Celpreparaten in 96-well platen Voor HEK293 cellen tijdelijk trasfected met menselijke TRPA1 cDNA <ol><li> HEK293 cellen worden gekweekt voor een tot twee dagen in Minimal Essential Medium Dulbecco's (DMEM) met 4,5 mg / ml glucose (Thermo Scientific, SH3002201), aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (Invitrogen, 16000-044), 50 stuks / ml penicilline en 50 ug / ml streptomycine (Invitrogen, 15140-163). Op de dag van de transfectie, moet de cel dichtheid bereikt 70-90%. </li><li> Coat 96-well platen eveneens 50 ul poly-L-ornithine (Sigma P3655, 20 ug / ml in steriel gedistilleerd water) aan elk putje en incubatie bij 37 ° C gedurende ten minste 15 minuten. Spoel elk putje een keer met fosfaat Dulbecco's gebufferde fysiologische zoutoplossing (DPBS) zonder Mg 2 + en Ca 2 + (Thermo Scientific, SH3002803). De plaat kan worden achtergelaten in de celkweek kap voor een paar uur. </li><li> Voor elke well van een 96-well plaat, verdund in een 1,5 ml Eppendorf buis 0,2 mg cDNA in 25 ul OPTI-MEM (Invitrogen, 31985-070). Proportioneel op basis van het aantal putten te getransfecteerd door dezelfde cDNA. Ook verdunnen in een aparte 1,5 ml Eppendorf buis 0,4 ul Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) in 25 ul OPTI-MEM voor elk goed te worden getransfecteerd. Schaal dit op basis van het totale aantal putten te getransfecteerd. </li><li> Kort vortex de verdunde cDNA en Lipofectamine 2000 en laat ze bij kamertemperatuur zitten voor ongeveer 5 minuten. </li><li> Overdracht een gelijk volume van de verdunde Lipofectamine 2000 aan de buis die de verdunde cDNA, vortex bevat en laat het mengsel op kamertemperatuur zitten voor 15 minuten tot 2 uur. Gedurende deze tijd, overdracht van de cDNA / Lipofectamine 2000 mengsel bij 49 ul / putje van de poly-L-ornithine gecoate plaat. </li><li> Trypsinize de HEK293 cellen (stap 1.1), tel celdichtheid behulp van een hemocytometer of gravin geautomatiseerde celgetalmeter (Invitrogen, C10227), en breng een gewenste hoeveelheid van cellen (in het algemeen ongeveer ~ 125,000-150,000 cellen / putje) om een ​​15-ml steriel conische bodem centrifugebuis. Centrifugeer bij 1000 x rpm gedurende 5 minuten. Resuspendeer cellen op ~ 1,250,00-1,500,000 cellen / ml in het kweekmedium DMEM, aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum, maar zonder antibiotica. </li><li> Verdeel 98 ui celsuspensie in elk putje dat de cDNA-Lipofectamine 2000 mengsel met behulp van een meerkanaals pipetter of de MicroFill Microplate Dispenser (Bio-Tek) bevat. Laat de plaat in de kap zitten voor minstens 30 minuten voordat het naar de bevochtigde celcultuur incubator. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 voor 20 tot 44 uur. </li></ol> Voor HEK293 cellen die stabiel tot expressie TRPA1 <ol start="8"><li> Volg stap 1.2 voor het coaten van 96-well platen. </li><li> De induceerbare HEK293-hTRPA1 cellijn werd rijkelijk voorzien door dr. A. Patapoutian (The Scripps Research Institute) en onderhouden in hetzelfde medium als het wild-type HEK293 cellen (stap 1.1), maar aangevuld met 5 ug / ml blasticidine (Invitrogen, A1113902) en 50 ug / ml hygromycine B (Invitrogen, 10687010). Wanneer celdichtheid ongeveer 90% bereikt, trypsinize cellen, tellen celdichtheid, en centrifugeer de gewenste hoeveelheid cellen op 1000 x rpm gedurende 5 minuten. Resuspendeer cellen bij een dichtheid van ~ 1 miljoen cellen / ml in dezelfde cultuur medium aangevuld met doxycycline (Fisher, BP26535, 0,25 ug / ml). </li><li> Doseer de celsuspensie aan poly-L-ornithine gecoate platen bij 100 ul / putje met behulp van een meerkanaals pipetter of de MicroFill (Bio-Tek). Laat de plaat in de kap zitten voor minstens 30 minuten voordat het naar de bevochtigde celcultuur incubator. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 voor 16 - 24 uur. </li></ol> 2. Oplossingen <ol><li> Gebufferde zout Hank's oplossing (HBSS) wordt gebruikt als de extracellulaire oplossing. Het bevat (in mm): 137 NaCl, KCl 5,4, 0,25 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 1,3 CaCl2, 1,0 MgSO 4, 1,0 MgCl 2, 10 glucose, 10 HEPES, met een pH ingesteld op 7,4 met behulp van 1 N NaOH). </li><li> Fluo-4 testbuffer bevat 2 mM probenecide bij HBSS. Maak 250 mM voorraad probenecide (Sigma, P8761) in 0,5 N NaOH. Verdun tot HBSS in een verhouding van 1:125. Stel de pH op 7,4 met behulp van een N HCl. </li></ol> 3. Cel laden met Fluo-4 AM <ol><li> Los 1 mg Fluo-4 AM (Invitrogen, F14202) in 912 ul watervrij DMSO een voorraad oplossing van 1 mM te maken. De Fluo-4 AM voorraad oplossing kan worden bewaard bij -20 ° C gedurende ten minste een maand. </li><li> Mix 10 ul 1 mM Fluo-4 AM met 10 ul Pluronic F-127 (Invitrogen, P3000MP, 20% (w / v) oplossing in DMSO) en breng de gehele inhoud aan 5 ml Fluo-4 testbuffer (Stap 2.2) aangevuld met 0,1% Bovine serum albumine (Sigma, A9418). </li><li> Was de cellen gekweekt in 96-wells platen (Stap 1.7 of 1.10) met HBSS bij 80 ul / putje 2 keer met een microplaat ring (zoals ELx405TM van Bio-Tek). </li><li> Voeg de Fluo-4 AM laad-oplossing (stap 3.2) bij 50 ul / putje met behulp van een meerkanaals pipetter of de MicroFill (Bio-Tek) en de plaat op 37 incubeer ° C gedurende 1 uur. </li><li> Was de cellen drie keer met de Fluo-4 testbuffer (Stap 2.2.) Met de ELx405TM microplaat wasmachine. Na de laatste wasbeurt, laat 80 ul van de Fluo-4 assay buffer in elk putje. </li></ol> 4. Bereiding van verbinding plaat <ol><li> Tijdens de 1 uur cel laden tijd, voor te bereiden een reeks van 3x verdunningen van agonisten (of antagonisten) van 3x van de gewenste uiteindelijke concentraties in het Fluo-4 assay buffer. </li><li> Pipetteer 250-300 pi van de verdunde stof oplossingen voor een 96-well plaat compound. Schik op de seriële verdunningen van een verbinding en de bijbehorende positieve en negatieve controles in dezelfde kolom van de verbinding plaat hebben wanneer het is mogelijk omdat FlexStation 3 leest een enkele kolom per keer. </li></ol> 5. Plaat lezen in FlexStation 3 <ol><li> Zet het systeem (FlexStation 3, computer, en de SoftMax Pro 5.2 software) </li><li> Sla het experimenteren met een nieuwe bestandsnaam. Op de set-up, kies FLEX-modus en voer de volgende waarden: </li></ol> Protocol nr. 1, agonistisch effect <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table1.jpg" alt="Tabel 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tabel 1"> Protocol nr. # 2, antagonist effect <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table2.jpg" alt="Tabel 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tabel 2"><ol start="3"><li> Plaats een nieuwe tip doos, samengestelde plaat en het lezen plaat op de juiste trays in FlexStation 3 en klik op "lezen" te klikken. De FlexStation 3 leest een column op een moment en voeg stoffen in de voorgeprogrammeerde tijdstippen zonder onderbreking van de lezing. Het duurt ongeveer 3 minuten (5 min voor Protocol nr. 2) tot eind lezen een column en de machine zal doorgaan naar de volgende kolom met uitgevoerd samengestelde toevoegingen zoals geprogrammeerd door de gebruiker in stap 5.2 tot alle columns worden gelezen gelezen. </li></ol> 6. Data-analyse <ol><li> Experimentele gegevens kunnen direct worden verwerkt met behulp van de SoftMax Pro 5.2 software of gekopieerd en geplakt in een spreadsheet-programma, zoals Microsoft Excel. Concentratie-respons curve van een TRPA1 agonist flufenamic zuur (FFA) is gebouwd met behulp van de volgende kleinste kwadraten fitting routine. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq1.jpg" alt="Vergelijking 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Vergelijking 1"> , Waarbij Y wordt de waargenomen respons, Y max is de genormaliseerde maximale respons, C is de bijbehorende concentratie van het geneesmiddel, EC 50 is de concentratie die een half-maximale reactie opgeroepen, en n H is de schijnbare Hill coëfficiënt. Concentratie-inhibitie curve voor een vermeende TRPA1 antagonist verbinding A wordt verkregen door middel van een vaste concentratie van FFA (100 uM), en geleidelijk verhogen van de concentratie van de stof A. IC 50 van mengvoeders voor A wordt berekend door de kleinste-kwadraten passend bij de volgende vergelijking. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq2.jpg" alt="Vergelijking 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Vergelijking 2"> , Waarbij Y wordt de waargenomen respons-en Y-max is genormaliseerd grootste gevoeligheid, [Ant] is de overeenkomstige verbinding A de concentratie, IC 50 is de antagonist concentratie die half-maximale remming van de FFA-opgewekte reacties produceert, en n H is de schijnbare Hill coëfficiënt. </li></ol> 7. Representatieve resultaten: TRPA1 is een Ca 2 +-permeabele kation kanaal, de activering van dat leidt tot calcium influx die kunnen worden gedetecteerd door de Ca 2 +-gevoelige kleurstof, Fluo-4 (1-2). Een HEK293-hTRPA1 stabiele cellijn werd gebruikt om de concentratie-respons relaties van TRPA1 agonisten en antagonisten te bestuderen. Cellen werden geladen met Fluo-4 AM, geplaatst in 80 ul van de assay buffer, en lezen met behulp van FlexStation 3. Na het opnemen van de basislijn fluorescentie gedurende 30 s, werden 40 pi van een seriële verdunning van de TRPA1 agonist, FFA, elk op 3x van de gewenste uiteindelijke concentratie, toegevoegd aan de cellen door middel van een multi-channel pipetter opgenomen als een onderdeel van de vloeistofcomponenten module van FlexStation 3. De fluorescentie wijzigingen werden gecontroleerd op een extra 180 s. De relatieve Fluo-4 fluorescentie veranderingen voor elk putje werden uitgedrukt als AF = (F - F 0), waarbij F en F 0 zijn fluorescentie waarden op het moment van de rente en het begin van de lezing, respectievelijk. Representatief zijn sporen van de tijd cursussen om fluorescentie verandert in reactie op een reeks van FFA-concentraties zijn weergegeven in Fig. 1. Noot voor de laatste vier FFA concentraties, hoewel de maximale respons levels zijn vergelijkbaar, de activatie kinetiek is duidelijk sneller bij de hogere dan bij de lagere FFA concentraties. Daarom, om deze verschillen is de concentratie te onderscheiden - respons relatie werd gebouwd door het meten van de aanvankelijke tarieven (helling) van de fluorescentie te verhogen door toevoeging van verschillende concentraties van de FFA (afb. 2). Het half maximaal effective concentratie (EC 50) van de FFA werd bepaald op 55,4 uM (n = 3). Voor het testen van de vermeende TRPA1 antagonist, een verbinding, hebben we een soortgelijk experiment met behulp van protocol # 2 (stap 2). In dit geval werd een reeks van verdunningen van de antagonist toegevoegd op 30 s (40 pl 3x gewenste uiteindelijke concentraties) en de FFA werd toegevoegd 180 s later (60 pl op 300 uM voor een uiteindelijke concentratie van 100 uM). Compound Een dosis-afhankelijk verminderde de reactie van de TRPA1 cellen FFA met een half maximale remmende concentratie (IC 50) van 4,3 uM (n = 3) (afb. 2). <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Concentratie-afhankelijke activering van de menselijke TRPA1 door de FFA. Sporen zijn FFA-opgeroepen toename van de fluorescentie in de tijd (alleen de antwoorden in de eerste 60 s worden aangetoond dat beter illustreren de snelle kinetiek van de FFA-geëvoceerde responsen). Houdt u er rekening mee dat bij hogere concentraties FFA fluorescentie toenemen opgeroepen met een veel snellere kinetische dan bij lagere concentraties, ook al is de piek fluorescentie niveaus vergelijkbaar waren. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2 Concentratie -. Respons relaties voor de FFA-geïnduceerde fluorescentie verandering en samengestelde A-geïnduceerde remming van de FFA reactie in de menselijke TRPA1 stabiel uitgedrukt in HEK293 cellen. Δ, De concentratie - response-relatie van de FFA werd bepaald door het meten van de aanvankelijke tarieven (helling) van de genormaliseerde fluorescentie te verhogen door toevoeging van verschillende concentraties van de FFA. O, concentratie-respons relatie van de remming van de FFA opgewekte calcium reactie van een vermeende TRPA1 antagonist, compound A.

<ol><li>Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRPA1+channels+by+fenamate+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).</li>
<li>Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+activates+damage-sensing+TRPA1+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels.</a> Nat Chem Biol. 5, 183-190 (2009).</li>
<li>Perney, T. M., Hirning, L. D., Leeman, S. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+calcium+channels+mediate+neurotransmitter+release+from+peripheral+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Multiple calcium channels mediate neurotransmitter release from peripheral neurons.</a> Proc Natl Acad Sci. 83, 6656-6659 (1986).</li>
<li>Mason, S. A., MacLeod, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+action+potential+duration+and+calcium+regulation+in+males+and+females%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Cardiac action potential duration and calcium regulation in males and females.</a> Biochem Biophys Res Commun. 388, 565-570 (2009).</li>
<li>Raat, N. J., Wetzels, G. E., DeMey, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-contraction+relationship+in+rat+mesenteric+arterial+smooth+muscle.+Effects+of+exogenous+and+neurogenic+noradrenaline%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Calcium-contraction relationship in rat mesenteric arterial smooth muscle. Effects of exogenous and neurogenic noradrenaline.</a> Pflugers Arch. 436, 262-269 (1998).</li>
<li>Alagarsamy, S., Johnson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+calcium+channel+involvement+in+NMDA-induced+activation+of+NOS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent calcium channel involvement in NMDA-induced activation of NOS.</a> Neuroreport. 6, 2250-2254 (1995).</li>
<li>Su, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM7+regulates+cell+adhesion+by+controlling+the+calcium-dependent+protease+calpain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">TRPM7 regulates cell adhesion by controlling the calcium-dependent protease calpain.</a> J Biol Chem. 281, 11260-11270 (2006).</li>
<li>Dubinsky, J. M., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+concentrations+during+%22chemical+hypoxia%22+and+excitotoxic+neuronal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium concentrations during "chemical hypoxia" and excitotoxic neuronal injury.</a> J Neurosci. 11, 2545-2551 (1991).</li>
<li>George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channel+activation+augments+NMDA+receptor+function+and+promotes+neurite+outgrowth+in+immature+cerebrocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sodium channel activation augments NMDA receptor function and promotes neurite outgrowth in immature cerebrocortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 3288-3301 (2009).</li>
<li>Price, K. L., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FlexStation+examination+of+5-HT3+receptor+function+using+Ca2%2B+-+and+membrane+potential-sensitive+dyes%3A+advantages+and+potential+problems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">FlexStation examination of 5-HT3 receptor function using Ca2+ - and membrane potential-sensitive dyes: advantages and potential problems.</a> J Neurosci Methods. 149, 172-177 (2005).</li>
<li>Laude, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+functional+assays+of+recombinant+IP3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Rapid functional assays of recombinant IP3 receptors.</a> Cell Calcium. 38, 45-51 (2005).</li>
<li>Marincsak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analgesic+drug%2C+tramadol%2C+acts+as+an+agonist+of+the+transient+receptor+potential+vanilloid-1%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">The analgesic drug, tramadol, acts as an agonist of the transient receptor potential vanilloid-1.</a> Anesth Analg. 106, 1890-1896 (2008).</li>
<li>Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+high+throughput+screening+assays+against+three+subtypes+of+Ca%28v%293+T-type+channels+using+molecular+and+pharmacologic+approaches.+Assay+Drug+Dev+Technol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Validation of high throughput screening assays against three subtypes of Ca(v)3 T-type channels using molecular and pharmacologic approaches. Assay Drug Dev Technol.</a> 5, 191-203 (2007).</li>
<li>Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-sensing+G+protein-coupled+receptor+mobilizes+calcium+in+human+synovial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Proton-sensing G protein-coupled receptor mobilizes calcium in human synovial cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, C601-C608 (2005).</li>
<li>Boulay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+a+novel+mammalian+homolog+of+Drosophila+transient+receptor+potential+%28Trp%29+involved+in+calcium+entry+secondary+to+activation+of+receptors+coupled+by+the+Gq+class+of+G+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein.</a> J Biol Chem. 272, 29672-29680 (1997).</li>
<li>Nanda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+of+adrenergic+receptors+by+measuring+intracellular+calcium+using+the+FlexStation+scanning+fluorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter.</a> Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten gedeclareerd.

Intracellulair Ca2+ speelt een belangrijke rol bij veel fysiologische en pathologische aandoeningen, zoals de afgifte van neurotransmitters (3), het cardiale actiepotentiaal (4), spiercelcontractie (5), cel-signaaltransductie (6-7) en excitotoxische celdood (8). De meting van intracellulaire Ca2+-spiegels helpt bij het verduidelijken van functionele veranderingen van Ca2+-permeabele kanalen in het plasmamembraan of intracellulaire organellen en de bijdrage van Ca2+ aan de...

<table><tbody><tr><td>FlexStation 3</td><td>Molecular Devices</td><td>FLEX3</td><td></td></tr><tr><td>96-well FlexStation pipetpunten</td><td>Molecular Devices</td><td>9000-0912</td><td></td></tr><tr><td>96-wells platen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655090</td><td></td></tr><tr><td>96-wells heldere platen met platte bodem</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12430-104</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14202</td><td></td></tr><tr><td>PluronicF-127</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P36551</td><td></td></tr><tr><td>probenecid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td></td></tr><tr><td>Bovien serumalbumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr></tbody></table>

cel-gebaseerde calcium assay voor medium tot hoge throughput screening van trp channel functies met behulp van flexstation 3

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

De FlexStation 3 van Molecular Devices is een multi-mode microplate-reader voor op het laboratoriumblad die in staat is tot geautomatiseerde fluorescentiemetingen in multi-well platen. Het apparaat is ideaal voor medium- tot high-throughput screening in academische omgevingen. Het beschikt over een geïntegreerde vloeistofoverdrachtsmodule uitgerust met een multi-channel pipetteerder, waarbij de machine één kolom tegelijk uitleest om fluorescentieveranderingen van diverse fluorescerende reagentia te monitoren. Zo is de FlexStation 3 gebruikt om de functie van Ca2+-permeabele ionkanalen en G-proteïnegekoppelde receptoren te bestuderen door veranderingen in de intracellulaire vrije Ca2+-spiegels te meten. Transient receptor potential (TRP)-kanalen vormen een grote familie van niet-selectieve kationkanalen die belangrijke rollen spelen in veel fysiologische en pathofysiologische functies. De meeste TRP-kanalen zijn calciumpermeabel en induceren een calciuminstroom bij activatie. In deze video demonstreren we de toepassing van de FlexStation 3 om het farmacologische profiel van het TRPA1-kanaal te bestuderen, een moleculaire sensor voor talrijke schadelijke stimuli. HEK293-cellen die transiënt of stabiel menselijke TRPA1-kanalen tot expressie brengen en zijn gekweekt in 96-well platen, worden geladen met de Ca2+-gevoelige fluorescerende kleurstof Fluo-4. Real-time fluorescentieveranderingen in deze cellen worden gemeten vóór en tijdens de toediening van een TRPA1-agonist met behulp van de FLEX-modus van de FlexStation 3. Ook het effect van een vermeende TRPA1-antagonist werd onderzocht. Gegevens worden overgedragen vanuit de SoftMax Pro-software om concentratie-responskurven van TRPA1-activatoren en -inhibitoren op te stellen.

Deze video biedt een gedetailleerd protocol voor het bestuderen van het farmacologische profiel van menselijke TRPA1-kanalen met behulp van FlexStation 3. Het protocol behandelt details over de celvoorbereiding, het laden van de kleurstof en het bedienen van de microplaatlezer, FlexStation 3.

Cel-gebaseerde Calcium Assay voor medium tot hoge throughput screening van TRP Channel functies met behulp van FlexStation 3

De FlexStation 3 van Molecular Devices is een multi-mode microplate-reader voor op het labtafel die in staat is tot geautomatiseerde fluorescentiemetingen in multi-wellplaten. Het is ...

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van de toepassing van Flex Station three om het farmacologische profiel van het transient receptor potential- of TRPA1-kanaal te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst cellen voor te bereiden die TRPA1-kanalen tot expressie brengen in 96-wells microtiterplaten.Nadat de cellen in een microplate-wasser zijn gewassen, worden de cellen geladen met de calciumgevoelige fluorescente kleurstof Flu-4. Na een beladingsperiode van de cellen volgen verschillende aanvullende wasbeurten. De volgende stap van de procedure is het voorbereiden van de compound-plaat, inclusief een triplo-agonist en een putatieve triplo-antagonist.Als laatste stap worden de softwareparameters ingesteld voor het uitlezen van de plaat in het Flex Station three-systeem. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die dosis-responskurves tonen voor de activering van trip A one door flu phonemic acid, en inhibitie door de antagonist verbinding A. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in 21-activeringsmechanismen door calciuminstroom te meten, kan zij ook worden toegepast om functies van andere calciumpermeabele eye-kanalen en deep proteïne-gekoppelde receptoren te bestuderen met behulp van calciumgevoelige frozen-kleurstoffen of maly-potentiaalkleurstoffen.Het belangrijkste voordeel van deze tactiek ten opzichte van bestaande methoden zoals calcium-imaging en handmatige patch-mapping is dat deze tijdbesparende techniek high-throughput screening mogelijk maakt voor de functie en modulatie van calciumformules, ijzerkanalen en andere ca-mobiliserende receptoren. Kweek vóór het begin van dit protocol HEC 2 93-cellen die stabiel zijn getransfecteerd met trip A one tot een dichtheid van 70 tot 90%, zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Begin de celpreparatie voor de calciumassay door 96-wells platen te coaten door 50 µL poly-L-ornithine in elke well te pipetteren en de platen gedurende ten minste 15 minuten te incuberen bij 37 °C.Spoel de cellen na incubatie één keer af met de fosfaatgebufferde zoutoplossing van KO. Na trypsinering van de HEC 2 93-cellen brengt u de gewenste hoeveelheid cellen over naar een steriele conische buis van 15 milliliter en centrifugeert u de monster. Verwijder het supernatant en resuspendeer de resulterende celpellet.Breng in het DMEM-kweekmedium, aangevuld met 10% hitte-inactief foetaal runderserum, 100 µL van de celsuspensie aan in elke put van de 96-wells plaat. Laat de plaat met een multichannelpipet minimaal 30 minuten in de zuurkast staan voordat deze gedurende 20 tot 44 uur in de bevochtigde cellentkweekincubator wordt geplaatst. Bereid voor de voorbereiding van de calciumassay eerst de oplossingen zoals beschreven in het geschreven protocol.Zodra voorbereid, meng 10 µL van 1 mM flu oh 4:00 AM met 10 µL van onic. F1 27, en breng de volledige inhoud over naar vijf milliliter flu. Oh four assaybuffer aangevuld met 0,1% bovine serumalbumine.Was vervolgens de cellen die zijn gegroeid in 96-wellplaten met HBSS in een volume van 80 µL per well, twee keer met een microplate washer. Voeg na het wassen de Fluo-4 AM-laadoplossing toe in een volume van 50 µL per well met een multichannelpipet en incubeer de plaat gedurende één uur bij 37 °C. Bereid tijdens de laadperiode van één uur een reeks 3x-oplossingen van agonisten, een reeks 3x-oplossingen van antagonist en een groot volume 300 µM agonist in de Fluo-4-assaybuffer met een pipet.Pipetteer 300 µL van de verdunde verbinding-oplossingen in een compoundplaat met 96 wells. Zorg ervoor dat de seriële verdunning van een verbinding en de bijbehorende positieve en negatieve controles indien mogelijk in dezelfde kolom van de compoundplaat worden geplaatst. Aangezien het Flex station drie één enkele kolom per keer uitleest, pipetteert u als laatste stap van de celvoorbereiding 300 µL van de 300 µM agonist-oplossing naast elke well die de antagonist bevat.Was de geladen cellen drie keer met de flu oh four zuurbuffer met behulp van de microplaatwasser na de laatste wasbeurt. Laat 80 µL van de flu oh four zuurbuffer in elke put achter. Om te beginnen met het uitlezen van de plaat, schakelt u het Flex Station three systeem in en start u de soft max Pro 5.2 software.Sla het experiment op onder een nieuwe bestandsnaam bij de setup. Kies de flex-modus en voer de parameters in om het agonist- en antagonisteneffect te meten, zoals vermeld in de schriftelijke procedure. Plaats vervolgens een nieuwe doos met tips, de compoundplaat en de leesplaat in de juiste trays van het flex-station. Drie.Start het aflezen van de plaat door op de read-knop in de Soft Max Pro-software te klikken. De Flex Station three leest één kolom per keer af en voegt verbindingen toe op de voorgeprogrammeerde tijdstippen zonder het aflezen te onderbreken. Zodra de run is voltooid, kunnen de experimentele gegevens direct worden verwerkt met de Soft Max PRO-software of worden gekopieerd en geplakt in een willekeurig spreadsheetprogramma, zoals Microsoft Excel.Om de gegevens te analyseren, worden concentratie-responscurves gegenereerd voor de TRPA1-agonist flupheniczuur en voor de vermeende TRPA1-antagonist verbinding A, met behulp van de kleinste-kwadratenmethode zoals beschreven in de schriftelijke procedure. TRPA1 is een calciumpermeabel kationkanaal waarvan activatie leidt tot een calciuminstroom die kan worden gedetecteerd met de calciumsensitieve kleurstof Fluo-4 AM. Representatieve traces van de tijdsvolgorde van fluorescentieveranderingen in reactie op een reeks flupheniczuur- of FFA-concentraties worden getoond bij hogere concentraties. FFA veroorzaakte fluorescentiestijgingen vertonen een veel snellere kinetiek dan bij lagere concentraties, ondanks vergelijkbare piekwaarden van de fluorescentie.Om deze verschillen te onderscheiden, werd de concentratie-responscurve opgesteld door de initiële snelheden van de fluorescentiestijging te meten. Na toevoeging van variërende concentraties FFA werd de halfmaximale effectieve concentratie van FFA bepaald op 55,4 micromolar. De concentratie-responsrelatie van de inhibitie van de door FFA opgewekte calciumrespons door een vermeende TRPA1-antagonist, verbinding A, wordt eveneens getoond.Een dosis verminderde onafhankelijk de respons van de A1-adenosinereceptoren op FFA met een halfmaximale inhiberende concentratie van 4,3 micromolair. Na het bekijken van deze video moet u een goed inzicht hebben in hoe u de farmacologische profielen van A1 en gerelateerde kanalen kunt bestuderen met behulp van de FluoStation 3.

cell-based-calcium-assay-for-medium-to-high-throughput-screening-trp

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Werkwijzen voor het ontwikkelen en valideren van een kwantitatieve fluorescentie assay voor het meten van de activiteit van de actieve gelijkrichter kalium (Kir) kanalen voor high-throughput screening verbinding gepresenteerd.

High-throughput screening voor kleine-molecule Modulators van Actieve Rectifier kaliumkanalen

De hier beschreven op fluorescentie gebaseerde calcium-mobilisatie assay is een medium-doorvoer screening omgekeerde farmacologie identificatie van functioneel activerend ligand (en) orphan G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR).

Karakterisering van G-eiwit gekoppelde receptoren met een op fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie Assay

Hier presenteren we technieken voor het beeldvormen van lokale IP3-gemedieerde Ca2+-gebeurtenissen met behulp van fluorescentiemicroscopie in intacte zoogdiercellen die zijn geladen met Ca2+-indicatoren, samen met een algoritme dat de identificatie en analyse van deze gebeurtenissen automatiseert.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signalen in gekweekte zoogdiercellen

Wij presenteren protocollen voor de toepassing van onze genetisch gecodeerde calciumindicator (GECI) CatchER + voor het monitoren van snelle calcium transiënten in het endoplasmatische / sarcoplasmatische reticulum (ER / SR) van HEK293 en skeletspier C2C12 cellen met behulp van real-time fluorescentiemicroscopie. Een protocol voor de in-situ K d meting en kalibratie wordt ook besproken.

Monitoring ER / SR Calciumvrijstelling met de gerichte Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor CatchER<sup&gt; +</sup

De beschreven cellulaire assay is ontworpen voor de identificatie van CXC chemokine receptor 4 (CXCR4)-interagerende agenten die remmen of deze te stimuleren, concurrerend of allosterically, de intracellulaire Ca2 + release geïnitieerd door CXCR4 activering.

Een kinetische fluorescentie gebaseerde Ca2 + mobilisatie Assay te identificeren van G eiwit-gekoppelde Receptor agonisten en antagonisten Allosteric modulatoren

Technieken voor het genereren van een bibliotheek van korte peptiden die mestcellen kunnen activeren via de MRGPRX2-receptor worden beschreven. Bijbehorende technieken zijn eenvoudig, goedkoop en kunnen worden uitgebreid naar andere celreceptoren.

Screening van peptiden die MRGPRX2 activeren met behulp van Engineered HEK Cells

Het huidige protocol beschrijft volledig optische controle en observatie van geactiveerde cellulaire activiteit in iPSC-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CM's) voor high-throughput geneesmiddelenscreening en toxiciteitstests. Multiparametrische kwantificering van fenotypische patronen in tijd en ruimte worden getoond. Langetermijneffecten van geneesmiddelen gedurende uren, of opeenvolgende metingen gedurende dagen, worden aangetoond.

High-Throughput optische controle en opname calciumsignaal in iPSC-afgeleide cardiomyocyten voor toxiciteitstests en fenotypische geneesmiddelenscreening

Dit protocol beschrijft een methode voor de studie van elektrogene membraaneiwitten door het meten van veranderingen in membraanpotentiaal. Deze test biedt een platform voor de functionele uitlezing van meerdere ionkanalen endogeen uitgedrukt in epitheelcellijnen.

Een op fluorescentie gebaseerde test van membraanpotentiaal voor functionele studie met hoge doorvoer van twee endogene ionkanalen in twee epitheelcellijnen

In dit werk wordt een high-throughput, intracellulaire calciumfluorescentietest voor 384-well platen beschreven om kleine molecuulbibliotheken te screenen op recombinante G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's). Het doelwit, de kininereceptor van de runderkoortsteek, Rhipicephalus microplus, komt tot expressie in CHO-K1-cellen. Deze test identificeert agonisten en antagonisten die dezelfde cellen gebruiken in één "dual-addition" assay.

Een "Dual-Addition" Calcium Fluorescentie Assay voor de High-Throughput Screening van Recombinant G Protein-Coupled Receptors

De farmacologische targeting van ionkanalen is een veelbelovende benadering voor de behandeling van solide tumoren. Gedetailleerde protocollen worden verstrekt voor het karakteriseren van ionkanaalfunctie in kankercellen en het testen van de effecten van ionkanaalmodulatoren op de levensvatbaarheid van kanker.

Screening van ionkanalen in kankercellen

Dit artikel presenteert een methode voor real-time, kwantitatieve monitoring van calciumionconcentraties (Ca2+) in cellen met behulp van eencellige Ca2+ beeldvorming met de Fura-2/AM-kleurstof. Deze techniek maakt het mogelijk om de kleurstof efficiënt te laden en de Ca2+ -niveaus nauwkeurig te berekenen door middel van fluorescentie-intensiteitsverhoudingen, waardoor het een eenvoudige en snelle aanpak is voor onderzoekstoepassingen.

Eencellige calciumbeeldvorming voor het bestuderen van de activering van calciumionkanalen

Leer een calcium-gebaseerde assay voor TRPA1-kanaalonderzoek met de FlexStation 3. Deze methode maakt medium tot hoge doorvoerscreening van farmacologische profielen mogelijk voor nieuwe therapeutische inzichten.

Cel-gebaseerde Calcium Assay voor medium tot hoge throughput screening van TRP Channel functies met behulp van FlexStation 3

Meer video's verkennen