Name: De voorbereiding van Virale DNA van nucleocapsiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Leer hoe je hoogzuivere herpesvirus-nucleocapside-DNA isoleert uit geïnfecteerde cellen met behulp van ultracentrifugatie en fenol-chloroformextractie. Deze methode levert DNA van hoge concentratie en zuiverheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs waarderen de bijdragen van Greg Smith, Lisa Pomeranz, Matt Lyman, Marlies Eldridge, Halina Staniszewska Goraczniak, en leden van de Enquist lab in fine-tuning van dit protocol.

1. Eerste dag: virale infectie en voorbereiding van buffers <ol><li> Bereid 50-10 gerechten (15 cm diameter) van weefselkweek cellen voor infectie, bijvoorbeeld PK-15 cellen voor pseudorabies virus (PRV) of Vero-cellen voor herpes simplex virus (HSV). </li><li> Wanneer de cellen zijn 95 - 100% confluent, infecteren ze op een (MOI) van 5-10. Om dit te doen, elke plaat met behulp van virus voorraad in een totaal volume van 4 ml per plaat te enten, dan de platen incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Rock platen voorzichtig om de 15 minuten om ervoor te zorgen dat de cel monolayer blijft volledig gecoat door het virus inoculum. Ondertussen, warm het medium voor de volgende stap. </li><li> Na een uur van de infectie, zuigen virale inoculum van de platen, voeg 15 ml warm medium, en incuberen bij 37 ° C voor 12-20 uur in een vochtige incubator. </li><li> Bereid LCM buffers (zie tabel 1) en rock overnacht bij 4 ° C voor een grondige mengen. Bereid TNE voor resuspensie van viraal DNA (zie tabel 2). </li></ol> 2. Tweede dag, Fase 1: Cell Lysis en Ultracentrifugatie <ol><li> Bevestig visueel dat de infectie van cellen heeft geleid tot een uniforme cytopathogeen effect (CPE). Laat infectie om de voortgang totdat alle cellen hebben afgerond, maar nog niet opgetild de plaat. </li><li> Schraap de geïnfecteerde cellen in het medium, en combineren cellen en het medium in 50 ml conische buizen. Het aantal conische buizen die nodig is voor deze stap is afhankelijk van het aantal schotels voor infectie in stap 1.2 hierboven, kan bijvoorbeeld een 50 ml conische buis worden gebruikt om de pellet een maximum van drie gerechten van 15 ml medium per Optioneel:. Spoel de platen met 10 ml PBS en te combineren met de cellen en medium. </li><li> Centrifugeer cellen en medium voor 10 minuten bij 2000 ten opzichte centifugal kracht (RCF) bij kamertemperatuur, vervolgens aspireren supernatant en resuspendeer elke pellet in 10 ml PBS. Als de pellet van een virale infectie werd verspreid in meerdere conische buizen in stap 2.2, kunnen deze worden gerecombineerd in een conische buis bij deze stap. Herhaal het centrifugeren en aspiratie Optioneel:. Dit pellet kan worden opgeslagen bij -20 ° C en het protocol op een later tijdstip. </li></ol> 3. Tweede dag, Fase 2: Ultracentrifugatie Houd de celpellet en LCM buffers op ijs zo mogelijk in de volgende stappen. <ol><li> Voeg β-mercapto-ethanol tot 0% glycerol - LCM buffer. Begin de koeling van de ultracentrifuge (voor stap 3.9 hieronder) door het naar 4 ° C en het inschakelen van het vacuüm. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 5 ml van 0% glycerol - LCM buffer totdat het niet langer klonterig. Indien nodig, vortex de buis te breken eventuele onopgeloste celpellet. </li><li> Extract door het toevoegen van 1,5 ml Freon (1,1,2-trichloor-1 ,2,2-trifluorethaan) en de vortexen krachtig. Onmiddellijk centrifuge gedurende 10 min op 2000 RCF bij een temperatuur van 4 ° C. Verzamel de bovenste laag met een breed-boring pipetpunt (het vermijden van de interface) en over te dragen aan een nieuwe buis Optioneel:. Als de pellet is een geleiachtig solide, kunt u snel giet de bovenste laag in een nieuwe buis. </li><li> Herhaal de Freon extractie-en centrifuge opnieuw. </li><li> Verzamel de bovenste laag (~ 5 ml) en over te dragen aan een nieuwe polyallomer ultracentrifuge buis. Voeg β-mercapto-ethanol aan de twee resterende glycerol - LCM buffers. </li><li> Bereid een gradiënt in de polyallomer centrifugebuis door de onderliggende Freon extract (toplaag) met 3 ml van 5% glycerol - LCM (middelste laag) en vervolgens onderliggende opnieuw met 2,5 ml 45% glycerol - LCM (onderste laag). Gebruik een dunne pipet om overloop van de buis inhoud te vermijden. </li><li> Indien nodig, bereid een gelijkwaardige balans buis met dezelfde verhoudingen van LCM buffers. </li><li> Overdracht buizen in ultracentrifuge emmers. Balans emmers tot op 0,1 g van elke andere, door voorzichtig het toevoegen van extra 0% glycerol - LCM buffer om de bovenste laag (~ 50 tot 100 ul per keer). </li><li> Met behulp van een koude ultracentrifuge met een horizontale of swingende emmer rotor, draai de evenwichtige monsters gedurende 1 uur bij 77.000 RCF (bijv. 25000 rpm voor een SW41Ti rotor) bij een temperatuur van 4 ° C. </li><li> Tijdens de ultracentrifugatie, maak een glas haak aan drijvende DNA vast te leggen op de ethanol precipitatie stap (4.6 hieronder). Houd beide uiteinden van een glas Pasteur pipet en schorten de middelste gedeelte boven een vlam. Wanneer een deel van glas is bijna gesmolten, trek aan de glazen rekken, buigt u het voorzichtig aan een strak gebogen haak (&lt;90 graden) te creëren, en trek scherp af te sluiten het einde. Als het uiteinde van de glazen haak open is, houdt u de tip over de vlam, zodat het glas smelt genoeg om het te sluiten. </li><li> Na de ultracentrifugatie, ziet u een dun ondoorzichtige pellet met een donkere vlek in het midden. Zorgvuldig aspireren de vloeistof uit de tube, waaronder drippings langs de zijkanten, maar het vermijden van de pellet op de bodem van de buis. </li><li> Voeg 0,5 ml TNE bij kamertemperatuur. </li><li> Laat de pellet zitten voor ten minste 10 minuten voor hydratatie van de pellet mogelijk te maken. Optional: De pellet kan ook 's nachts opnieuw in suspensie in TNE, indien bewaard bij 4 ° C. </li></ol> 4. Derde dag: "Ghost" DNA Neerslag <ol><li> Verdeel de pellet door pipetteren met een klein kaliber pipetpunt (bijvoorbeeld een P200 pipetpunt). Maak je geen zorgen over het afschuiven van deze stap, omdat het virale DNA is nog steeds in capsiden op dit punt. Voeg de volgende reagentia voor de buis met de virale pellet, bij kamertemperatuur, tot capsiden te vernietigen: <ul><li> 4,25 ml TNE </li><li> 0,25 ml 10% SDS </li><li> 2 mg proteïnase K </li></ul> Schud om deze reagentia te mengen. Er moet een lichte toename van de viscositeit worden. </li></ol> Pas op voor scheren van hier, bijv. gebruik op grote boring pipetten en niet vortex de virale materiaal <ol start="2"><li> Extract virale eiwitten door het toevoegen van 5 ml van de fenol-chloroform en begin onmiddellijk omkeren of vortexen om een ​​emulsie te houden. Mix voor 10 seconden, dan centrifuge de emulsie gedurende 5 minuten bij 2000 RCF bij kamertemperatuur. Verzamel de bovenste laag met een breed-boring pipetpunt, het vermijden van de interface, en transfer naar een nieuwe buis Optioneel:. Gebruik phase lock gel (PLG) buizen in deze stap om besmetting van de interface te voorkomen. </li><li> Herhaal de fenol-chloroform extractie en centrifuge opnieuw. </li><li> Na de tweede fenol-chloroform extractie, het verzamelen van de bovenste laag in een 30 ml glazen buis Corex en chill de buis bij -20 ° C gedurende 10-15 minuten, zorg dat het niet bevriezen. </li><li> Voeg 10 ml ijskoude ethanol, hebben betrekking op de buis (bv. door rekken een stuk van Parafilm M over de top), en omkeren om onmiddellijk te mengen. Kijk uit voor een DNA "geest" te verschijnen, die bestaat uit een dun stroperige neerslag. Keer de buis voorzichtig om verder te mengen en de plakkerige DNA precipitaten samen naar cluster veroorzaken. </li><li> Gebruik een glazen haak aan het DNA ghost (s) vast te leggen. Voorzichtig blot het DNA om overtollige vloeistof te verwijderen, plaats dan de haak (down tip) in een 1,5 ml tube en laten drogen. Voeg 0,25 tot 0,5 ml van TE naar de DNA-spook te ontbinden. Laat resuspensie van DNA om door te gaan voor ten minste een uur. Bewaar DNA bij 4 ° C. Optioneel: DNA-opbrengst te maximaliseren, breken van het glas in de haak 1,5 ml buis, kan zo dat resuspensie uit de glasscherven blijven in de tijd. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Met een voldoende hoge MOI, moeten cellen tot volledige CPE binnen ~ 18 uur na infectie (HPI) voor de wild-type PRV stammen, en ~ 24 HPI voor wild-type HSV-1-stammen (figuur 1). Zodra de geïnfecteerde cel pellet wordt geoogst, kan de resterende stappen-protocol volledig in een lange dag of uitgevoerd in twee dagen (figuur 2). Bij de voorbereiding van glas haken aan de DNA-spook te vangen, is het belangrijk om de haak hoek kleiner dan 90 graden, zodat later kan passen in de basis van een 1,5 ml buis (figuur 3). Het afdichten van de tip van deze haak voorkomt dat DNA-verlies in de pipet. DNA spoken vorm tijdens de neerslag stap en zal verschijnen als witte, stroperige draden (figuur 4). Deze totale en plakken aan elkaar en / of het glas haak gebruikt om het DNA vast te leggen. Dus hetzelfde glas haak kan worden gebruikt voor het verzamelen van meerdere draden van DNA vanuit de neerslag oplossing. <table border="1"><tbody><tr><td> Kies een column gebaseerd op de gewenste volume: </td><td> 10 ml </td><td> 15 ml </td><td> 20 ml </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td> 1M KCL </td><td> 1,3 ml </td><td> 1,9 ml </td><td> 2,5 ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M Tris (pH 7,4) </td><td> 300 ul </td><td> 450 ul </td><td> 600 ul </td><td> 1,2 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 50 ui </td><td> 75 pl </td><td> 100 pi </td><td> 200 pi </td></tr><tr><td> 0,5 EDTA </td><td> 10 pi </td><td> 15 pl </td><td> 20 pl </td><td> 40 pi </td></tr><tr><td> NP40/IGEPAL </td><td> 50 ui </td><td> 75 pl </td><td> 100 pi </td><td> 200 pi </td></tr><tr><td> β-mercapto-ethanol (onmiddellijk toe te voegen voor gebruik) </td><td> 4,3 pl </td><td> 6,5 pl </td><td> 8,6 pl </td><td> 17,2 ul </td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td colspan="5"> Gebruik voor de gewenste proporties procent glycerol (0, 5, of 45%) </td></tr><tr><td> 0% glycerol </td><td> Geen </td><td> Geen </td><td> Geen </td><td> Geen </td></tr><tr><td> water </td><td> 8,3 ml </td><td> 12,5 ml </td><td> 16,7 ml </td><td> 33,4 ml </td></tr><tr><td> 5% glycerol </td><td> 0,5 ml </td><td> 0,8 ml </td><td> 1,0 ml </td><td> 2,0 ml </td></tr><tr><td> water </td><td> 7,8 ml </td><td> 11,7 ml </td><td> 15,7 ml </td><td> 31,4 ml </td></tr><tr><td> 45% glycerol </td><td> 4,5 ml </td><td> 6,8 ml </td><td> 9,0 ml </td><td> 18,0 ml </td></tr><tr><td> water </td><td> 3,8 ml </td><td> 5,7 ml </td><td> 7,7 ml </td><td> 15,4 ml </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Recepten voor de bereiding van LCM buffers <table border="1"><tbody><tr><td> Voor 50 ml volume </td></tr><tr><td> 5 ml 1 M NaCl </td></tr><tr><td> 2,5 ml 1 M Tris, pH 7,5 </td></tr><tr><td> 1 ml 0,5 EDTA </td></tr><tr><td> 41,5 ml H 2 O </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Voorbereiding van de TNE (0,1 M NaCl, 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA) <table border="1"><tbody><tr><td> Voor 1 L volume </td></tr><tr><td> 0,2 g KCl </td></tr><tr><td> 0,2 g KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 8 g NaCl </td></tr><tr><td> 1.15g Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> H 2 O tot 1L </td></tr></tbody></table> Tabel 3. Voorbereiding van PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, pH 7,0) <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. PK15 cellen (A) voorafgaand aan de infectie, (B) halverwege infectie, en (C) op cytopathische effect (CPE), na een hoge multipliciteit van infectie. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Overzicht van het protocol. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Drie representatieve voorbeelden van glas haken gebruikt om het virale DNA geesten te verzamelen. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Representatief voorbeeld van een goed gevormde en overvloedige DNA "ghost".

<ol><li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li>
<li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins%3A+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li>
<li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li>
<li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li>
<li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus%2C+an+alphaherpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+virology%22">Principles of virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pseudorabies+virus%3A+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li>
<li>Roizman, B., Pellett, P. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , 2 ed, Lippincott Williams & Wilkins. 2381-2397 (2001).</li>
<li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li>
<li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li>
<li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Delen van dit protocol zijn oorspronkelijk ontwikkeld voor viraal DNA isolatie in BSL4 omstandigheden, maar het past zich even goed aan niet-BSL omstandigheden. 4 Wij vaak dit protocol te gebruiken om DNA te isoleren van de alfa-herpesvirussen PRV en HSV-1, die DNA-genoom hebben ingesloten in een eiwitachtige capside en omgeven door een lipide envelop. 7,8 Toch is het waarschijnlijk direct aan te passen aan andere grote DNA-virussen, waaronder bèta-en gamma-herpesvirussen en adenovirussen. Vergelij...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Freon (1,1,2-trichloor-1 ,2,2-trifluorethaan) </td><td> Visser </td><td> T178-4 </td><td> Neem contact op met uw instelling voor richtlijnen voor het correcte verwijdering van Freon-houdend afval, of zie Mendez et al.. voor potentiële Freon alternatieven. 9 </td></tr><tr><td> Fase lock gel buizen, Heavy 15ml capaciteit </td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td> Facultatief </td></tr><tr><td> Polyallomer ultracentrifuge buizen </td><td> Beckman * </td><td> 331372 * </td><td> * Selecteer tubes geschikt is voor uw eigen ultracentrifuge, deze zijn opgenomen als een voorbeeld </td></tr><tr><td> NP-40 / Igepal </td><td> Sigma </td><td> I-3021 </td><td></td></tr><tr><td> PK-15 cellen </td><td> ATCC </td><td> CCL-33 </td><td></td></tr><tr><td> Vero cellen </td><td> ATCC </td><td> CCL-81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

de voorbereiding van virale dna van nucleocapsiden

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Virussen zijn obligate cellulaire parasieten, en dus de studie van hun DNA te isoleren vereist viraal materiaal uit de buurt van de gastheercel verontreinigingen en DNA. Diverse afgeleide toepassingen vereisen grote hoeveelheden pure viraal DNA, die wordt verzorgd door dit protocol. Deze toepassingen omvatten virale genoom, waar het wegnemen van gastheer-DNA is cruciaal voor data-uitgang te optimaliseren voor virale sequenties, en de productie van nieuwe virale recombinante stammen, waar de co-transfectie van gezuiverd plasmide en lineaire viraal DNA vergemakkelijkt recombinatie. 1,2, 3 Deze procedure maakt gebruik van een combinatie van extracties en dichtheid op basis van centrifugatie te isoleren gezuiverd lineair herpesvirus nucleocapside DNA van geïnfecteerde cellen. 4,5 De eerste zuiveringsstappen doel om gezuiverd viraal capsiden isoleren, bevatten en het virale DNA te beschermen tijdens de extracties en centrifugeren stappen dat cellulaire eiwitten en DNA te verwijderen. Lysis van nucleocapsiden releases dan viraal DNA, en de twee laatste fenol-chloroform stappen te verwijderen resterende eiwitten. De uiteindelijke DNA veroverd op oplossing is sterk geconcentreerd en zuiver, met een gemiddelde OD 260/280 van 1.90. Afhankelijk van de hoeveelheid van de gebruikte geïnfecteerde cellen, opbrengsten van viraal DNA range 150 tot 800 ug of meer. De zuiverheid van dit DNA is het stabiel tijdens langdurige opslag bij 4C. Dit DNA is dus bij uitstek geschikt voor high-throughput sequencing, high fidelity PCR-reacties, en transfecties. Voor het begin van het protocol, is het belangrijk om te weten het gemiddeld aantal cellen per schaal (bijvoorbeeld een gemiddelde van 8 x 10 6 PK-15 cellen in een confluente 15 cm schotel) en de titer van de virale voorraad worden gebruikt ( bijv. 1 x 10 8 plaque-vormende eenheden per ml). Deze zijn nodig om de juiste multipliciteit van infectie (MOI) te berekenen voor het protocol. 6 Bijvoorbeeld, om een 15 cm schotel van PK-15 cellen met de bovenstaande virale voorraad, bij een MOI van 5 infecteren, zou u 400 pi virale voorraad en verdun het met 3,6 ml van het medium (in totaal inoculatie volume van 4 ml voor een 15 cm plaat). Meerdere viraal DNA-preparaten kunnen worden bereid op hetzelfde moment. Het aantal gelijktijdige voorbereiding wordt alleen beperkt door het aantal buizen gehouden door de ultracentrifuge rotor (een per virus, zie stap 3.9 hieronder). Hier beschrijven we de procedure zoals ook al is gedaan voor een virus.

We beschrijven het proces van het isoleren van hoge zuiverheid herpesvirus nucleocapside DNA van geïnfecteerde cellen. De uiteindelijke DNA veroverd op oplossing is van de hoge concentratie en zuiverheid, waardoor het bij uitstek geschikt voor high-throughput sequencing, high fidelity PCR-reacties, en transfecties om nieuwe virale recombinanten te produceren.

De voorbereiding van Virale DNA van nucleocapsiden

Virussen zijn obligate cellulaire parasieten, waardoor de studie van hun DNA vereist dat viraal materiaal wordt geïsoleerd van contaminanten en DNA van de gastheercel. ...

Deze video demonstreert een procedure om viraal nucleocapside-DNA van hoge zuiverheid te isoleren uit geïnfecteerde cellen. Eerst worden lipide membranen gedenatureerd met behulp van een dual-free extractie. Het monster wordt vervolgens ultracentrifugeerd om de virale nucleocapsiden te pelletteren en deze te scheiden van lichtere cellulaire en virale componenten.Detergentia en proteinase K worden toegevoegd om het virale DNA uit de gepellette nucleocapsiden vrij te maken. Vervolgens worden dubbele fenol-chloroformextracties uitgevoerd om alle resterende eiwitten te verwijderen. Ten slotte wordt het virale DNA in oplossing geprecipiteerd.Uiteindelijk laten de resultaten zien dat het sterk geconcentreerde en zuivere virale DNA uit deze geïnfecteerde cellen is geïsoleerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden waarbij geen vrije extracties of ultracentrifugatie worden toegepast, is dat het hier geproduceerde virale DNA zeer lage niveaus van contaminatie met gastheer-DNA bevat, waardoor het ideaal is voor downstream-procedures zoals PCR en deep sequencing van virale genomen. We hebben deze methode voor het eerst gebruikt in de beginperiode van het werk met recombinant DNA, toen extra voorzorgsmaatregelen van groot belang waren.We hebben deze procedure ontwikkeld om viraal DNA te isoleren terwijl er in een glovebox onder BSL-4-omstandigheden wordt gewerkt. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, omdat de stappen voor de vorming van de gradiënt en het 'ghosting' van het DNA moeilijk aan te leren zijn. Dit komt doordat het aanbrengen van de gradiënt een uiterst vaste hand vereist en het DNA-ghost dat in de oplossing neerslaat moeilijk te zien kan zijn als men geen eerdere ervaring heeft met het herkennen ervan.Begin deze procedure door vijf tot 10 weefselkweekschalen van 15 centimeter diameter met cellen voor te bereiden voor infectie. Hier worden PK 15-cellen voorbereid voor infectie met pseudo-rabiësvirus; wanneer de cellen 95 tot 100% confluent zijn, wordt het medium vervangen door vier milliliters medium dat het virus bevat. Bij een MOI van vijf tot 10 worden de platen gedurende één uur geïncubeerd in een bevochtigde 37 °C incubator bij 5% CO2, waarbij elke 15 minuten wordt gecontroleerd.Schud de platen voorzichtig heen en weer om ervoor te zorgen dat de cellaag volledig bedekt blijft door het virusinoculum. Verwarm tijdens de incubatie het medium voor de volgende stap. Aspireer na één uur infectie het virale inoculum uit de platen.Voeg vervolgens 15 milliliters warm medium toe en incubeer gedurende 12 tot 20 uur bij 37 degrees Celsius in een bevochtigde incubator. Bereid tot slot, ter voorbereiding op de experimenten van de volgende dag, een verse batch LCM- en TNE-buffers. Let op dat de toevoeging van NP 40 zal leiden tot de vorming van slierten in de acquis-oplossing.Plaats de bereide oplossingen gedurende de nacht op een rocker bij vier graden Celsius. Tegen de volgende dag zouden de oplossingen volledig geïntegreerd moeten zijn. Plaats de schaal op de tafel van een compoundmicroscoop en bevestig visueel dat infectie van de cellen heeft geleid tot een uniform cytopathisch effect.Alle cellen moeten zijn afgerond, maar mogen niet van de plaat zijn losgekomen. Als de cellen nog niet zijn afgerond, dient de incubatie te worden voortgezet tot er cytopathische effecten worden waargenomen. Schraap vervolgens de geïnfecteerde cellen in het medium en combineer de cellen in het medium in 50 milliliter conische buizen om de opbrengst te verhogen.Spoel de platen met 10 milliliters PBS en voeg dit samen met de cellen in medium, centrifugeer vervolgens de cellen en het medium gedurende 10 minuten bij 2000 RCF bij kamertemperatuur om eventueel resterend medium en serum weg te spoelen, aspireer het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 milliliters PBS. Herhaal het centrifugeren en aspireren. Indien het experiment niet op dezelfde dag wordt voortgezet, bewaar de pellet dan bij minus 20 degrees Celsius tot deze wordt gebruikt voor de stappen die in deze sectie worden beschreven.Het is belangrijk om de celpellet en de LCM-buffers zoveel mogelijk op ijs te bewaren. Bereid de ultrafiltratie voor door Beamer capto ethanol toe te voegen aan de 0% glycerol LCM-buffer, zodat de uiteindelijke concentratie Beamer capto ethanol 0,043% is. Stel de ultracentrifuge tevens in op vier graden Celsius en schakel het vacuüm in terwijl de ultracentrifuge afkoelt. Voeg vijf milliliter 0% glycerol LCM-buffer met 0,043% Beamer capto ethanol toe aan de celpellet en pipetteer herhaaldelijk op en neer om de pellet te resuspenderen.Zorg ervoor dat alle klonters indien nodig worden opgebroken. Vortex de buis om eventuele onopgeloste celpellets te verbreken. Voeg vervolgens 1,5 milliliters toe om de cellulaire en virale membranen te extraheren.Vortex het Freon onmiddellijk krachtig. Centrifugeer 10 minuten bij 2000 RCF bij vier graden Celsius. Na het centrifugeren zullen er twee lagen zijn.De bovenste waterlaag bevat virale nucleïden, capsiden en eiwitten, terwijl de onderste Freon-laag virale en cellulaire membranen bevat. Verzamel met een pipetteertip met een wijde opening de bovenste laag, waarbij u de interface vermijdt, en breng deze over naar een nieuwe conische buis van 50 milliliter. Het is belangrijk om te voorkomen dat de Freon-laag wordt geraakt en dat dit organische oplosmiddel wordt overgebracht naar de waterlaag in de nieuwe buis.Voeg freon toe en vortex zoals voorheen om de freon-extractie na centrifugatie te herhalen. Verzamel de bovenste laag van ongeveer vijf milliliters en breng deze over naar een schone poly aamer ultracentrifugebuis. Voeg beamr capto ethanol tot 0,043% toe aan de twee resterende glycerol LCM-buffers.Bereid vervolgens een gradiënt in de polymere centrifugebuis door met een dunne pipet drie milliliter 5%glycerol LCM onder het Freon-extract aan te brengen. Plaats hier vervolgens 2,5 milliliter 45%glycerol LCM onder. Indien nodig kan op dezelfde wijze een balansbuis worden voorbereid met dezelfde proporties LCM-buffers.Plaats de buisjes in de emmers van de ultracentrifuge en balanceer ze tot binnen 0,1 gram van elkaar door voorzichtig extra 0% glycerol LCM-buffer aan de bovenste laag toe te voegen, 50 tot 100 µL per keer. Centrifugeer de gebalanceerde monsters gedurende één uur bij 77.000 RCF bij vier °C tijdens de ultracentrifugatie. Gebruik een glazen Pasteurpipet om een haakje te maken om het drijvende DNA tijdens de ethanolprecipitatiestap op te vangen.Houd beide uiteinden van de pipet vast en houd het middelste gedeelte boven een vlam. Wanneer een gedeelte van het glas warm is, trek er dan voorzichtig aan om het glas te rekken. Buig het voorzichtig om een haak met een nauwe hoek van minder dan 90 graden te creëren en trek er krachtig aan om het uiteinde af te sluiten.Als de punt van de glazen haak open is, houd de punt dan boven de vlammen zodat het glas voldoende smelt om deze te sluiten. Na de ultracentrifugatie is er een dun, ondoorzichtig pellet met een donkere plek in het midden, waarin de virale nucleocapsiden zich bevinden. Aspireer voorzichtig de vloeistof uit de buis, inclusief druppels langs de wanden, maar vermijd het pellet onderin de buis.Voeg 0,5 milliliters TNE toe bij kamertemperatuur. Laat het pellet minimaal 10 minuten rusten om hydratatie van het pellet mogelijk te maken. Als de procedure niet tot de volgende dag wordt voortgezet, bewaar het resuspendeerde pellet dan bij vier graden Celsius.Breek de gehydrateerde pellet op door met een P 200-tip herhaaldelijk vloeistof op te zuigen en weer uit te stoten. Maak u in deze stap geen zorgen over shearing, aangezien het virale DNA op dit punt nog in capsiden zit. Voeg om de capsiden open te breken het volgende toe aan de virale pellet bij kamertemperatuur: 4,25 milliliters TNE, 0,25 milliliters 10% SDS en twee milligram proteinase EK.Zachtjes schudden om deze reagentia te mengen. Er zou nu een lichte toename in viscositeit moeten zijn aangezien de capsiden zijn vernietigd; er moet voorzichtig worden gewerkt om afschuifkrachten op het DNA te vermijden. Gebruik pipetten met een brede opening en vortex het virale materiaal niet om de virale eiwitten te extraheren.Breng het monster over naar een phase lock gel-buis en voeg vijf milliliters fenol-chloroform toe. Begin onmiddellijk met inverteren om gedurende ten minste 10 seconden een emulsie-mengsel te behouden via inverteren. Centrifugeer de emulsie vervolgens gedurende vijf minuten bij 2000 RCF bij kamertemperatuur.Neem na het centrifugeren de bovenste laag en breng deze over naar een nieuwe phase lock gel-buis. Herhaal de fenol-chloroformextractie en centrifugeer opnieuw na de tweede fenol-chloroformextractie. Verzamel de bovenste laag in een glazen coex-buis van 30 milliliter en koel de buis 10 tot 15 minuten af bij -20 °C.Zorg ervoor dat het niet bevriest. Voeg 10 milliliters koud ethanol toe. Sluit de buis af en keer deze om om te mengen.Let direct volgen op de verschijning van een DNA-ghost, dat bestaat uit een dun, draadachtig neerslag. Keer de buis voorzichtig om om verder te mengen en ervoor te zorgen dat de kleverige DNA-neerslagen samenklonteren. Gebruik ten slotte een glazen haakje om de DNA-ghosts er voorzichtig uit te vissen en dep het DNA vervolgens met een Kimwipe om overtollige vloeistof te verwijderen.Plaats vervolgens de punt van de haak naar beneden in een 1,5 milliliter buis. Om de DNA-opbrengst te maximaliseren, wordt de glazen haak in de 1,5 milliliter buis afgebroken, zodat de resuspensie van de glasfragmenten in de loop van de tijd kan doorgaan. Laat het drogen en voeg 0,25 tot 0,5 milliliter TE toe om het DNA-ghost op te lossen.Laat de resuspensie van het DNA minstens één uur doorgaan en bewaar het DNA bij vier graden Celsius. Viraal DNA werd geprepareerd uit nucleocapsiden zoals beschreven in dit video-artikel; hier wordt een representatief voorbeeld getoond van een goed gevormd en overvloedig DNA-ghost, bestaande uit lineair viraal genomisch DNA dat in oplossing is neergeslagen. De strengen klonteren samen en hebben tijd nodig om te rehydrateren zodra ze in een Acquia-oplossing worden geplaatst. Geprepareerd viraal DNA van PRV-stammen, Becker Bartha en vier aanvullende stammen werd één uur lang gescheiden op een 0,5% agarosegel en gekleurd met ethidiumbromide.Elk PRV-monster bevat één microliter van een virale DNA-nucleocapside-preparatie, met een totaal volume van 250 microliters links. Een ladder van lambda-bacteriofagen-DNA waarvan één is gedigesteerd, demonstreert de grote omvang van ongedigisteerd lambda-DNA (48,5 KILOBASE paren) en PRV-genomisch DNA (ongeveer 140 kilobase paren).Vervolgens toont een verdunningsreeks van bekende hoeveelheden Lambda DNA aan dat de concentratie van de PRV-monsters aan de rechterzijde varieert van 50 tot 200 nanogram per microliter, voor een totale opbrengst van 12 tot 50 microgram per viraal DNA-preparaat. De bereide virale DNA-monsters van vier PRV-stammen werden gedurende de nacht gedigereerd met BAM H1 of KPN1. De gedigereerde DNA-monsters werden gescheiden door middel van overnacht elektforese op een 0,8% agarosegel en gekleurd met ethidiumbromide.De H1-banen bevatten acht microgram viraal nucleocapsid-DNA, terwijl de KPN1-banen vier microgram viraal DNA bevatten. Verschillende PRV-stammen kunnen worden onderscheiden aan de hand van hun respectievelijke restrictiefragmentlengtepolymorfisme-patronen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals deep sequencing, worden uitgevoerd om gegevens over de inhoud van het virale genoom te verkrijgen. Na de ontwikkeling van deze techniek kregen onderzoekers in het veld van de virologie de mogelijkheid om viraal DNA te karakteriseren via restrictiefragmentlengtepolymorfismen of RFLP's, Southern blotting, recombinant kloneren, constructie van DNA-virussen en andere manipulaties van herpesvirussen en andere typen virussen.Vergeet niet dat werken met fon extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het werken in een zuurkast, altijd moeten worden getroffen tijdens het uitvoeren van deze procedure. Na het pelleten kan de fon-laag snel veranderen van een gelatineuze semi-solide naar een vloeistof; daarom moet elke buis individueel worden beoordeeld voordat wordt beslist of overgieten of pipetteren de beste methode is om de waterige bovenlaag te verzamelen.

preparation-of-viral-dna-from-nucleocapsids

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een eenvoudige, efficiënte en robuuste manier om de levering van meerdere virale componenten synchroniseren met plantencellen...

Eenvoudige en robuuste In vivo En In vitro Aanpak voor het bestuderen van Virus Vergadering

Single Virus Genomics (SVG) is een methode om te isoleren en versterken de genomen van enkele vironen. Virale suspensies van een gemengde assemblage worden naargelang het gebruik van flowcytometrie op een objectglaasje met discrete putjes die agarose, waardoor het vastleggen van het virion en het verminderen van het genoom afschuiving bij opwerking. Whole genome amplificatie wordt bereikt door verschillende verplaatsing amplificatie (MDA) resulterend in genomisch materiaal dat geschikt is voor...

Isolatie en Genoomanalyse van Single Virionen gebruik &#39;Single Virus Genomics&#39;

In this video, we describe a procedure to perform a nano-injection of a positive-sense, single-stranded RNA virus into adult male Drosophila flies and subsequently study the antiviral responses initiated due to the infection. Polymerase chain reaction analysis identifies the upregulation of specific genes in the infected flies that indicate the activation of immune response pathways including RNA interference and JAK/STAT signaling.

Intrathoracic Viral Nano-Injection to Study Host-Virus Interactions in Adult Flies

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het creëren van een infectieus bacterieel kunstchromosoom dat een volledige cDNA bevat van de positieve-streng genomische RNA van het Japanse encefalitisvirus. Dit protocol kan worden gebruikt om een functionele cDNA van andere positieve-streng RNA-virussen te construeren, waardoor het een krachtig genomisch hulpmiddel wordt voor het bestuderen van virusbiologie.

Bacteriële kunstmatige chromosomen: Een Functional Genomics Tool voor de Studie van Positive-streng RNA-virussen

We bieden een nieuwe strategie om virale replicatiecompartimenten (RC) te isoleren van adenovirus (Ad)-geïnfecteerde menselijke cellen. Deze aanpak vertegenwoordigt een celvrij systeem dat kan helpen om de moleculaire mechanismen die virale genoomreplicatie en -expressie reguleren, evenals de regulatie van virale-gastheerinteracties die in het RC worden gevestigd, te verduidelijken.

Isolatie van virale replicatie compartiment verrijkt Sub-nucleaire fracties uit adenovirus-geïnfecteerde normale menselijke cellen

De demontage van influenza A-viruskernen tijdens het binnendringen van het virus in gastheercellen is een proces in meerdere stappen. We beschrijven een in vitro methode om de vroege stadia van virale uncoating te analyseren. In deze benadering wordt snelheidsgradientcentrifugering gebruikt om de stappen die het begin van uncoating initiëren onder gedefinieerde omstandigheden biochemisch te ontleden.

In Vitro Demontage van influenza A-virus capsiden door gradiëntcentrifugatie

Hier presenteren we een protocol voor het synthetiseren van virusachtige deeltjes met behulp van baculovirus of zoogdierlijke expressiesystemen en ultracentrifugatie zuivering. Deze zeer flexibele aanpak wordt gebruikt om virale antigenen vaccin taakstellingen op veilige en soepele wijze.

Expressie en zuivering van virusachtige deeltjes voor vaccinatie

Dit protocol beschrijft een snelle en breed toepasbare methode voor onbevooroordeelde RNA-sequencing van virale monsters van humane klinische isolaten.

Onpartijdige Deep Sequencing van RNA-virussen uit klinische monsters

Het doel van dit protocol is te specifiek tag en selectief isoleren viraal DNA van geïnfecteerde cellen voor de karakterisatie van het virale genoom geassocieerde eiwitten.

Zuivering van viraal DNA voor de identificatie van geassocieerde virale en cellulaire eiwitten

Hier presenteren we een nieuwe aanpak om te identificeren plantenvirussen met dubbele streng DNA genomen. Wij gebruiken standaard methoden uittreksel DNA en RNA van besmette bladeren en uitvoeren van de volgende generatie sequencing. Bioinformatic hulpmiddelen assembleren sequenties in contigs, identificeren van contigs vertegenwoordigen virus genomen en genomen aan taxonomische groepen toewijzen.

Het combineren van de analyse van DNA in een ruwe Virion extractie met de analyse van RNA van besmette bladeren om te ontdekken van nieuwe Virus Genomes

Voor een diepgaande mechanistische analyse van de RNA-synthese van het respiratoire syncytiële virus (RSV) rapporteren we een protocol voor het gebruik van de chaperonnefofoproteïne (P) voor coexpressie van het RNA-vrije nucleoproteïne (N0) voor de daaropvolgende in vitro assemblage van de virusspecifieke nucleocapsiden (NCs).

Generatie en assemblage van virusspecifieke nucleocapsiden van het respiratoire syncytiële virus

Leer hoe je hoogzuivere herpesvirus-nucleocapside-DNA isoleert uit geïnfecteerde cellen met behulp van ultracentrifugatie en fenol-chloroformextractie. Deze methode levert DNA van hoge concentratie en zuiverheid.

De voorbereiding van Virale DNA van nucleocapsiden

Meer video's verkennen